Name: Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la différenciation des cardiomyocytes auriculaires à partir de cellules souches pluripotentes en utilisant l'antagoniste BMP Grem2. Cette méthode produit des populations homogènes pour étudier les arythmies cardiaques.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL083958 et HL100398 (AKH) et 2T32HL007411-33 &quot;Programme en cardiovasculaires Mécanismes: Formation en Investigation&quot; (JB).

<ol><li>Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of pluripotent stem cells.</a> Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).</li>
<li>Narazaki, G., Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+and+systematic+differentiation+of+cardiovascular+cells+from+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Pak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation%3A+progress%2C+opportunities%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).</li>
<li>Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+Into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Burridge, P. W., Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).</li>
<li>Cai, C. L., Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+cardiac+progenitor+population+that+proliferates+prior+to+differentiation+and+contributes+a+majority+of+cells+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart.</a> Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).</li>
<li>Fujiwara, M., Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+enhancement+of+cardiac+cell+differentiation+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+Cyclosporin-A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).</li>
<li>Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+antagonism+by+Dkk1+counter+activates+canonical+wnt+signaling+and+promotes+cardiomyocyte+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Lian, X., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+promotes+differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+atrial+fate+by+activation+of+the+JNK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway.</a> Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Müller, I. I., Melville, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+in+zebrafish+demonstrates+that+the+atrial-fibrillation-associated+gene+GREM2+regulates+cardiac+laterality%2C+cardiomyocyte+differentiation+and+atrial+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).</li>
<li>Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+protein+related+to+DAN+and+cerberus+%28PRDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC).</a> Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).</li>
<li>Schulz, H., Kolde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FunGenES+Database%3A+A+genomics+resource+for+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).</li>
<li>Phosphate-buffered saline (PBS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+Real-Time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+expression+of+the+glial+scar+component+phosphacan+in+astrocytes+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke.</a> American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).</li>
<li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).</li>
<li>Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6pfl%2C+G+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , 254-279 (2004).</li>
<li>Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAntonchuk%2C+J+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs de ce manuscrit n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole produit régulièrement des cultures avec un pourcentage élevé de CMs qui sont caractéristiques de la lignée auriculaire. Comme avec n&#39;importe quel protocole de différenciation, la qualité des mESCs avant la différenciation méritent une attention particulière. mESCs doivent être surveillés régulièrement pour la morphologie correcte (figure 1A). Toute différenciation spontanée qui se produit avant la formation de EbS limiter sévèrement l&#39;efficacité des cardiogenèse et doit être enlevé ...

Les cellules souches pluripotentes sont un outil puissant pour générer et étudier les cellules à partir d&#39; une multitude de tissus difficiles à l&#39;accès à des études de recherche et pré-cliniques de base, en particulier chez les humains 1-5. la modulation appropriée des voies de signalisation de développement peut diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes au sort phénotypique souhaitée. De nombreux protocoles ont été développés pour générer des cardiomyocytes (SGC) à partir de cellules souches pluripotentes 6-14. Ces protocoles comportent généralement une modulation de la superfamille TFGβ (activine, BMP et TGF) et les voies Wnt par addition temporisée de facteurs de croissance exogènes et / ou des petites molécules 10,12-15. Ces protocoles sont généralement efficaces pour augmenter le pourcentage de cellules qui deviennent CMme, mais manquent de spécificité, la génération d&#39;une population mixte de cellules de lignées représentant auriculaire, ventriculaire et nodal du système / de conduction. Afin d&#39;étudier cardiaque spécifique sous-types d&#39;un appro de différenciation plus orientéeach est nécessaire. Gremlin2 (Grem2, également appelée protéine apparentée à Dan et Cerberus ou PRDC pour faire court) est un antagoniste BMP sécrétée qui est nécessaire pour la différenciation cardiaque adéquate et la formation de chambre auriculaire au cours du développement cardiaque chez le poisson zèbre 16. Le traitement de différenciation des cellules souches embryonnaires avec Grem2 à la différenciation jour 4, juste après expression pic de marqueurs mésodermiques T-brachyury et Cerberus comme 1, augmente le rendement de la CMS et génère un pool de cellules principalement de la lignée auriculaire 14. Grem2 recombinant est utilisé pour traiter les cellules différenciées et peut être effectuée en utilisant des techniques 17 de production de protéines standard ou peuvent être achetés dans le commerce. Il est très soluble dans les solutions aqueuses et peut être ajoutée de manière exogène à la culture au point de temps souhaité. Différenciation peut être suivi par RT-qPCR pour quantifier l&#39;expression des marqueurs représentantdes progéniteurs cardiovasculaires, progéniteurs cardiaques, et engagés Cms. Immunofluorescence peut également être utilisée pour identifier et visualiser la répartition spatiale des types de cellules cardiaques. Les applications qui requièrent des populations pures sont plus facilement réalisées en utilisant un système rapporteur pour identifier et isoler Cms. A cet effet, nous avons introduit la αMHC-DsRedNuc construire dans la lignée de cellules de souris CGR8 ES 14. Cellules CGR8 grandissent et restent pluripotentes sans cellules nourricières, ce qui facilite l&#39; expansion et la différenciation des essais 18. La lignée cellulaire ES contient une protéine fluorescente DsRed séquence codante avec un signal de localisation nucléaire sous l&#39;alpha cardiaque spécifique chaîne myosine lourd (a Mhc ou Myh6) promoteur du gène. L&#39;utilisation de ces cellules, CMs peut être facilement identifié et isolé pour la quantification, le tri cellulaire, électrophysiologie, écrans de drogue, et les mécanismes de différenciation auriculaire étudier.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&szlig ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plaques de culture tissulaire</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîtes de Pétri bactériennes</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Boîtes de Pétri bactériennes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire 6 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 protéine recombinante</td><td>R& ampère; D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration stériles</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine (à partir de peau de porc)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Stérile</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA solution</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes utilisation de la bmp antagonist grem2

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Les protocoles pour produire des populations de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes ont été développés, mais ceux-ci donnent généralement des cellules de phénotypes mixtes. Les chercheurs intéressés à poursuivre des études impliquant des sous-types de myocytes spécifiques nécessitent une approche de différenciation plus dirigée. Par traitement de souris souches embryonnaires (ES) avec des cellules Grem2, un antagoniste de BMP sécrétées qui est nécessaire pour la formation de la chambre auriculaire in vivo, un grand nombre de cellules cardiaques avec un phénotype auriculaire peut être généré. L&#39;utilisation de la lignée de cellules souches conçu Myh6-DsRed-NUC pluripotentes permet l&#39;identification, la sélection et la purification des cardiomyocytes. Dans ce protocole corps embryoïdes sont générés à partir de cellules Myh6-DsRed-NUC selon la méthode de goutte suspendue et maintenues en suspension jusqu&#39;à ce jour de différenciation 4 (d4). A cellules d4 sont traités avec Grem2 et étalées sur des plaques de gélatine revêtues. Entre d8-d10 grandes surfaces contractantes sont observées dans les cultures et continuent de se développer et mature par d14. Moléculaire, des analyses histologiques et electrophysiogical indiquent les cellules dans les cellules Grem2 traitées acquièrent des caractéristiques atriaux comme fournissant un modèle in vitro pour étudier la biologie des cardiomyocytes auriculaires et leur réponse à divers agents pharmacologiques.

Avant la différenciation, les cellules souches pluripotentes doivent être compact et sans différenciation spontanée. Les cellules représentées sur la figure 1A sont prêts à être utilisés singularisé et pour accrocher des gouttes , comme décrit dans la section 5.1 du protocole. Les cellules représentées sur la figure 1B sont spontanément différenciation et ne doivent pas être utilisés pour la préparation des gouttes suspendues. <p class="jove_content"...

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques. Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

L’objectif global de ce protocole de différenciation est de générer des populations homogènes de cardiomyocytes auriculaires en culture. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans l’étude du développement cardiaque et des maladies cardiaques telles que l’arythmie auriculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle produit des cultures homogènes de cardiomyocytes auriculaires in vitro et qu’elle peut être réalisée avec un minimum de formation.Jusqu’à quatre jours avant la mise en place des cultures de cellules souches embryonnaires de souris, ou CSEm, codez des boîtes de tissus de 10 centimètres avec 5 millilitres de solution de gélatine à 0,2 % chacune, dans des plaques à six puits avec 1 millilitre de gélatine par puits dans une hotte de culture de tissus stérilisée. Le jour de la culture, retirez la solution de gélatine supplémentaire et ajoutez 10 millilitres de milieu dans l’une des boîtes de 10 centimètres enrobées de gélatine. Ensuite, utilisez des cryopinces pour faire tourner doucement un flacon de 1 fois 10 à 6 mESC dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit cristal de glace au centre du flacon.Séchez le flacon avec une lingette jetable non pelucheuse et stérilisez-le avec de l’éthanol à 70 %. Placez ensuite le flacon dans le capot de culture tissulaire et utilisez une pipette P1000 pour ajouter les ESC dans la boîte. Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, et déplacez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules.À la fin de l’incubation, utilisez un microscope à fond clair pour confirmer la fixation de la cellule. Des débris et des cellules mortes seront observés. Remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu mESC frais et remettez les cellules dans l’incubateur.Lorsque la culture est confluente à 60 à 70 %, rincez la plaque avec 5 millilitres de DPBS stérile sans magnésium ni calcium, et incubez les cellules dans 2 millilitres de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant que les cellules sont en incubation, aspirez l’excès de solution de gélatine d’une nouvelle boîte de 10 centimètres par culture passée et ajoutez 10 millilitres de milieu dans chaque plaque. Ensuite, collectez les cellules détachées par centrifugation dans un tube de 15 millilitres et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu mESC.En fonction du rapport de division souhaité, ajoutez 0,5 à 1 millilitre de suspension cellulaire dans chaque boîte de 10 centimètres et remettez les cellules dans l’incubateur, en répartissant doucement les cellules dans chaque boîte comme nous venons de le démontrer. Lorsque les cellules traversées sont confluentes à 70 %, détachez-les avec de la trypsine EDTA comme cela vient d’être démontré, puis remettez en suspension la suspension unicellulaire dans 5 millilitres de corps embryoïde ou de milieu EB. Comptez les CSEm, puis diluez-les dans le volume approprié de milieu EB jusqu’à une concentration finale de 2,5 fois 10 puissance 3 cellules par millilitre.Ensuite, ajoutez 2 millilitres de PBS au fond d’une boîte de Pétri bactérienne stérile de 10 centimètres par culture de gouttes suspendues, et transférez la suspension EB dans un bassin de solution stérile. Maintenant, retirez le couvercle de l’un des plats préparés et utilisez une pipette multicanaux, équipée de six pointes, pour déposer soigneusement 60 gouttes de 20 microlitres de suspension EB sur la surface intérieure. Remettez délicatement le couvercle sur le plat, en prenant soin de ne pas déloger les gouttes suspendues et placez les plats dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux jours.Pour laver l’EB, retirez délicatement le couvercle de la culture de gouttes suspendues et inclinez-le à un angle de 45 degrés. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 5 millilitres contenant un milieu EB à température ambiante, lavez doucement les EB dans une flaque au fond du couvercle. Inspectez soigneusement le couvercle pour voir s’il n’y a pas d’EB collés à la surface, puis transférez les EB dans une boîte de Pétri non enrobée de 6 centimètres.Retournez les EB dans l’incubateur de culture tissulaire pendant deux jours supplémentaires, en vérifiant quotidiennement les plaques pour l’agrégation et la fixation des EB. Avant de plaquer les EB, remplacez l’excès de solution d’enrobage de gélatine dans chaque puits de la plaque à six puits préparée, par 2 millilitres de milieu de traitement Grem2 fraîchement préparé, à température ambiante. Ensuite, utilisez une pipette P1000 réglée à 100 microlitres pour transférer 30 EB dans chaque puits, puis remettez la plaque dans l’incubateur pendant la nuit, en dispersant uniformément les cellules avec un mouvement doux comme démontré.Une fois que les EB se sont fixés au fond des puits, remplacez le milieu Grem2 tous les deux jours jusqu’au jour 10. Ensuite, nourrissez les cellules avec un milieu EB frais tous les deux jours pour maintenir une culture cellulaire saine. Avant leur culture de gouttes suspendues, les cellules souches pluripotentes doivent être compactes et exemptes de différenciation spontanée.Si une différenciation spontanée est observée, les cellules ne doivent pas être utilisées dans les cultures de gouttes suspendues. L’EB de qualité est généralement mieux formé dans des gouttes suspendues uniformément espacées et bien arrondies. Au deuxième jour de différenciation, les EB devraient être visibles à l’œil nu, sous forme d’arrangements sphériques de cellules souches différenciatrices aux extrémités des gouttes suspendues.Au quatrième jour, les EB bien formés doivent flotter librement et être homogènes en taille et en forme. Une fois en plaques, les EB s’aplatissent à mesure que les cellules migrent de l’EB vers la surface de la plaque de culture tissulaire, comme observé ici aux jours huit et 10 de la différenciation. Dans les puits témoins non traités, de petites plaques à contraction lente sont observées dès le sixième jour et aussi tard que le neuvième jour.Dans les puits traités par Grem2, il est courant de grandes plaques avec un taux de contraction relativement rapide. L’analyse RT-QPCR de l’expression génique dans les cellules différenciées révèle généralement des niveaux élevés de gènes structurels et régulateurs cardiaques dans les cultures traitées par Grem2. Si la lignée cellulaire nucléosique alpha-CMH DsRed est utilisée, l’augmentation du rendement des cardiomyocytes est observée sous la forme d’un nombre plus élevé de noyaux marqués par DsRed dans les puits traités par Grem2.Le traitement par Grem2 biaise également la différenciation vers un phénotype de type auriculaire, comme le confirment les mesures RT-QPCR et patch clamp de la durée potentielle d’action cellulaire. Une fois maîtrisées, les cellules souches différenciatrices peuvent être traitées avec Grem2 en aussi peu que 60 minutes et les cellules perlantes sont généralement observées dès le septième jour. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajouter régulièrement Grem2 au quatrième jour après le pic d’expression des marqueurs de gastrulation tels que la brachyurie.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’électrophysiologie et la QPCR peuvent être effectuées pour comprendre les caractéristiques fonctionnelles et moléculaires des cellules qui ont été générées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cardiomyocytes auriculaires à partir d’ESC de souris, à l’aide de Grem2.

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JoVE Journal

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