Name: Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la différenciation des cardiomyocytes auriculaires à partir de cellules souches pluripotentes en utilisant l'antagoniste BMP Grem2. Cette méthode produit des populations homogènes pour étudier les arythmies cardiaques.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL083958 et HL100398 (AKH) et 2T32HL007411-33 &quot;Programme en cardiovasculaires Mécanismes: Formation en Investigation&quot; (JB).

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Les auteurs de ce manuscrit n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole produit régulièrement des cultures avec un pourcentage élevé de CMs qui sont caractéristiques de la lignée auriculaire. Comme avec n&#39;importe quel protocole de différenciation, la qualité des mESCs avant la différenciation méritent une attention particulière. mESCs doivent être surveillés régulièrement pour la morphologie correcte (figure 1A). Toute différenciation spontanée qui se produit avant la formation de EbS limiter sévèrement l&#39;efficacité des cardiogenèse et doit être enlevé ...

Les cellules souches pluripotentes sont un outil puissant pour générer et étudier les cellules à partir d&#39; une multitude de tissus difficiles à l&#39;accès à des études de recherche et pré-cliniques de base, en particulier chez les humains 1-5. la modulation appropriée des voies de signalisation de développement peut diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes au sort phénotypique souhaitée. De nombreux protocoles ont été développés pour générer des cardiomyocytes (SGC) à partir de cellules souches pluripotentes 6-14. Ces protocoles comportent généralement une modulation de la superfamille TFGβ (activine, BMP et TGF) et les voies Wnt par addition temporisée de facteurs de croissance exogènes et / ou des petites molécules 10,12-15. Ces protocoles sont généralement efficaces pour augmenter le pourcentage de cellules qui deviennent CMme, mais manquent de spécificité, la génération d&#39;une population mixte de cellules de lignées représentant auriculaire, ventriculaire et nodal du système / de conduction. Afin d&#39;étudier cardiaque spécifique sous-types d&#39;un appro de différenciation plus orientéeach est nécessaire. Gremlin2 (Grem2, également appelée protéine apparentée à Dan et Cerberus ou PRDC pour faire court) est un antagoniste BMP sécrétée qui est nécessaire pour la différenciation cardiaque adéquate et la formation de chambre auriculaire au cours du développement cardiaque chez le poisson zèbre 16. Le traitement de différenciation des cellules souches embryonnaires avec Grem2 à la différenciation jour 4, juste après expression pic de marqueurs mésodermiques T-brachyury et Cerberus comme 1, augmente le rendement de la CMS et génère un pool de cellules principalement de la lignée auriculaire 14. Grem2 recombinant est utilisé pour traiter les cellules différenciées et peut être effectuée en utilisant des techniques 17 de production de protéines standard ou peuvent être achetés dans le commerce. Il est très soluble dans les solutions aqueuses et peut être ajoutée de manière exogène à la culture au point de temps souhaité. Différenciation peut être suivi par RT-qPCR pour quantifier l&#39;expression des marqueurs représentantdes progéniteurs cardiovasculaires, progéniteurs cardiaques, et engagés Cms. Immunofluorescence peut également être utilisée pour identifier et visualiser la répartition spatiale des types de cellules cardiaques. Les applications qui requièrent des populations pures sont plus facilement réalisées en utilisant un système rapporteur pour identifier et isoler Cms. A cet effet, nous avons introduit la αMHC-DsRedNuc construire dans la lignée de cellules de souris CGR8 ES 14. Cellules CGR8 grandissent et restent pluripotentes sans cellules nourricières, ce qui facilite l&#39; expansion et la différenciation des essais 18. La lignée cellulaire ES contient une protéine fluorescente DsRed séquence codante avec un signal de localisation nucléaire sous l&#39;alpha cardiaque spécifique chaîne myosine lourd (a Mhc ou Myh6) promoteur du gène. L&#39;utilisation de ces cellules, CMs peut être facilement identifié et isolé pour la quantification, le tri cellulaire, électrophysiologie, écrans de drogue, et les mécanismes de différenciation auriculaire étudier.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&szlig ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plaques de culture tissulaire</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîtes de Pétri bactériennes</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Boîtes de Pétri bactériennes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire 6 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 protéine recombinante</td><td>R& ampère; D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration stériles</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine (à partir de peau de porc)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Stérile</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA solution</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes utilisation de la bmp antagonist grem2

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Les protocoles pour produire des populations de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes ont été développés, mais ceux-ci donnent généralement des cellules de phénotypes mixtes. Les chercheurs intéressés à poursuivre des études impliquant des sous-types de myocytes spécifiques nécessitent une approche de différenciation plus dirigée. Par traitement de souris souches embryonnaires (ES) avec des cellules Grem2, un antagoniste de BMP sécrétées qui est nécessaire pour la formation de la chambre auriculaire in vivo, un grand nombre de cellules cardiaques avec un phénotype auriculaire peut être généré. L&#39;utilisation de la lignée de cellules souches conçu Myh6-DsRed-NUC pluripotentes permet l&#39;identification, la sélection et la purification des cardiomyocytes. Dans ce protocole corps embryoïdes sont générés à partir de cellules Myh6-DsRed-NUC selon la méthode de goutte suspendue et maintenues en suspension jusqu&#39;à ce jour de différenciation 4 (d4). A cellules d4 sont traités avec Grem2 et étalées sur des plaques de gélatine revêtues. Entre d8-d10 grandes surfaces contractantes sont observées dans les cultures et continuent de se développer et mature par d14. Moléculaire, des analyses histologiques et electrophysiogical indiquent les cellules dans les cellules Grem2 traitées acquièrent des caractéristiques atriaux comme fournissant un modèle in vitro pour étudier la biologie des cardiomyocytes auriculaires et leur réponse à divers agents pharmacologiques.

Avant la différenciation, les cellules souches pluripotentes doivent être compact et sans différenciation spontanée. Les cellules représentées sur la figure 1A sont prêts à être utilisés singularisé et pour accrocher des gouttes , comme décrit dans la section 5.1 du protocole. Les cellules représentées sur la figure 1B sont spontanément différenciation et ne doivent pas être utilisés pour la préparation des gouttes suspendues. <p class="jove_content"...

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques. Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

L’objectif global de ce protocole de différenciation est de générer des populations homogènes de cardiomyocytes auriculaires en culture. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans l’étude du développement cardiaque et des maladies cardiaques telles que l’arythmie auriculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle produit des cultures homogènes de cardiomyocytes auriculaires in vitro et qu’elle peut être réalisée avec un minimum de formation.Jusqu’à quatre jours avant la mise en place des cultures de cellules souches embryonnaires de souris, ou CSEm, codez des boîtes de tissus de 10 centimètres avec 5 millilitres de solution de gélatine à 0,2 % chacune, dans des plaques à six puits avec 1 millilitre de gélatine par puits dans une hotte de culture de tissus stérilisée. Le jour de la culture, retirez la solution de gélatine supplémentaire et ajoutez 10 millilitres de milieu dans l’une des boîtes de 10 centimètres enrobées de gélatine. Ensuite, utilisez des cryopinces pour faire tourner doucement un flacon de 1 fois 10 à 6 mESC dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit cristal de glace au centre du flacon.Séc

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Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Dans ce protocole, la dérivation de cellules progénitrices cardiaques à partir de cellules souches embryonnaires de souris et d’humains sera illustrée. L’une des principales stratégies de ce protocole consiste à enrichir les cellules progénitrices cardiaques par cytométrie en flux à l’aide de rapporteurs fluorescents intégrés dans les lignées de cellules souches embryonnaires.

Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Ici, nous présentons un protocole de différenciation des cardiomyocytes robuste, rapide et évolutif pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les cardiomyocytes dérivés à l’aide de cette méthode à grande échelle peuvent fournir un nombre suffisant de cellules pour leur utilisation efficace dans la modélisation des maladies cardiovasculaires humaines, le criblage de médicaments à haut débit et potentiellement des applications cliniques.

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Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la génération et la quantification de divers sous-types cardiaques reprogrammés à l’aide d’une administration médiée par un rétrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5.

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

La caractérisation électrophysiologique des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CMH-CM) est cruciale pour la modélisation de la maladie cardiaque et pour la détermination des réponses aux médicaments. Ce protocole fournit les informations nécessaires pour dissocier et plaquer les CMH-CM sur les réseaux multi-électrodes, mesurer leur potentiel de terrain et une méthode pour analyser les intervalles QT et RR.

Analyse électrophysiologique des cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) utilisant des matrices multi-électrodes (MEA)

Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

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Ici nous décrivons et validons une méthode pour générer uniformément les cardiomyocytes pluripotents pluripotents de cellules souches induits par l'homme robustes et caractériser leur fonction. Ces techniques peuvent aider à développer un aperçu mécaniste des voies de signalisation, fournir une plate-forme pour le dépistage à grande échelle des médicaments, et modéliser de façon fiable les maladies cardiaques.

Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium

Cette méthode peut être utilisée pour examiner le raccourcissement des sarcomères à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes avec des protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.

Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient

Découvrez la différenciation des cardiomyocytes auriculaires à partir de cellules souches pluripotentes en utilisant l'antagoniste BMP Grem2. Cette méthode produit des populations homogènes pour étudier les arythmies cardiaques.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

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