Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

L’objectif global de ce protocole de différenciation est de générer des populations homogènes de cardiomyocytes auriculaires en culture. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans l’étude du développement cardiaque et des maladies cardiaques telles que l’arythmie auriculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle produit des cultures homogènes de cardiomyocytes auriculaires in vitro et qu’elle peut être réalisée avec un minimum de formation.

Jusqu’à quatre jours avant la mise en place des cultures de cellules souches embryonnaires de souris, ou CSEm, codez des boîtes de tissus de 10 centimètres avec 5 millilitres de solution de gélatine à 0,2 % chacune, dans des plaques à six puits avec 1 millilitre de gélatine par puits dans une hotte de culture de tissus stérilisée. Le jour de la culture, retirez la solution de gélatine supplémentaire et ajoutez 10 millilitres de milieu dans l’une des boîtes de 10 centimètres enrobées de gélatine. Ensuite, utilisez des cryopinces pour faire tourner doucement un flacon de 1 fois 10 à 6 mESC dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit cristal de glace au centre du flacon.

Séchez le flacon avec une lingette jetable non pelucheuse et stérilisez-le avec de l’éthanol à 70 %. Placez ensuite le flacon dans le capot de culture tissulaire et utilisez une pipette P1000 pour ajouter les ESC dans la boîte. Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, et déplacez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules.

À la fin de l’incubation, utilisez un microscope à fond clair pour confirmer la fixation de la cellule. Des débris et des cellules mortes seront observés. Remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu mESC frais et remettez les cellules dans l’incubateur.

Lorsque la culture est confluente à 60 à 70 %, rincez la plaque avec 5 millilitres de DPBS stérile sans magnésium ni calcium, et incubez les cellules dans 2 millilitres de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant que les cellules sont en incubation, aspirez l’excès de solution de gélatine d’une nouvelle boîte de 10 centimètres par culture passée et ajoutez 10 millilitres de milieu dans chaque plaque. Ensuite, collectez les cellules détachées par centrifugation dans un tube de 15 millilitres et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu mESC.

En fonction du rapport de division souhaité, ajoutez 0,5 à 1 millilitre de suspension cellulaire dans chaque boîte de 10 centimètres et remettez les cellules dans l’incubateur, en répartissant doucement les cellules dans chaque boîte comme nous venons de le démontrer. Lorsque les cellules traversées sont confluentes à 70 %, détachez-les avec de la trypsine EDTA comme cela vient d’être démontré, puis remettez en suspension la suspension unicellulaire dans 5 millilitres de corps embryoïde ou de milieu EB. Comptez les CSEm, puis diluez-les dans le volume approprié de milieu EB jusqu’à une concentration finale de 2,5 fois 10 puissance 3 cellules par millilitre.

Ensuite, ajoutez 2 millilitres de PBS au fond d’une boîte de Pétri bactérienne stérile de 10 centimètres par culture de gouttes suspendues, et transférez la suspension EB dans un bassin de solution stérile. Maintenant, retirez le couvercle de l’un des plats préparés et utilisez une pipette multicanaux, équipée de six pointes, pour déposer soigneusement 60 gouttes de 20 microlitres de suspension EB sur la surface intérieure. Remettez délicatement le couvercle sur le plat, en prenant soin de ne pas déloger les gouttes suspendues et placez les plats dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux jours.

Pour laver l’EB, retirez délicatement le couvercle de la culture de gouttes suspendues et inclinez-le à un angle de 45 degrés. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 5 millilitres contenant un milieu EB à température ambiante, lavez doucement les EB dans une flaque au fond du couvercle. Inspectez soigneusement le couvercle pour voir s’il n’y a pas d’EB collés à la surface, puis transférez les EB dans une boîte de Pétri non enrobée de 6 centimètres.

Retournez les EB dans l’incubateur de culture tissulaire pendant deux jours supplémentaires, en vérifiant quotidiennement les plaques pour l’agrégation et la fixation des EB. Avant de plaquer les EB, remplacez l’excès de solution d’enrobage de gélatine dans chaque puits de la plaque à six puits préparée, par 2 millilitres de milieu de traitement Grem2 fraîchement préparé, à température ambiante. Ensuite, utilisez une pipette P1000 réglée à 100 microlitres pour transférer 30 EB dans chaque puits, puis remettez la plaque dans l’incubateur pendant la nuit, en dispersant uniformément les cellules avec un mouvement doux comme démontré.

Une fois que les EB se sont fixés au fond des puits, remplacez le milieu Grem2 tous les deux jours jusqu’au jour 10. Ensuite, nourrissez les cellules avec un milieu EB frais tous les deux jours pour maintenir une culture cellulaire saine. Avant leur culture de gouttes suspendues, les cellules souches pluripotentes doivent être compactes et exemptes de différenciation spontanée.

Si une différenciation spontanée est observée, les cellules ne doivent pas être utilisées dans les cultures de gouttes suspendues. L’EB de qualité est généralement mieux formé dans des gouttes suspendues uniformément espacées et bien arrondies. Au deuxième jour de différenciation, les EB devraient être visibles à l’œil nu, sous forme d’arrangements sphériques de cellules souches différenciatrices aux extrémités des gouttes suspendues.

Au quatrième jour, les EB bien formés doivent flotter librement et être homogènes en taille et en forme. Une fois en plaques, les EB s’aplatissent à mesure que les cellules migrent de l’EB vers la surface de la plaque de culture tissulaire, comme observé ici aux jours huit et 10 de la différenciation. Dans les puits témoins non traités, de petites plaques à contraction lente sont observées dès le sixième jour et aussi tard que le neuvième jour.

Dans les puits traités par Grem2, il est courant de grandes plaques avec un taux de contraction relativement rapide. L’analyse RT-QPCR de l’expression génique dans les cellules différenciées révèle généralement des niveaux élevés de gènes structurels et régulateurs cardiaques dans les cultures traitées par Grem2. Si la lignée cellulaire nucléosique alpha-CMH DsRed est utilisée, l’augmentation du rendement des cardiomyocytes est observée sous la forme d’un nombre plus élevé de noyaux marqués par DsRed dans les puits traités par Grem2.

Le traitement par Grem2 biaise également la différenciation vers un phénotype de type auriculaire, comme le confirment les mesures RT-QPCR et patch clamp de la durée potentielle d’action cellulaire. Une fois maîtrisées, les cellules souches différenciatrices peuvent être traitées avec Grem2 en aussi peu que 60 minutes et les cellules perlantes sont généralement observées dès le septième jour. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajouter régulièrement Grem2 au quatrième jour après le pic d’expression des marqueurs de gastrulation tels que la brachyurie.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’électrophysiologie et la QPCR peuvent être effectuées pour comprendre les caractéristiques fonctionnelles et moléculaires des cellules qui ont été générées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cardiomyocytes auriculaires à partir d’ESC de souris, à l’aide de Grem2.