Name: En utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Découvrez une technique de plastification pour la microscopie confocale de la sclérotique humaine. Cette méthode permet d'étudier la distribution des cellules immunitaires et le statut vasculaire dans les conditions saines et pathologiques.

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Fondation allemande pour la recherche (FOR2240 « Angiogenèse (lymphatique) et immunité cellulaire dans les maladies inflammatoires de l’œil » à CC et LMH ; HE 6743/2-1 et HE 7643/3-1 à LMH ; CU47/6-1 à CC), l’Aide allemande contre le cancer (à LMH et CC), le programme GEROK de l’Université de Cologne (à SLS et LMH), et l’UE COST BM1302 « Unir nos forces pour la régénération cornéenne » (à CC).

L&#39;utilisation de tissus humains doit être examiné et approuvé par un comité d&#39;examen institutionnel ou l&#39;équivalent. Le travail décrit ici a été approuvé par le comité d&#39;éthique local et a eu l&#39;approbation de l&#39;examen scientifique. Ce travail a été effectué conformément à la Déclaration d&#39;Helsinki. Les spécimens scléral humains ont été obtenus à partir des yeux des donneurs de globe (post-mortem durée maximale de 24 heures) à la Banque des yeux du Département d&#39;Ophtalmologie, Université de Cologne, en Allemagne. 1. Préparation expérimentale <ol><li> Préparer éthanol à 96% et du tampon phosphate salin (PBS) dans des tubes différents. Préparer les anticorps primaires de la dilution recommandée de PBS contenant 2% de sérum albumine bovine (BSA) et de garder toutes les solutions sur la glace. Préparer 100 pi par échantillon. </li><li> Nettoyez tous les instruments et utiliser des scalpels tranchants. Après répétées de coupe avec le même scalpel, changer le scalpel. </li><li> Obtenir 1-2 pince colibri, ciseaux micro dissection droites, un scalpel # 10ou d&#39;un scalpel ophtalmique micro plume, et quatre 26 G aiguilles. </li><li> Envelopper de papier d&#39;aluminium autour d&#39;une plaque de polystyrène ou utiliser une plaque de liège pour fixer le tissu. Travailler sous un microscope stéréo binoculaire. Travailler stérile sous un flux d&#39;air laminaire si nécessaire. </li></ol> 2. Préparer le Sclera <ol><li> Tenir délicatement le bulbe et effectuer une trépanation perforant sur la partie cornéo, puis tourner le trépan. Faites tourner le trépan soigneusement et uniformément sur la surface pour réaliser une coupe aussi ronde. Utilisez un trépan de taille de 15,5 mm. Couper les pièces jointes restantes avec des ciseaux courbes. Retirez la trépanation cornéo. Cela se traduira par une ampoule antérieurement ouverte. <ol><li> Mettez la sclérotique sur un coton-tige avec la partie ouverte vers le haut. Retirer la rétine et uvée, en utilisant une pince colibri pour retirer les deux couches (rétine et uvée) de la sclérotique. Ne laissez pas l&#39;uvée pigmentée sur la sclérotique intérieure. Utilisez des ciseaux courbes pour enlever la rétine et uvée de la papille. Retirez le remaining conjonctives, des muscles extra-oculaires et la capsule de Tenon de la sclère superficielle. </li></ol></li><li> Retirer l&#39;échantillon scléral dans la taille requise à l&#39;aide de ciseaux de type droite et la pince colibri. Prenez environ 2 cm 2 échantillons scléral taille de différents endroits. En raison de la petite taille, maintenez la sclérotique délicatement et découper la taille requise sous forme de carrés en utilisant les ciseaux de type droit. La trépanation cornéo définit la marge antérieure des échantillons scléral. <ol><li> Évitez répété saisissant avec la pince que la zone où le tissu a été saisi ne convient pas pour les analyses de microscopie confocale. Préparer le nombre d&#39;échantillons requis en fonction du type d&#39;expérience (par exemple par rapport à en avant en arrière, comparer la figure 1) et la quantité d&#39;anticorps utilisée. </li></ol></li><li> Mettre les échantillons dans des tubes de 1,5 ml pour une utilisation ultérieure. Fixer les échantillons dans 1,5 ml d&#39;éthanol à 96% pendant 15 min, puis les laver trois fois chacun pendant 5 mindans 1,5 ml de PBS sur l&#39;agitateur. Si vous travaillez avec le tissu congelé, effectuer cette étape avant pression de congélation. </li><li> Utilisez des tissus frais. Toutefois, si cela est impossible, snap geler la sclérotique dans de l&#39;azote liquide et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Si vous travaillez avec le tissu congelé, décongeler avant utilisation. Éviter la décongélation répétée et cycles de congélation. </li><li> Maintenir chaque échantillon dans du PBS contenant 1,5 ml de BSA à 5% à température ambiante pendant 2 heures. Cette étape provoque un gonflement de l&#39;échantillon qui est utile pour la stratification et empêche également la liaison non spécifique. </li><li> Après les échantillons ont gonflé, préparer les carrés scléral pour la lamination. Travailler sous un microscope, par exemple un microscope stéréo binoculaire. Apposer les échantillons sclérales postérieures à la membrane de polystyrène enveloppé dans une feuille d&#39;aluminium ou de la plaque de liège en utilisant les 26 G aiguilles. </li><li> Plier les bords des aiguilles afin qu&#39;elles ne gênent pas le champ visuel sous le microscope. </li><li> Laminé la samp scléral pleine épaisseurles. <ol><li> Tout d&#39;abord, maintenir le bord scléral antérieur en utilisant une pince colibri. Ensuite, couper soigneusement une fine couche de la sclérotique superficielle en utilisant le scalpel # 10, le scalpel ophtalmique micro plume, ou une lame de spatule. Tenir le scalpel horizontalement et couper la couche superficielle aussi finement que possible à partir de la couche sous-jacente. </li><li> Disséquer une couche mince scléral de la place scléral. Cette méthode est comparable à des techniques chirurgicales standard pour préparer un rabat pendant trabéculectomie et devraient se traduire par des couches épaisses de 30-80 um (comparer Figure 2). </li></ol></li><li> Empêcher le séchage de la sclérotique en ajoutant de petites quantités de PBS au tissu, par exemple 50 ul de PBS à l&#39; aide d&#39; une pipette. </li><li> Mettez les couches coupées dans 100 pi de PBS dans la plaque de 96 puits et étiqueter tant l&#39;orientation (vers extern et stagiaire) et la couche (superficielle et profonde) , par exemple avec une couleur imperméable à l&#39; eau. </li><li> Répétez les étapes 2,7-2,9 jusqu&#39;à ce que le tissu est entièrement stratifié. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Effectuer immunohistochimie <ol><li> Ajouter 100 ul des anticorps primaires nécessaires à la dilution recommandée. Ici, par exemple un CD d&#39;utilisation 31 (anticorps monoclonal de souris anti-humain) et de l&#39; anticorps LYVE1 (lapin anti-humain), à la fois dans une dilution de 1: 100 dans du PBS (contenant 2% de BSA) et incuber à 4 ° C pendant une nuit. Pour changer de support de la plaque de 96 puits, tenir la pipette à la paroi du puits et enlever le liquide. </li><li> Le lendemain, lavez les échantillons trois fois chacun pendant 5 min avec 200-300 pi de PBS sur l&#39;agitateur. Ajouter 100 ul d&#39;anticorps secondaires correspondants; ici utiliser chèvre anti souris isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et de chèvre anti-lapin cyanine 3 (Cy3), et incuber les échantillons à température ambiante pendant 1-2 heures. Diluer les anticorps secondaires de 1: 300 dans du PBS contenant du sérum de chèvre à 2%. </li><li> Rincer à nouveau les échantillons à trois reprises respectivement pendant 5 min dans du PBS 2-300 ul sur l&#39;agitateur. </li><li> Effectuer coloration noyau, par exemple </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilution 1: 2000, 100 pl dans chaque puits et incuber 10 min à température ambiante), puis laver à nouveau 2 fois dans 200-300 ul de PBS sur l&#39;agitateur. </li><li> Transférer les échantillons sur des lames de microscope, incorporez-les dans 1-2 gouttes de milieu de montage fluorescent, ajouter une lamelle, sceller en recouvrant les bords avec un vernis transparent, et conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure ou d&#39;examiner directement les diapositives avec le confocal microscope. </li><li> Utiliser un microscope confocal (ou équivalent) pour analyser les échantillons. Utilisez le grossissement souhaité, par exemple 10-40X grossissement. </li><li> Pour vérifier l&#39;épaisseur des échantillons, mesurer avec la microscopie confocale en utilisant Z-Stacks. La quantité de sections sclérales possibles dépend de l&#39;emplacement de la sclérotique, l&#39;épaisseur diffère equatoriale et vers l&#39;arrière (comparer introduction). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucune divulgation financière. Le contenu de cet article relève de la seule responsabilité des auteurs.

Stratifier la sclérotique humaine est un procédé pour effectuer la microscopie confocale sur ce tissu. Une étape critique dans ce procédé est l&#39;utilisation de l&#39;éthanol au lieu de la formaline pour fixer le tissu. Dans notre expérience, de meilleurs résultats sont obtenus lors de l&#39;utilisation de l&#39;éthanol au lieu de la formaline pour la fixation. scalpels Blunt aggravent la procédure et doivent être évités. De même, l&#39;assèchement de la sclérotique doit être évitée, car elle complique le procédé et r...

La sclérotique est la couche externe rigide qui recouvre l&#39;œil, qui est composé de tissu conjonctif dense. Elle aide à protéger les structures intraoculaires et de maintenir la pression intraoculaire. Ainsi, la sclérotique est essentiel pour une vision claire. Elle est dépourvue de vaisseaux lymphatiques 1,2 et forme ainsi une frontière extérieure libre-lymphatique entre elle et l&#39;œil intérieur libre-lymphatique 3-7. Il fournit également des sites de fixation pour les muscles extraoculaires, partageant ainsi des similitudes anatomiques avec des tendons. Étant donné que la sclérotique est constitué principalement de faisceaux denses de collagène de type I et dispose d&#39;un plus petit nombre de types de collagène III, IV, V, VI, VIII et 8,9 élastine 10,11, ce tissu ne sont pas faciles à utiliser pour l&#39; immunohistochimie. Anatomiquement, la sclérotique peut être séparé en trois couches principales: (1) la épisclère vascularisé superficielle, qui se trouvent au-dessous de la conjonctive et de la capsule de Tenon et vers les côtés et ee arrière de l&#39;œil face à l&#39;orbite; (2) le stroma scléral, la majeure partie de la sclérotique; et (3) l&#39;fusca lamina, qui est une mince couche pigmentée située directement au-dessus du uvée. Notre connaissance de l&#39; anatomie de la sclérotique provient principalement de la première moitié du 20 e siècle. A cette époque, les chercheurs ont étudié l&#39;anatomie de la vascularisation principalement en utilisant l&#39;encre de Chine injections 12 et vasculaires coulée 13-15. Plus tard, il a été étudié dans des études angiographiques 16-19. Depuis ce temps, les techniques anciennes ont été améliorées et de nouveaux ont été développés qui nous ont permis de compléter les connaissances anatomiques précédent. Par exemple, il a été seulement environ une dizaine d&#39; années depuis que nous avons eu de tels marqueurs lymphatiques fiables que l&#39; endothélium vasculaire lymphatique hyaluronane spécifique du récepteur-1 (LYVE1) 20 ou podoplanin 21. La microscopie confocale offre de nouvelles possibilités pour l&#39;étude des caractéristiques anatomiques des différents tiquest de l&#39;œil. Il permet de multiples tâches à être utilisées pour différencier les marqueurs de cellules ou pour la localisation des cellules par rapport aux vaisseaux sanguins et d&#39;autres structures anatomiques. Il donne un aperçu lorsque l&#39;échantillon est d&#39;une taille plus grande et nous permet de numériser à travers un échantillon lorsque la recherche d&#39;un type de cellule spécifique. Avec la technologie Z-Stack, la microscopie confocale peut être utilisé pour des échantillons jusqu&#39;à 100 à 200 um. La sclérotique diffère d&#39;épaisseur comprise entre 0,3 mm derrière les insertions musculaires et 1 mm au niveau du pôle postérieur 11. À la fois en raison de son épaisseur et d&#39;opacité, la sclère ne convient pas pour la microscopie confocale en utilisant des méthodes traditionnelles. Pour remédier à cela, les tissus scléral ont été stratifiées pour permettre leur analyse par microscopie confocale. Cette technologie est utile pour une meilleure compréhension des deux situations physiologiques et pathologiques dans la sclérotique humaine.

<table><tbody><tr><td>Éthanol à 96 %</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Allemagne</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>stéréomicroscope binoculaire</td>.<td>Motic, Hongkong, Chine</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G aiguilles&nbsp ;</td><td>Terumo, Louvain, Belgique</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Allemagne</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&nbsp ;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japon</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>scalpel ophtalmique micro plume&nbsp ;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japon</td><td>n° 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD 31 (souris monoclonale anti-humaine)</td><td>Dako, États-Unis</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps LYVE1&nbsp ; (lapin polyclonal anti humain)</td><td>Zytomed, Allemagne</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti souris FITC anticorps</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti lapin Cy3 anticorps</td><td>Dianova, Allemagne</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Dako, Glostrup, Danemark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope diapositives&nbsp ;</td><td>Engelbrecht, Ederm&uuml ; nde, Allemagne</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de protection 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Allemagne</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage fluorescent DAKO&nbsp ;</td><td>DAKO, États-Unis</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 microscopie confocale&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss AG, Iéna, Allemagne</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

en utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

La sclérotique est un tissu conjonctif dense qui recouvre et protège l&#39;œil. Il se compose principalement de faisceaux de collagène denses (types I, III, IV, V, VI et VII). En raison de sa autofluorescence, l&#39;opacité et l&#39;épaisseur, il n&#39;a pas été jugé approprié pour la microscopie confocale. Une approche alternative à celle présentée ici, qui utilise sclérotique fixés au formol noyé dans de la paraffine pour l&#39;immunohistochimie, présente des difficultés techniques, surtout lorsque le préchauffage du tissu pour l&#39;extraction de l&#39;antigène. Depuis la sclérotique est relativement pauvre dans les deux cellules et les vaisseaux, l&#39;utilisation d&#39;échantillons de tissus plus grands a été explorée pour aider à prévenir les cellules donnant et de comprendre leur localisation par rapport aux navires et d&#39;autres sites anatomiques. Afin de permettre l&#39;analyse d&#39;échantillons de tissus plus importantes au microscope confocal, une technique de stratification a été réalisée pour créer des couches minces à partir de la sclérotique. Suite à l&#39;analyse des résultats des CD31 vaisseaux sanguins et vaisseaux lymphatiques endothéliale hyalurécepteur ronan 1 (LYVE1) cellules positives, dont l&#39;approbation pour examen scientifique a été obtenu, les avantages et les limites de cette méthode sont discutées.

Dans les expériences représentatives effectuées ici, il y a des avantages démontrables découlant de l&#39;utilisation de cette technique de stratification particulière. La première expérience illustre le réseau diversifié de la épiscléral plexus vaisseau sanguin dans trois images représentatives (figure 3). Les vaisseaux sont positifs pour CD31. La deuxième expérience montre des cellules immunitaires, en parti...

Le tissu de la sclérotique humaine est principalement composé de collagène ; par conséquent, il n’est pas facilement utilisable pour l’immunohistochimie. Pour atteindre l’objectif d’effectuer une immunohistochimie pour la microscopie confocale du tissu scléral, une technique de laminage a été utilisée.

En utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

L'objectif général de cette méthodologie est de réaliser une microscopie confocale de la sclère humaine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ophtalmologie, telles que la distribution des cellules immunitaires et l'état vasculaire dans les conditions saines ainsi que pathologiques de la sclère.Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'imagerie confocale des tissus conjonctifs denses. La procédure sera démontrée par Stefan Kremers, étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour commencer, préparez de l'éthanol à 96 % et du PBS dans des tubes séparés.Ensuite, préparez 100 microlitres par échantillon d'anticorps primaires dans la dilution recommandée de PBS contenant deux pour cent de BSA, et maintenez toutes les solutions sur de la glace. Disposez des instruments propres, notamment une à deux paires de forceps Colibri, des ciseaux microchirurgicaux droits, des ciseaux courbes, un scalpel numéro 10 ou un micro-scalpel oculaire Feather, quatre aiguilles de calibre 26 et un coton-tige. Enveloppez une plaque en polystyrène avec du papier d'aluminium, ou préparez une plaque en liège pour fixer le tissu.Après avoir produit une bulle ouverte antérieurement selon le protocole décrit, placez la sclère sur un coton-tige avec la partie ouverte orientée vers le haut. Utilisez ensuite des pinces colibri pour retirer la rétine et les couches uvéales pigmentées de l'intérieur de la sclère jusqu'à ce que la sclère soit débarrassée de ces couches. Ensuite, utilisez des ciseaux courbes si nécessaire pour retirer la rétine et l'uvée de la papille.Ensuite, retirez la conjonctive résiduelle, les muscles extra-ovulaires et la capsule de Tenon de la sclérotique superficielle. À l'aide de pinces colibri, saisissez délicatement le tissu et, avec des ciseaux droits, découpez des échantillons scléraux d'environ deux centimètres carrés à différents endroits du tissu, en évitant de reprendre plusieurs fois le même endroit avec la pince, ce qui rendrait la zone inappropriée pour la microscopie confocale. Placez les échantillons dans des tubes de 1,5 millilitre, ajoutez 1,5 millilitre d'éthanol à 96 % et incubez pendant 15 minutes pour fixer le tissu.Ensuite, après avoir éliminé l'éthanol, utilisez 1,5 millilitre de PBS pour laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun sous agitation. Puis, transférez les échantillons dans 1,5 millilitre de PBS contenant 5 % de BSA, et incubez-les à température ambiante pendant deux heures afin d'induire un gonflement des échantillons, ce qui facilitera la laminage et préviendra les liaisons non spécifiques. Une fois les échantillons gonflés, sous un microscope stéréo-binoculaire, utilisez des aiguilles de calibre 26 dont les extrémités ont été courbées pour fixer les échantillons scléraux postérieurs sur la membrane de polystyrène enrobée de feuille, ou sur une plaque de liège.Ensuite, pour lameller les échantillons en épaisseur totale, utilisez une pince Colibri pour maintenir horizontalement le bord antérieur du tissu scléral. À l’aide d’un scalpel n°10, découpez soigneusement la couche la plus mince possible de la sclère superficielle, en la séparant de la couche sous-jacente. Pour éviter que le tissu ne s’assèche, pipetez 50 micro-litres de PBS sur les couches.Ensuite, après avoir découpé les couches, placez-les dans 100 microlitres de PBS dans une plaque de 96 puits, et utilisez un marqueur imperméable pour indiquer à la fois l'orientation et la couche. Poursuivez l'isolement des couches et leur transfert vers la plaque de 96 puits jusqu'à ce que le tissu soit entièrement laminé. Pour réaliser l'immunohistochimie, retirez le milieu de la plaque de 96 puits en appuyant la pipette contre la paroi de chaque puits et en aspirant le liquide.Ensuite, ajoutez 100 micro-litres des anticorps primaires dilués au 1/100 dans du PBS contenant 2 % de BSA dans les puits appropriés, puis incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain, utilisez 200 à 300 micro-litres de PBS pour laver les échantillons sur un agitateur, trois fois pendant cinq minutes chacun. Si nécessaire, utilisez un autre anticorps primaire et incubez à nouveau toute la nuit à quatre degrés Celsius.Ensuite, ajouter 100 microlitres des anticorps secondaires correspondants, dilués au 1/300 dans du PBS contenant 2 % de sérum de chèvre, et incuber à l'abri de la lumière à température ambiante pendant une à deux heures. Après l'incubation, rincer à nouveau les échantillons avec 200 à 300 microlitres de PBS sur un agitateur, trois fois pendant cinq minutes chacun. Puis ajouter 100 microlitres d'une dilution au 1/2000 de DAPI dans chaque puits et incuber à l'abri de la lumière à température ambiante.Avant d'utiliser de 200 à 300 microlitres de PBS pour laver les échantillons deux fois. Transférez les échantillons sur des lames de microscope sous le microscope stéréo-binoculaire afin de vous assurer que l'échantillon est bien à plat sur la lame, puis ajoutez une à deux gouttes de milieu de montage fluorescent. Placez ensuite une lamelle par-dessus et utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller les bords.Conserver à l’obscurité à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure ou examiner directement par microscopie confocale. Pour vérifier l'épaisseur des échantillons, réaliser des coupes en z, car l'épaisseur varie selon les régions équatoriales et postérieures en fonction de l'emplacement scléral. Ces images montrent le réseau diversifié des plexus vasculaires dans la sclère humaine laminée provenant de l'épisclère antérieure et postérieure.Les vaisseaux sanguins sont positifs pour le CD31, comme indiqué en vert. Sur cette image, les cellules immunitaires positives pour LYVE1 de l'épisclére et leur relation avec les vaisseaux sanguins positifs pour le CD31 sont illustrées. La série de coupes en z a été réalisée à un grossissement de 10x afin d'examiner les relations tridimensionnelles entre les vaisseaux sanguins et les cellules immunitaires.Comme illustré ici, les muscles extraoculaires enfermés dans la sclérotique peuvent également être analysés pour détecter la présence de vaisseaux sanguins ou de cellules immunitaires, en utilisant respectivement les marqueurs CD31 et LYVE1. Une fois maîtrisée, la technique de laminage peut être réalisée en moins d'une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à empêcher le tissu de se dessécher.N'oubliez pas que le travail avec des tissus humains peut présenter un risque infectieux, et que des précautions telles que des diagnostics microbiologiques et virologiques doivent toujours être prises au préalable.

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