En utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine

L’objectif global de cette méthodologie est d’effectuer une microscopie confocale de la sclère humaine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie. Tels que la distribution des cellules immunitaires et l’état vasculaire chez les personnes en bonne santé, et les conditions pathologiques dans la sclérotique.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’imagerie confocale du tissu conjonctif dense. Stefan Kremers, un étudiant diplômé de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez de l’éthanol à 96 % et du PBS dans des tubes individuels.

Préparez ensuite 100 microlitres par échantillon des anticorps primaires dans la dilution recommandée de PBS contenant deux pour cent de BSA, et conservez toutes les solutions sur de la glace. Disposez des instruments propres, y compris une à deux pinces Colibri, des ciseaux de micro-dissection droits, des ciseaux incurvés, un scalpel numéro 10 ou un scalpel ophtalmique en micro-plumes, quatre aiguilles de calibre 26 et un écouvillon. Enroulez du papier d’aluminium autour d’une plaque de polystyrène ou préparez une plaque de liège pour fixer le tissu.

Après avoir produit un bulbe ouvert antérieurement selon le protocole textuel, placez la sclérotique sur un écouvillon avec la partie ouverte vers le haut. Ensuite, utilisez une pince à colibri pour enlever la rétine et les couches uvéales pigmentées de la sclérotique interne jusqu’à ce que la sclère soit exempte de ces couches. Ensuite, utilisez des ciseaux incurvés si nécessaire pour retirer la rétine et l’uvée de la papille.

Retirez ensuite la conjonctive, les muscles extra-ovulaires et la capsule restante de la sclérotique superficielle. Maintenant, à l’aide d’une pince à colibri pour tenir doucement le tissu, avec des ciseaux droits, coupez des échantillons scléraux d’environ deux centimètres carrés à différents endroits du tissu, en évitant les saisies répétées avec les pinces qui rendront la zone impropre à la microscopie confocale. Placez les échantillons dans des tubes de 1,5 millilitre, ajoutez 1,5 millilitre d’éthanol à 96 % et incubez pendant 15 minutes pour fixer le tissu.

Ensuite, après avoir retiré l’éthanol, utilisez 1,5 millilitre de PBS pour laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacune en secouant. Ensuite, transférez les échantillons dans 1,5 millilitre de PBS avec cinq pour cent de BSA, et incubez à température ambiante pendant deux heures, ce qui induira un gonflement des échantillons, pour aider à la plastification et éviter la liaison non spécifique. Lorsque les échantillons ont gonflé, utilisez au microscope stéréobinoculaire des aiguilles de calibre 26 qui ont été pliées sur les bords pour fixer les échantillons scléraux postérieurs à la membrane de polystyrène enveloppée d’une feuille ou à une plaque de liège.

Ensuite, pour plastifier les échantillons de toute l’épaisseur, utilisez des pinces à colibri pour maintenir horizontalement le bord antérieur du tissu scléral. Avec un scalpel numéro 10, coupez soigneusement une couche aussi fine que possible de la sclérotique superficielle, dans la couche sous-jacente. Pour éviter que le tissu ne se dessèche, pipetez 50 microlitres de PBS sur les couches.

Ensuite, une fois les couches coupées, placez-les dans 100 microlitres de PBS dans une plaque à 96 puits, et utilisez un marqueur imperméable pour étiqueter à la fois l’orientation et la couche. Continuez à isoler les couches et transférez-les sur la plaque à 96 puits jusqu’à ce que le tissu soit complètement laminé. Pour réaliser l’immunohistochimie, retirez le milieu de la plaque à 96 puits en tenant la pipette contre la paroi de chaque puits et en aspirant le fluide.

Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps primaires dilués de un à 100 dans du PBS avec deux pour cent de BSA dans les puits appropriés, et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez 200 à 300 microlitres de PBS pour laver les échantillons sur un agitateur trois fois pendant cinq minutes chacune. Si nécessaire, utilisez un autre anticorps primaire et incubez à nouveau pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps secondaires correspondants, dilués de un à 300 dans du PBS avec deux pour cent de sérum de chèvre, et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant une à deux heures. Après l’incubation, utilisez 200 à 300 microlitres de PBS pour rincer à nouveau les échantillons sur le shaker trois fois pendant cinq minutes chacune. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’une dilution d’un à 2000 DAPI dans chaque puits et incubez dans l’obscurité à température ambiante.

Avant d’utiliser 200 à 300 microlitres de PBS pour laver les échantillons deux fois. Transférez les échantillons sur des lames de microscope sous le stéréomicroscope binoculaire pour vous assurer que l’échantillon repose à plat sur la lame, et ajoutez une à deux gouttes de support de montage fluorescent. Placez ensuite une lamelle sur le dessus et utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller les bords.

Conserver dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure ou examiner directement par microscopie confocale. Pour vérifier l’épaisseur des échantillons, prélevez des piles z car l’épaisseur diffère équatorialement et postérieurement en fonction de l’emplacement scléral. Ces images montrent le réseau diversifié du plexis des vaisseaux sanguins dans la sclérotique humaine laminée dérivée de l’épisclérotique antérieure et postérieure.

Les vaisseaux sanguins sont positifs pour CD31, comme indiqué en vert. Dans cette figure, les cellules immunitaires positives LYVE1 de l’épisclère et leur relation avec les vaisseaux sanguins CD31 positifs sont illustrées. La série z-stack a été prise à un grossissement de 10x pour examiner les relations tridimensionnelles des vaisseaux sanguins et des cellules immunitaires.

Comme le montre ici, les muscles extra-oculaires enfermés dans la sclérotique peuvent également être analysés pour détecter la présence de vaisseaux sanguins ou de cellules immunitaires, en utilisant respectivement les marqueurs CD31 et LYVE1. Une fois maîtrisée, la technique de plastification peut se faire en moins d’une heure si elle est bien réalisée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’empêcher les tissus de se dessécher.

N’oubliez pas que le travail avec des tissus humains peut être potentiellement infectieux et que des précautions telles que des diagnostics microbiologiques et virologiques doivent toujours être prises au préalable.