Name: Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Découvrez la purification double-affinité et la spectrométrie de masse pour identifier les partenaires protéiques de MyoD dans les cellules HeLa S3. Cette méthode révèle les interactions nucléaires à faible abondance impliquées dans la différenciation musculaire.

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Les travaux du laboratoire Ait-Si-Ali ont été soutenus par l’Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon) ; Institut National du Cancer (INCa) ; Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC) ; Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC) ; CNRS ; L’Université Paris Diderot et le concours « Qui suis-je ? » Laboratoire d’Excellence #ANR-11- LABX-0071 financé par le Gouvernement français à travers son programme d’Investissements d’Avenir opéré par l’ANR sous la subvention #ANR-11-IDEX-0005-01. EB a été soutenu par une bourse de l’INCa.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée permet une identification exhaustive des partenaires d&#39;un facteur de transcription, MyoD. Elle a révélé des partenaires de MyoD dans un système hétérologue résistant à la différenciation induite MyoD, à savoir les cellules HeLa-S3. Ainsi, par définition, les partenaires de MyoD identifiés sont exprimés de façon ubiquitaire. Ceux - ci comprennent des facteurs généraux et spécifiques d&#39; une séquence de transcription, des enzymes de modification de la chromatine, des protéines de traitement de ...

organismes multicellulaires eucaryotes sont composés de différents organes et tissus. Chaque tissu fonctionnel présente un motif d&#39;expression de gène spécifique qui est déterminé à chaque étape de la différenciation. la différenciation cellulaire implique l&#39;activation de gènes spécifiques, l&#39;entretien de leur expression et, en général, réduisant au silence d&#39;un ensemble de gènes tels ceux impliqués dans la prolifération cellulaire. la différenciation des muscles squelettiques, ou la myogenèse est donc un procédé à plusieurs étapes, qui commence par la détermination des cellules souches mésodermiques en myoblastes, puis conduit à la différenciation terminale des myoblastes en premier mononuclées, puis multi nucléées, les myotubes . Ainsi, les myoblastes sont &quot;déterminés&quot; cellules, qui sont encore capables de proliférer, mais ils se sont engagés à la lignée du muscle squelettique, et peut donc se différencier uniquement dans les cellules musculaires squelettiques, soit au cours du développement embryonnaire ou chez les adultes la régénération musculaire. Le processus de terminal de muscle squelettique diffèrentciation est orchestrée par un programme génétique spécifique qui commence par la sortie définitive du cycle des cellules précurseurs de cellules de myoblastes qui conduit à une extinction définitive de la prolifération des gènes associés, tels que E2F gènes cibles 1. En effet, au cours du processus de différenciation terminale, myoblastes prolifération arrestation est une étape cruciale qui précède l&#39;expression de gènes spécifiques du muscle squelettique et la fusion des myoblastes en myotubes 2. Un tel programme permet à des cellules souches musculaires adultes, également appelées cellules satellites, pour différencier au cours du processus de régénération suite à une lésion du muscle squelettique. Myogenesis Mammalian dépend de manière critique sur une famille de l&#39; hélice-boucle-hélice basique myogénique (bHLH) facteurs de transcription MyoD, Myf5, MRF4 et Myogenin, souvent appelé la famille de squelette facteurs de détermination musculaire ou MRF (Facteurs réglementaires musculaires) 3. Chacun d&#39;eux joue un rôle essentiel dans la spécification et difrenciation des cellules musculaires squelettiques et a un motif d&#39;expression spécifique 4 5-7. L&#39;activation de MyoD et Myf5 constitue l&#39;étape déterminante qui engage les cellules de la lignée myogénique, et l&#39;expression subséquente de Myogenin déclenche myogenèse avec l&#39;activation de gènes spécifiques du muscle squelettique, comme MCK (Muscle Creatine Kinase). Les facteurs de transcription bHLH myogéniques coopèrent avec les membres de la famille MEF2 dans l&#39;activation des gènes musculaires de loci silencieux 8 précédemment. Elles stimulent également la transcription du gène du squelette musculaire hétérodimères avec des protéines bHLH omniprésentes, E12 et E47, appelées protéines qui se lient à E, que l&#39; on appelle E-boîtes dans les différentes régions des gènes de régulation 8. Twist, Id (inhibiteur de la différenciation) et d&#39; autres facteurs à réguler négativement ce processus, en compétition avec MyoD pour E protéines de liaison 8. MyoD est considéré comme l&#39;acteur majeur dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire 9 </sup&gt; car il a la capacité d&#39;induire une détermination myogénique / différenciation (trans-différenciation) programme dans de nombreux systèmes non-musculaires complètement différenciées 10-13. En effet, l&#39; expression forcée de MyoD induit la trans-différenciation des différents types cellulaires , même ceux provenant d&#39; une autre origine embryologique 12. Par exemple, MyoD peut convertir les hépatocytes, les fibroblastes, les mélanocytes, les neuroblastes et les adipocytes en cellules musculaires analogue. L&#39;action trans-différenciation de MyoD implique une activation anormale du programme génétique myogénique (notamment ses gènes cibles) dans un environnement non-musculaire, concomitante à la réduction au silence du programme génétique d&#39;origine (notamment, les gènes de prolifération). Dans la prolifération des myoblastes, MyoD est exprimé , mais est incapable d&#39;activer ses gènes cibles , même quand il se lie à leurs promoteurs 14-16. Par conséquent, l&#39;exigence de MyoD soient exprimées en continu dans des myoblastes non différenciés reste assez elusive. MyoD pouvait réprimer ses gènes cibles en raison de recrutement d&#39;enzymes de chromatine modifiant répressives dans la prolifération des myoblastes avant le chargement d&#39;activer remodelage de la chromatine enzymes 14,17. Par exemple, dans la prolifération des myoblastes, MyoD est associée avec le co-répresseur de la transcription KAP-1, histone désacétylases (HDAC) et les méthyltransférases de la lysine répressive (Kmts), dont l&#39;histone H3 lysine 9 ou H3K9 et H3K27 Kmts et suppriment activement l&#39;expression des gènes cibles en établissant une structure chromatine localement répressive 14,17. Surtout, un rapport récent a indiqué que MyoD est lui - même directement méthylé par le H3K9 KMT G9a entraînant l&#39;inhibition de son activité de transactivation 16. Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette trans-différenciation des cellules non musculaires par MyoD sont largement inconnues. Notamment, certaines lignées cellulaires sont résistantes à l&#39;induit MyoD-trans-différenciation. Ainsi, dans les cellules HeLa, MyoD est inactif oumême pourrait fonctionner comme répresseur plutôt que activateur de la transcription en raison du manque d&#39;expression de la sous - unité BAF60C du remodelage de la chromatine complexe SWI / SNF 18. Ce modèle peut donc être de choix pour mieux caractériser les mécanismes de répression génique induite par MyoD. Il est également approprié pour tester la capacité de MyoD pour induire l&#39; environnement de la chromatine répressive à sa loci cible avec ses partenaires associés et donc découvrir les mécanismes répressifs MyoD-dépendants dans la prolifération des myoblastes pour affiner la différenciation terminale. Nous décrivons ici le protocole pour l&#39;identification des partenaires MyoD en utilisant Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) couplée à la spectrométrie de masse (MS) la caractérisation. L&#39;utilisation de cellules HeLa exprimant de manière stable S3 Flag-HA MyoD permis d&#39;obtenir suffisamment de matériel pour purifier les complexes de MyoD à partir d&#39;extraits nucléaires fractionnées. L&#39;identification des partenaires de MyoD dans le système hétérologue a été suivie par validatidans un système pertinent.

<table><tbody><tr><td><lignées cellulaires >fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td></td><td>ATCC CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur :&nbsp ; Dénoncer l’homogénéisateur&nbsp ;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 et 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’agitation pour spinners</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Marienfeld Superior&nbsp ;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à faible liaison</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de centrifugation vide</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td><fort>réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide 4-12 %&nbsp ; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x tampon de chargement&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x agent réducteur</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration à l’argent</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration centrifuges, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G billes d’agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A/G&nbsp ; Résine</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Résine Flag (gel d’affinité à l’agarose M2 anti-Flag)</td><td>Résine Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (agarose anti-HA monoclonale)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Peptide sans drapeau (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Synthèse personnalisée</td><td>Remise en suspension jusqu’à 4 mg/ml dans 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Peptide libre HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Synthèse personnalisée</td><td>Remise en suspension jusqu’à 4 mg/ml dans 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines à base d’acide bicinchoninique : Kit BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Chimiluminescence améliorée (ECL) à base de luminol Substrat HRP</td> Technologies de <td>vie</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïde de saumon cisaillé (sel de sodium de l’acide désoxyribonucléique des testicules de saumon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Tétrachlorhydrate de spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS tampon de fonctionnement</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glycémie élevée)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Préchauffage&nbsp ; à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 % rouge de phénol</td> Life <td>technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td><td>GE soins de santé sciences de la vie&nbsp ;</td><td>PAA A15-102</td><td>Chaque lot de sérum doit d’abord être testé pour vos cellules.</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Eau (stérile-filtrée)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA de rat (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr>Flag <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>À utiliser pour le western blot</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>À utiliser pour l’immunoprécipitation et le western blot</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Souris</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Lapin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-rat -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris chèvre -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identification de myod interactome utilisation tandem affinity purification couplée à la spectrométrie de masse

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

différenciation terminale du muscle squelettique commence par l&#39;engagement des cellules précurseurs mésodermiques pluripotentes à myoblastes. Ces cellules ont encore la capacité de proliférer ou ils peuvent se différencier et fusionnent en myotubes multinucléés, qui maturate encore pour former des myofibres. différenciation terminale du muscle squelettique est orchestré par l&#39;action coordonnée des différents facteurs de transcription, en particulier les membres des facteurs ou des CTMR réglementaires musculaires (MyoD, Myogenin, Myf5 et MRF4), aussi appelé le bHLH myogéniques facteurs de transcription famille. Ces facteurs coopèrent avec des complexes de remodelage de la chromatine au sein complexe réseau de régulation transcriptionnelle pour atteindre myogenèse squelettique. En cela, MyoD est considéré comme le maître myogénique facteur de transcription dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire. Cette notion est renforcée par la possibilité de MyoD pour convertir les cellules non musculaires dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici une approche utilisée pour identifier MyoDpartenaires protéiques d&#39;une manière exhaustive dans le but d&#39;élucider les différents facteurs impliqués dans la différenciation terminale des muscles squelettiques. L&#39;objectif à long terme est de comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation des gènes du muscle squelettique, à savoir., Les cibles MyoD. Les partenaires MyoD sont identifiés à l&#39;aide de purification d&#39;affinité en tandem (TAP-Tag) à partir d&#39;un système hétérologue couplée à la spectrométrie de masse (MS), la caractérisation, suivie de la validation du rôle des partenaires appropriés au cours de la différenciation terminale du muscle squelettique. des formes aberrantes de facteurs myogènes, ou leur régulation aberrante, sont associés à un certain nombre de troubles musculaires: myasthénie congénitale, la dystrophie myotonique, le rhabdomyosarcome et les défauts dans la régénération musculaire. En tant que tel, les facteurs myogéniques constituent un bassin de cibles thérapeutiques potentielles dans les troubles musculaires, à la fois en ce qui concerne les mécanismes qui causent la maladie elle-même et des mécanismes de régénération qui peut améliorer le traitement de la maladie. Ainsi, la understan détailléeding des interactions intermoléculaires et les programmes génétiques contrôlés par les facteurs myogéniques est essentiel pour la conception rationnelle de thérapies efficaces.

Pour comprendre la régulation de l&#39;activité de MyoD, nous avons entrepris la caractérisation exhaustive des complexes MyoD utilisant la purification biochimique, sur la base du immunopurification d&#39;une double forme étiqueté de MyoD suivie par spectrométrie de masse (MS). L&#39;utilisation de la lignée cellulaire HeLa-S3 exprimant MyoD Flag-HA-marqués et une lignée de cellules de contrôle exprimant permis Flag-HA pour obtenir suffisamment de matériel pour purifier le complexe de M...

MyoD est un facteur de transcription myogénique avec une forte capacité à induire la transdifférenciation myogénique de nombreuses lignées cellulaires non musculaires entièrement différenciées. Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette transdifférenciation sont largement inconnus. Nous décrivons ici une méthode de purification à double affinité suivie d’une spectrométrie de masse pour caractériser de manière exhaustive les partenaires MyoD.

Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

L’objectif global de cette expérience est de caractériser de manière exhaustive les partenaires protéiques de MyoD. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des muscles squelettiques, telles que la régulation moléculaire de la déformation tonale des muscles squelettiques par le facteur clé de transcription musculaire, MyoD. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de démêler les partenaires MyoD qui ont une faible abondance élective, l’un localisé dans un compartiment subnucléaire spécifique.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation de la différenciation musculaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que tout autre tissu, en particulier la différenciation nucléaire. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Lauriane Fritsch, assistante de recherche de notre laboratoire. Dans ce protocole, les complexes MyoD seront purifiés à partir de cellules HeLa S3 qui expriment de manière stable MyoD avec des marqueurs de gluténine FLAG.Les cellules HeLa S3 transduites avec le vecteur vide seront utilisées comme contrôle. Les deux lignées cellulaires ont été préalablement

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JoVE Journal

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Tandem Affinity Purification est une approche robuste pour l'identification de partenaires de liaison aux protéines. Comme preuve de concept, cette méthodologie a été appliquée à la eIF4E facteur d'initiation de traduction bien caractérisé à la co-précipité les facteurs cellulaires de l'hôte impliqués dans l'initiation de la traduction. Cette méthode est facilement adaptable à n'importe quelle protéine cellulaire ou virale.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la...

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Drosophile est célèbre pour sa manipulation génétique puissant, mais pas pour son aptitude d'analyse biochimique en profondeur. Ici, nous présentons une procédure basée TAP à identifier les partenaires d'interaction de toute protéine d'intérêt à partir du cerveau de la mouche. Cette procédure peut potentiellement conduire à de nouvelles pistes de recherche.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Décrit est un workflow protéomique pour identifier des partenaires d'interaction de protéine d'une fraction subcellulaire nucléaire utilisant l'enrichissement d'immunoaffinité d'une protéine donnée d'intérêt et de la spectrométrie de masse sans étiquette. Le flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon assisté par filtre, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse et un pipeline de bioinformatique en aval.

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Ce flux de travail décrit la performance de l’enrichissement rentable et temporel de multiples modifications post-traductionnelle (PTM) de protéines simultanément pour l’analyse protéomique globale quantitative. Le protocole utilise l’enrichissement ptM de niveau peptidique avec de multiples anticorps conjugués, suivi d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir des connaissances biologiques sur le crosstalk PTM.

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Nous présentons un protocole d’étiquetage optimisé de l’étiquette de masse en tandem (TMT) qui comprend des informations détaillées pour chacune des étapes suivantes : extraction de protéines, quantification, précipitations, digestion, étiquetage, soumission à une installation de protéomique et analyses de données.

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Découvrez la purification double-affinité et la spectrométrie de masse pour identifier les partenaires protéiques de MyoD dans les cellules HeLa S3. Cette méthode révèle les interactions nucléaires à faible abondance impliquées dans la différenciation musculaire.

Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

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