Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

L’objectif global de cette expérience est de caractériser de manière exhaustive les partenaires protéiques de MyoD. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des muscles squelettiques, telles que la régulation moléculaire de la déformation tonale des muscles squelettiques par le facteur clé de transcription musculaire, MyoD. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de démêler les partenaires MyoD qui ont une faible abondance élective, l’un localisé dans un compartiment subnucléaire spécifique.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation de la différenciation musculaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que tout autre tissu, en particulier la différenciation nucléaire. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Lauriane Fritsch, assistante de recherche de notre laboratoire. Dans ce protocole, les complexes MyoD seront purifiés à partir de cellules HeLa S3 qui expriment de manière stable MyoD avec des marqueurs de gluténine FLAG.

Les cellules HeLa S3 transduites avec le vecteur vide seront utilisées comme contrôle. Les deux lignées cellulaires ont été préalablement cultivées, collectées et stockées à moins 80 degrés Celsius, comme décrit dans le texte du protocole. Décongelez rapidement les granules de cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Tous les tampons et homogénéisateurs doivent être pré-refroidis et toute cette procédure doit être effectuée dans une chambre froide. En règle générale, 20 grammes de cellules sont utilisés pour chaque point d’expérience, mais pour les besoins de cette démonstration, seuls 10 grammes, soit environ 10 ml, de cellules seront traités. Remettez les cellules en suspension dans 10 mL de tampon hypotonique A, en utilisant d’abord 5 mL de tampon

Ensuite, ajoutez 2,5 ml, suivi d’un autre 2,5 ml. Lavez bien la pipette avec un tampon frais pour obtenir le maximum de cellules. Transvaser 20 mL de suspension cellulaire dans l’homogénéisateur pré-refroidi à l’aide d’un pilon bien ajusté.

Homogénéiser les cellules en 20 passages. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Pour une récupération maximale des cellules, laver l’homogénéisateur avec 3,5 mL de tampon de saccharose.

Transférez rapidement cette suspension dans le tube de 50 mL pour préserver les noyaux et limiter les fuites. Colorez une aliquote de 30 microlitres de la suspension cellulaire avec 30 microlitres de bleu de trypan à 4 % et analysez au microscope pour déterminer l’efficacité de la lyse. Tous les noyaux doivent être bleus si la lyse réussit.

Si nécessaire, répétez l’homogénéisation. Centrifuger pendant sept minutes à 10 000 x g et quatre degrés Celsius pour granuler les noyaux. Conservez le surnageant sous forme de fraction cytoplasmique.

Commencer la procédure de préparation de la fraction extractible du sel nucléaire en remettant en suspension la pastille de noyaux dans 4 mL de tampon de saccharose. Ensuite, ajoutez 4 mL de tampon à haute teneur en sel goutte à goutte tout en mélangeant soigneusement sur un vortex pour obtenir une concentration finale de 300 mM de chlorure de sodium. Incuber pendant 30 minutes sur glace en mélangeant toutes les cinq minutes.

Ensuite, diminuez la concentration de chlorure de sodium à 150 mM en ajoutant 8 mL de tampon de saccharose. Centrifuger pendant 10 minutes à 13 000 x g et quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant, qui est la fraction extractible du sel, et laissez-le sur de la glace.

Pour préparer la fraction liée à la chromatine, remettez méticuleusement la pastille en suspension dans 3,5 mL de tampon de saccharose. Ajouter le chlorure de calcium à une concentration finale de 1 mM et mélanger. Le chlorure de calcium activera la nucléase micrococcique qui sera ajoutée plus tard.

Préchauffez la suspension pendant une minute à 37 degrés Celsius. Ajouter 35 microlitres de 5 unités par microlitre de nucléase micrococcique pour obtenir une concentration finale de 25 10 millièmes unités par microlitre. Incuber pendant exactement 12 minutes à 37 degrés Celsius.

Mélangez toutes les quatre minutes. Après 12 minutes, placez immédiatement la réaction sur de la glace. Pour arrêter l’activité des nucléases micrococciques, ajoutez 56 microlitres d’EDTA 5 molaires pH 8,0 à une concentration finale de 4 mM et vortex.

Incuber pendant cinq minutes sur de la glace. Sonicate cinq fois pendant une minute, à chaque fois à forte amplitude, permettant une pause d’une minute entre les sonications. Alternez la centrifugeuse à la fois les fractions extractibles au sel et les fractions enrichies en nucléosomes pendant 30 minutes à 85 000 x g à quatre degrés Celsius.

Collectez les surnageants. La fraction extractible du sel doit être d’environ 13 ml. Et la fraction enrichie en nucléasomes devrait être d’environ 6 ml.

Les complexes protéiques MyoD seront purifiés par purification à double affinité. Étant donné que les procédures de purification basée sur FLAG et basée sur HA sont similaires, seule la purification basée sur FLAG sera démontrée. Après avoir ajouté TEGN, transférez le volume approprié de résine FLAG dans un tube de 50 ml.

300 microlitres de résine FLAG provenant de la résine FLAG de prélavage commerciale à 50 % sont nécessaires pour chaque point d’expérience. Centrifuger pendant deux minutes à 1 000 x g. Retirez le surnageant, ajoutez le TEGN froid et centrifugez à nouveau.

Lavez la résine FLAG avec du TEGN froid au total cinq fois. Après le dernier lavage, remettez la résine FLAG en suspension dans un volume égal de TEGN. Pour chaque point d’expérience, mélangez 300 microlitres de résine lavée FLAG et l’extrait protéique correspondant.

Utilisez un tube de 15 mL pour la fraction enrichie en nucléasomes et un tube de 50 mL pour la fraction extractible au sel. Incuber les tubes sur une roue rotative pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifugez tous les tubes pendant deux minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius.

Recueillir les surnageants et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le résultat du test d’efficacité de purification soit obtenu. Pour les échantillons extractibles au sel, remettre la résine FLAG en suspension dans 4 mL de TEGN et transférer dans un tube de 15 mL. Répétez cette étape trois fois, en transférant à chaque fois dans le même 15 ml pour éviter de perdre des billes.

Centrifuger pendant deux minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 13 mL de TEGN à la résine FLAG et centrifugez-le pendant deux minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius. Lavez la résine sept fois de cette manière.

Après le dernier lavage, remettre la résine en suspension dans 1 mL de TEGN et la transférer dans un tube à faible liaison de 1,5 mL. Centrifugez pendant deux minutes et retirez le surnageant. Remettre la résine en suspension pour chaque point expérimental dans 100 microlitres de solution peptidique FLAG à 4 mg/mL à pH 7,8 Bien mélanger et ajouter 100 microlitres de tampon TEGN.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour éluer les protéines liées. Centrifugez pendant deux minutes et transférez la résine et le surnageant dans une colonne d’essorage vide placée dans un tube de 2 ml. Centrifuger la colonne pendant une minute à 6 000 x g.

Recueillir le surnageant restant dans le tube de 2 mL. L’efficacité de la purification est ensuite testée comme décrit dans le texte du protocole, avant de procéder à la purification à base d’AH. Voici des résultats représentatifs de complexes MyoD purifiés de double affinité à partir de fractions extractibles de sels nucléaires ou enrichies en nucléasomes d’une lignée cellulaire HeLa S3 exprimant de manière stable FLAG HA MyoD.

Coloration à l’argent identifiée FLAG HA MyoD indiquée par la flèche qui est absente de la lignée cellulaire fictive. Les complexes MyoD purifiés à double affinité ont été fractionnés sur des gradients de glycérol. Le western blot des fractions à l’aide d’anticorps anti-FLAG a révélé les sous-complexes MyoD dans les deux compartiments subnucléaires.

En particulier, le MyoD extractible au sel est distribué en trois sous-complexes tandis que le MyoD lié à la chromatine appartient principalement à un complexe. L’analyse par spectrométrie de masse d’interacteurs MyoD isolés à partir de fractions extractibles de sels nucléaires et enrichies en nucléosomes a permis d’identifier une série de partenaires connus et de nouveaux partenaires de MyoD. Ici, les interacteurs MyoD trouvés dans les deux fractions ou, spécifiquement pour l’une des fractions, sont regroupés en fonction de leurs annotations fonctionnelles.

Certains des interacteurs révélés par la spectrométrie de masse ont été confirmés par Western blot sur des complexes MyoD. Il s’agit notamment des facteurs de transcription CBF, de la sous-unité SWI/SNF BAF47 et des protéines HP1. Étant donné que les cellules HeLa ne sont pas des cellules musculaires et n’expriment normalement pas MyoD, il est nécessaire de confirmer les interactions entre les interacteurs nouvellement identifiés et MyoD et les myoblastes.

Des extraits nucléaires totaux de myoblastes de souris proliférants et différenciateurs ont été utilisés pour l’immunoprécipitation et l’analyse occidentale avec les anticorps indiqués. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’affiner les résultats obtenus dans les myoblastes.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’inactivation du partenaire particulier dans le système de pertinence, comme les myoblastes, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la signification fonctionnelle de l’interaction. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique biologique du développement pour explorer le réseau de régulation de cinq facteurs de transcription dans la plupart des systèmes corporels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les partenaires du facteur de transcription en effectuant un fractionnement cellulaire suivi d’une purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse.