Name: Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Découvrez la purification double-affinité et la spectrométrie de masse pour identifier les partenaires protéiques de MyoD dans les cellules HeLa S3. Cette méthode révèle les interactions nucléaires à faible abondance impliquées dans la différenciation musculaire.

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Les travaux du laboratoire Ait-Si-Ali ont été soutenus par l’Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon) ; Institut National du Cancer (INCa) ; Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC) ; Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC) ; CNRS ; L’Université Paris Diderot et le concours « Qui suis-je ? » Laboratoire d’Excellence #ANR-11- LABX-0071 financé par le Gouvernement français à travers son programme d’Investissements d’Avenir opéré par l’ANR sous la subvention #ANR-11-IDEX-0005-01. EB a été soutenu par une bourse de l’INCa.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée permet une identification exhaustive des partenaires d&#39;un facteur de transcription, MyoD. Elle a révélé des partenaires de MyoD dans un système hétérologue résistant à la différenciation induite MyoD, à savoir les cellules HeLa-S3. Ainsi, par définition, les partenaires de MyoD identifiés sont exprimés de façon ubiquitaire. Ceux - ci comprennent des facteurs généraux et spécifiques d&#39; une séquence de transcription, des enzymes de modification de la chromatine, des protéines de traitement de ...

organismes multicellulaires eucaryotes sont composés de différents organes et tissus. Chaque tissu fonctionnel présente un motif d&#39;expression de gène spécifique qui est déterminé à chaque étape de la différenciation. la différenciation cellulaire implique l&#39;activation de gènes spécifiques, l&#39;entretien de leur expression et, en général, réduisant au silence d&#39;un ensemble de gènes tels ceux impliqués dans la prolifération cellulaire. la différenciation des muscles squelettiques, ou la myogenèse est donc un procédé à plusieurs étapes, qui commence par la détermination des cellules souches mésodermiques en myoblastes, puis conduit à la différenciation terminale des myoblastes en premier mononuclées, puis multi nucléées, les myotubes . Ainsi, les myoblastes sont &quot;déterminés&quot; cellules, qui sont encore capables de proliférer, mais ils se sont engagés à la lignée du muscle squelettique, et peut donc se différencier uniquement dans les cellules musculaires squelettiques, soit au cours du développement embryonnaire ou chez les adultes la régénération musculaire. Le processus de terminal de muscle squelettique diffèrentciation est orchestrée par un programme génétique spécifique qui commence par la sortie définitive du cycle des cellules précurseurs de cellules de myoblastes qui conduit à une extinction définitive de la prolifération des gènes associés, tels que E2F gènes cibles 1. En effet, au cours du processus de différenciation terminale, myoblastes prolifération arrestation est une étape cruciale qui précède l&#39;expression de gènes spécifiques du muscle squelettique et la fusion des myoblastes en myotubes 2. Un tel programme permet à des cellules souches musculaires adultes, également appelées cellules satellites, pour différencier au cours du processus de régénération suite à une lésion du muscle squelettique. Myogenesis Mammalian dépend de manière critique sur une famille de l&#39; hélice-boucle-hélice basique myogénique (bHLH) facteurs de transcription MyoD, Myf5, MRF4 et Myogenin, souvent appelé la famille de squelette facteurs de détermination musculaire ou MRF (Facteurs réglementaires musculaires) 3. Chacun d&#39;eux joue un rôle essentiel dans la spécification et difrenciation des cellules musculaires squelettiques et a un motif d&#39;expression spécifique 4 5-7. L&#39;activation de MyoD et Myf5 constitue l&#39;étape déterminante qui engage les cellules de la lignée myogénique, et l&#39;expression subséquente de Myogenin déclenche myogenèse avec l&#39;activation de gènes spécifiques du muscle squelettique, comme MCK (Muscle Creatine Kinase). Les facteurs de transcription bHLH myogéniques coopèrent avec les membres de la famille MEF2 dans l&#39;activation des gènes musculaires de loci silencieux 8 précédemment. Elles stimulent également la transcription du gène du squelette musculaire hétérodimères avec des protéines bHLH omniprésentes, E12 et E47, appelées protéines qui se lient à E, que l&#39; on appelle E-boîtes dans les différentes régions des gènes de régulation 8. Twist, Id (inhibiteur de la différenciation) et d&#39; autres facteurs à réguler négativement ce processus, en compétition avec MyoD pour E protéines de liaison 8. MyoD est considéré comme l&#39;acteur majeur dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire 9 </sup&gt; car il a la capacité d&#39;induire une détermination myogénique / différenciation (trans-différenciation) programme dans de nombreux systèmes non-musculaires complètement différenciées 10-13. En effet, l&#39; expression forcée de MyoD induit la trans-différenciation des différents types cellulaires , même ceux provenant d&#39; une autre origine embryologique 12. Par exemple, MyoD peut convertir les hépatocytes, les fibroblastes, les mélanocytes, les neuroblastes et les adipocytes en cellules musculaires analogue. L&#39;action trans-différenciation de MyoD implique une activation anormale du programme génétique myogénique (notamment ses gènes cibles) dans un environnement non-musculaire, concomitante à la réduction au silence du programme génétique d&#39;origine (notamment, les gènes de prolifération). Dans la prolifération des myoblastes, MyoD est exprimé , mais est incapable d&#39;activer ses gènes cibles , même quand il se lie à leurs promoteurs 14-16. Par conséquent, l&#39;exigence de MyoD soient exprimées en continu dans des myoblastes non différenciés reste assez elusive. MyoD pouvait réprimer ses gènes cibles en raison de recrutement d&#39;enzymes de chromatine modifiant répressives dans la prolifération des myoblastes avant le chargement d&#39;activer remodelage de la chromatine enzymes 14,17. Par exemple, dans la prolifération des myoblastes, MyoD est associée avec le co-répresseur de la transcription KAP-1, histone désacétylases (HDAC) et les méthyltransférases de la lysine répressive (Kmts), dont l&#39;histone H3 lysine 9 ou H3K9 et H3K27 Kmts et suppriment activement l&#39;expression des gènes cibles en établissant une structure chromatine localement répressive 14,17. Surtout, un rapport récent a indiqué que MyoD est lui - même directement méthylé par le H3K9 KMT G9a entraînant l&#39;inhibition de son activité de transactivation 16. Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette trans-différenciation des cellules non musculaires par MyoD sont largement inconnues. Notamment, certaines lignées cellulaires sont résistantes à l&#39;induit MyoD-trans-différenciation. Ainsi, dans les cellules HeLa, MyoD est inactif oumême pourrait fonctionner comme répresseur plutôt que activateur de la transcription en raison du manque d&#39;expression de la sous - unité BAF60C du remodelage de la chromatine complexe SWI / SNF 18. Ce modèle peut donc être de choix pour mieux caractériser les mécanismes de répression génique induite par MyoD. Il est également approprié pour tester la capacité de MyoD pour induire l&#39; environnement de la chromatine répressive à sa loci cible avec ses partenaires associés et donc découvrir les mécanismes répressifs MyoD-dépendants dans la prolifération des myoblastes pour affiner la différenciation terminale. Nous décrivons ici le protocole pour l&#39;identification des partenaires MyoD en utilisant Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) couplée à la spectrométrie de masse (MS) la caractérisation. L&#39;utilisation de cellules HeLa exprimant de manière stable S3 Flag-HA MyoD permis d&#39;obtenir suffisamment de matériel pour purifier les complexes de MyoD à partir d&#39;extraits nucléaires fractionnées. L&#39;identification des partenaires de MyoD dans le système hétérologue a été suivie par validatidans un système pertinent.

<table><tbody><tr><td><lignées cellulaires >fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td></td><td>ATCC CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur :&nbsp ; Dénoncer l’homogénéisateur&nbsp ;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 et 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’agitation pour spinners</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Marienfeld Superior&nbsp ;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à faible liaison</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de centrifugation vide</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td><fort>réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide 4-12 %&nbsp ; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x tampon de chargement&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x agent réducteur</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration à l’argent</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration centrifuges, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G billes d’agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A/G&nbsp ; Résine</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Résine Flag (gel d’affinité à l’agarose M2 anti-Flag)</td><td>Résine Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (agarose anti-HA monoclonale)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Peptide sans drapeau (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Synthèse personnalisée</td><td>Remise en suspension jusqu’à 4 mg/ml dans 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Peptide libre HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Synthèse personnalisée</td><td>Remise en suspension jusqu’à 4 mg/ml dans 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines à base d’acide bicinchoninique : Kit BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Chimiluminescence améliorée (ECL) à base de luminol Substrat HRP</td> Technologies de <td>vie</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïde de saumon cisaillé (sel de sodium de l’acide désoxyribonucléique des testicules de saumon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Tétrachlorhydrate de spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS tampon de fonctionnement</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glycémie élevée)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Préchauffage&nbsp ; à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 % rouge de phénol</td> Life <td>technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td><td>GE soins de santé sciences de la vie&nbsp ;</td><td>PAA A15-102</td><td>Chaque lot de sérum doit d’abord être testé pour vos cellules.</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Eau (stérile-filtrée)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA de rat (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr>Flag <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>À utiliser pour le western blot</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>À utiliser pour l’immunoprécipitation et le western blot</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Souris</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Lapin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-rat -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris chèvre -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identification de myod interactome utilisation tandem affinity purification couplée à la spectrométrie de masse

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

différenciation terminale du muscle squelettique commence par l&#39;engagement des cellules précurseurs mésodermiques pluripotentes à myoblastes. Ces cellules ont encore la capacité de proliférer ou ils peuvent se différencier et fusionnent en myotubes multinucléés, qui maturate encore pour former des myofibres. différenciation terminale du muscle squelettique est orchestré par l&#39;action coordonnée des différents facteurs de transcription, en particulier les membres des facteurs ou des CTMR réglementaires musculaires (MyoD, Myogenin, Myf5 et MRF4), aussi appelé le bHLH myogéniques facteurs de transcription famille. Ces facteurs coopèrent avec des complexes de remodelage de la chromatine au sein complexe réseau de régulation transcriptionnelle pour atteindre myogenèse squelettique. En cela, MyoD est considéré comme le maître myogénique facteur de transcription dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire. Cette notion est renforcée par la possibilité de MyoD pour convertir les cellules non musculaires dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici une approche utilisée pour identifier MyoDpartenaires protéiques d&#39;une manière exhaustive dans le but d&#39;élucider les différents facteurs impliqués dans la différenciation terminale des muscles squelettiques. L&#39;objectif à long terme est de comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation des gènes du muscle squelettique, à savoir., Les cibles MyoD. Les partenaires MyoD sont identifiés à l&#39;aide de purification d&#39;affinité en tandem (TAP-Tag) à partir d&#39;un système hétérologue couplée à la spectrométrie de masse (MS), la caractérisation, suivie de la validation du rôle des partenaires appropriés au cours de la différenciation terminale du muscle squelettique. des formes aberrantes de facteurs myogènes, ou leur régulation aberrante, sont associés à un certain nombre de troubles musculaires: myasthénie congénitale, la dystrophie myotonique, le rhabdomyosarcome et les défauts dans la régénération musculaire. En tant que tel, les facteurs myogéniques constituent un bassin de cibles thérapeutiques potentielles dans les troubles musculaires, à la fois en ce qui concerne les mécanismes qui causent la maladie elle-même et des mécanismes de régénération qui peut améliorer le traitement de la maladie. Ainsi, la understan détailléeding des interactions intermoléculaires et les programmes génétiques contrôlés par les facteurs myogéniques est essentiel pour la conception rationnelle de thérapies efficaces.

Pour comprendre la régulation de l&#39;activité de MyoD, nous avons entrepris la caractérisation exhaustive des complexes MyoD utilisant la purification biochimique, sur la base du immunopurification d&#39;une double forme étiqueté de MyoD suivie par spectrométrie de masse (MS). L&#39;utilisation de la lignée cellulaire HeLa-S3 exprimant MyoD Flag-HA-marqués et une lignée de cellules de contrôle exprimant permis Flag-HA pour obtenir suffisamment de matériel pour purifier le complexe de M...

MyoD est un facteur de transcription myogénique avec une forte capacité à induire la transdifférenciation myogénique de nombreuses lignées cellulaires non musculaires entièrement différenciées. Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette transdifférenciation sont largement inconnus. Nous décrivons ici une méthode de purification à double affinité suivie d’une spectrométrie de masse pour caractériser de manière exhaustive les partenaires MyoD.

Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

L’objectif global de cette expérience est de caractériser de manière exhaustive les partenaires protéiques de MyoD. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des muscles squelettiques, telles que la régulation moléculaire de la déformation tonale des muscles squelettiques par le facteur clé de transcription musculaire, MyoD. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de démêler les partenaires MyoD qui ont une faible abondance élective, l’un localisé dans un compartiment subnucléaire spécifique.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation de la différenciation musculaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que tout autre tissu, en particulier la différenciation nucléaire. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Lauriane Fritsch, assistante de recherche de notre laboratoire. Dans ce protocole, les complexes MyoD seront purifiés à partir de cellules HeLa S3 qui expriment de manière stable MyoD avec des marqueurs de gluténine FLAG.Les cellules HeLa S3 transduites avec le vecteur vide seront utilisées comme contrôle. Les deux lignées cellulaires ont été préalablement cultivées, collectées et stockées à moins 80 degrés Celsius, comme décrit dans le texte du protocole. Décongelez rapidement les granules de cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Tous les tampons et homogénéisateurs doivent être pré-refroidis et toute cette procédure doit être effectuée dans une chambre froide. En règle générale, 20 grammes de cellules sont utilisés pour chaque point d’expérience, mais pour les besoins de cette démonstration, seuls 10 grammes, soit environ 10 ml, de cellules seront traités. Remettez les cellules en suspension dans 10 mL de tampon hypotonique A, en utilisant d’abord 5 mL de tampon.Ensuite, ajoutez 2,5 ml, suivi d’un autre 2,5 ml. Lavez bien la pipette avec un tampon frais pour obtenir le maximum de cellules. Transvaser 20 mL de suspension cellulaire dans l’homogénéisateur pré-refroidi à l’aide d’un pilon bien ajusté.Homogénéiser les cellules en 20 passages. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Pour une récupération maximale des cellules, laver l’homogénéisateur avec 3,5 mL de tampon de saccharose.Transférez rapidement cette suspension dans le tube de 50 mL pour préserver les noyaux et limiter les fuites. Colorez une aliquote de 30 microlitres de la suspension cellulaire avec 30 microlitres de bleu de trypan à 4 % et analysez au microscope pour déterminer l’efficacité de la lyse. Tous les noyaux doivent être bleus si la lyse réussit.Si nécessaire, répétez l’homogénéisation. Centrifuger pendant sept minutes à 10 000 x g et quatre degrés Celsius pour granuler les noyaux. Conservez le surnageant sous forme de fraction cytoplasmique.Commencer la procédure de préparation de la fraction extractible du sel nucléaire en remettant en suspension la pastille de noyaux dans 4 mL de tampon de saccharose. Ensuite, ajoutez 4 mL de tampon à haute teneur en sel goutte à goutte tout en mélangeant soigneusement sur un vortex pour obtenir une concentration finale de 300 mM de chlorure de sodium. Incuber pendant 30 minutes sur glace en mélangeant toutes les cinq minutes.Ensuite, diminuez la concentration de chlorure de sodium à 150 mM en ajoutant 8 mL de tampon de saccharose. Centrifuger pendant 10 minutes à 13 000 x g et quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant, qui est la fraction extractible du sel, et laissez-le sur de la glace.Pour préparer la fraction liée à la chromatine, remettez méticuleusement la pastille en suspension dans 3,5 mL de tampon de saccharose. Ajouter le chlorure de calcium à une concentration finale de 1 mM et mélanger. Le chlorure de calcium activera la nucléase micrococcique qui sera ajoutée plus tard.Préchauffez la suspension pendant une minute à 37 degrés Celsius. Ajouter 35 microlitres de 5 unités par microlitre de nucléase micrococcique pour obtenir une concentration finale de 25 10 millièmes unités par microlitre. Incuber pendant exactement 12 minutes à 37 degrés Celsius.Mélangez toutes les quatre minutes. Après 12 minutes, placez immédiatement la réaction sur de la glace. Pour arrêter l’activité des nucléases micrococciques, ajoutez 56 microlitres d’EDTA 5 molaires pH 8,0 à une concentration finale de 4 mM et vortex.Incuber pendant cinq minutes sur de la glace. Sonicate cinq fois pendant une minute, à chaque fois à forte amplitude, permettant une pause d’une minute entre les sonications. Alternez la centrifugeuse à la fois les fractions extractibles au sel et les fractions enrichies en nucléosomes pendant 30 minutes à 85 000 x g à quatre degrés Celsius.Collectez les surnageants. La fraction extractible du sel doit être d’environ 13 ml. Et la fraction enrichie en nucléasomes devrait être d’environ 6 ml.Les complexes protéiques MyoD seront purifiés par purification à double affinité. Étant donné que les procédures de purification basée sur FLAG et basée sur HA sont similaires, seule la purification basée sur FLAG sera démontrée. Après avoir ajouté TEGN, transférez le volume approprié de résine FLAG dans un tube de 50 ml.300 microlitres de résine FLAG provenant de la résine FLAG de prélavage commerciale à 50 % sont nécessaires pour chaque point d’expérience. Centrifuger pendant deux minutes à 1 000 x g. Retirez le surnageant, ajoutez le TEGN froid et centrifugez à nouveau.Lavez la résine FLAG avec du TEGN froid au total cinq fois. Après le dernier lavage, remettez la résine FLAG en suspension dans un volume égal de TEGN. Pour chaque point d’expérience, mélangez 300 microlitres de résine lavée FLAG et l’extrait protéique correspondant.Utilisez un tube de 15 mL pour la fraction enrichie en nucléasomes et un tube de 50 mL pour la fraction extractible au sel. Incuber les tubes sur une roue rotative pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifugez tous les tubes pendant deux minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius.Recueillir les surnageants et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le résultat du test d’efficacité de purification soit obtenu. Pour les échantillons extractibles au sel, remettre la résine FLAG en suspension dans 4 mL de TEGN et transférer dans un tube de 15 mL. Répétez cette étape trois fois, en transférant à chaque fois dans le même 15 ml pour éviter de perdre des billes.Centrifuger pendant deux minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 13 mL de TEGN à la résine FLAG et centrifugez-le pendant deux minutes à 1 000 x g à quatre degrés Celsius. Lavez la résine sept fois de cette manière.Après le dernier lavage, remettre la résine en suspension dans 1 mL de TEGN et la transférer dans un tube à faible liaison de 1,5 mL. Centrifugez pendant deux minutes et retirez le surnageant. Remettre la résine en suspension pour chaque point expérimental dans 100 microlitres de solution peptidique FLAG à 4 mg/mL à pH 7,8 Bien mélanger et ajouter 100 microlitres de tampon TEGN.Incuber à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour éluer les protéines liées. Centrifugez pendant deux minutes et transférez la résine et le surnageant dans une colonne d’essorage vide placée dans un tube de 2 ml. Centrifuger la colonne pendant une minute à 6 000 x g.Recueillir le surnageant restant dans le tube de 2 mL. L’efficacité de la purification est ensuite testée comme décrit dans le texte du protocole, avant de procéder à la purification à base d’AH. Voici des résultats représentatifs de complexes MyoD purifiés de double affinité à partir de fractions extractibles de sels nucléaires ou enrichies en nucléasomes d’une lignée cellulaire HeLa S3 exprimant de manière stable FLAG HA MyoD.Coloration à l’argent identifiée FLAG HA MyoD indiquée par la flèche qui est absente de la lignée cellulaire fictive. Les complexes MyoD purifiés à double affinité ont été fractionnés sur des gradients de glycérol. Le western blot des fractions à l’aide d’anticorps anti-FLAG a révélé les sous-complexes MyoD dans les deux compartiments subnucléaires.En particulier, le MyoD extractible au sel est distribué en trois sous-complexes tandis que le MyoD lié à la chromatine appartient principalement à un complexe. L’analyse par spectrométrie de masse d’interacteurs MyoD isolés à partir de fractions extractibles de sels nucléaires et enrichies en nucléosomes a permis d’identifier une série de partenaires connus et de nouveaux partenaires de MyoD. Ici, les interacteurs MyoD trouvés dans les deux fractions ou, spécifiquement pour l’une des fractions, sont regroupés en fonction de leurs annotations fonctionnelles.Certains des interacteurs révélés par la spectrométrie de masse ont été confirmés par Western blot sur des complexes MyoD. Il s’agit notamment des facteurs de transcription CBF, de la sous-unité SWI/SNF BAF47 et des protéines HP1. Étant donné que les cellules HeLa ne sont pas des cellules musculaires et n’expriment normalement pas MyoD, il est nécessaire de confirmer les interactions entre les interacteurs nouvellement identifiés et MyoD et les myoblastes.Des extraits nucléaires totaux de myoblastes de souris proliférants et différenciateurs ont été utilisés pour l’immunoprécipitation et l’analyse occidentale avec les anticorps indiqués. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’affiner les résultats obtenus dans les myoblastes.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’inactivation du partenaire particulier dans le système de pertinence, comme les myoblastes, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la signification fonctionnelle de l’interaction. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique biologique du développement pour explorer le réseau de régulation de cinq facteurs de transcription dans la plupart des systèmes corporels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les partenaires du facteur de transcription en effectuant un fractionnement cellulaire suivi d’une purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse.

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Biologie

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