Ciblage biofilm Associated Staphylococcus aureus Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

La plupart des infections bactériennes produisent un biofilm. En raison de leur environnement, les bactéries associées au biofilm sont souvent phénotypiquement résistantes aux médicaments. Les nouvelles molécules antibactériennes qui tuent les bactéries dans les biofilms sont donc une priorité élevée. Nous établissons un test pour dépister rapidement les composés antimicrobiens efficaces pour éradiquer les biofilms.

L’objectif global de cette procédure est de faire croître facilement et de manière reproductible des biofilms bactériens dans un format de plaque de 96 puits sur des chevilles attachées à un couvercle pour des tests de sensibilité aux antibiotiques à l’aide d’un colorant de viabilité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte et du développement d’antibiotiques en explorant les activités sur les cellules associées au biofilm, qui sont souvent plus représentatives des états d’infection in vivo. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de tester facilement des biofilms préformés dans un essai en trois parties et de déterminer l’inhibition à l’aide d’un colorant de viabilité commun.

Pour commencer, cultivez une culture d’organisme producteur de biofilm dans un milieu riche en nutriments. Inoculer la souche Newman de Staphylococcus aureus à partir d’une tige de glycérol dans 10 millilitres de milieu Muller-Hinton. Effectuer tous les travaux impliquant la manipulation de S. aureus avec des gants et dans une enceinte de biosécurité.

Incuber pendant 16 heures à 37 degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Ajoutez le volume de culture calculé dans un tube à centrifuger et les cellules en les faisant tourner pendant une minute à 10 000 Gs.To préparez l’inoculum du biofilm, aspirez le milieu de croissance épuisé et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 20 millilitres de CRPMI. À l’aide d’une pipette multicanaux de 200 microlitres, ajoutez 125 microlitres d’inoculum d’un réservoir de 25 millilitres dans chaque puits des rangées A à G de la plaque inférieure.

Remplissez 125 microlitres de milieu CRPMI stérile dans chaque puits de la rangée H comme contrôle de la stérilité. Prenez le couvercle de la cheville et tenez-le au-dessus du fond de la plaque avec les chevilles vers le bas. Alignez soigneusement les chevilles individuelles avec leurs puits respectifs.

Évitez tout contact physique entre la plaque et les chevilles. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle. Fermez le couvercle sur la plaque avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation et placez-le dans un sac en plastique refermable, en le fermant hermétiquement.

Gardez le volume d’air dans le sac aussi bas que possible pour minimiser l’évaporation. Incuber la plaque sans secouer à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Le jour du défi du biofilm, prenez une nouvelle plaque de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de CRPMI, équilibrés à la température ambiante, dans chaque puits des rangées B à H. Diluez jusqu’à quatre composés d’essai séparément, dans 1,0 millilitre de CRPMI, jusqu’à 2 fois la concentration finale souhaitée.

Ajouter 200 microlitres du composé 1 dans les puits A1-A3.200 microlitres du composé 2 dans les puits A4-A6.200 microlitres du composé 3 dans les puits A7-A9. Et 200 microlitres de composé 4 dans les puits A10-A12. Diluez en série les composés d’essai à l’aide d’une pipette multicanaux.

Commencez par transférer 100 microlitres de la rangée A à la rangée B et mélangez. De cette manière, continuez à transférer 100 microlitres de puits à puits. Mélangez après chaque transfert et arrêtez-vous dans la rangée F.Après avoir mélangé, expulsez 100 microlitres de la rangée F dans un récipient à déchets.

Ne transférez aucun liquide dans les rangées G et H.Enfin, ajoutez 100 microlitres de CRPMI dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette multicanaux, pour porter le volume final à 200 microlitres. Ajoutez 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate dans une plaque fraîche, stérile et de 96 puits comportant des puits de dimensions identiques à celles de la plaque d’initiation du biofilm. Ensuite, retirez le sac en plastique et le film de paraffine de la plaque d’initiation du biofilm incubé.

Soulevez le couvercle vers le haut, en évitant tout contact entre les chevilles et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Conservez la partie inférieure pour l’analyse ultérieure de l’OD600. Rincez les cellules planctoniques en plaçant le couvercle de la cheville sur la plaque contenant le PBS.

Immergez les piquets pendant cinq secondes. Sortez-les du PBS et immergez-les une fois de plus, en faisant attention de ne pas heurter les chevilles contre les côtés du puits. Placez le couvercle de la cheville rincé dans la plaque de défi.

Évitez tout contact inutile entre les piquets et la plaque inférieure, car cela endommagerait le biofilm, entraînant des résultats incohérents. Scellez la plaque avec un film de paraffine et placez-la dans un sac en plastique refermable comme précédemment. Incuber la plaque, sans secouer, pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Prenez le bas de la plaque d’initiation du biofilm et remettez les bactéries en suspension dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Mesurez l’OD600 à l’aide d’un lecteur de microplaques approprié, afin de confirmer la croissance dans tous les puits, à l’exception des contrôles de stérilité dans la rangée H. Utilisez un lecteur de plaques équipé d’une chambre d’incubation et capable de prendre des lectures de fluorescence cinétique pour détecter la conversion de la résazurine. Mettre en place une mesure de fluorescence cinétique sur 24 heures à l’aide d’une excitation de 530 nanomètres et d’une émission de 590 nanomètres.

Réglez la température de la chambre à 37 degrés Celsius et faites lire la plaque toutes les 20 minutes. Réglez le lecteur de plaques sur la mesure à partir du bas de la plaque selon les instructions du fabricant. Préparez-vous à laver la plaque en ajoutant 200 microlitres de PBS dans chaque puits d’une plaque stérile de 96 puits avec une pipette multicanaux.

Ensuite, préparez le milieu de récupération du biofilm, en ajoutant 400 microlitres de 0,8 milligramme par millilitre de solution mère de résazurine à 20 millilitres de milieu CRPMI, jusqu’à une concentration finale de 16 microgrammes par millilitre de résazurine. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de milieu de récupération du biofilm avec une pipette multicanaux, dans chaque puits d’une plaque fraîche de 96 puits. Transférez la plaque de défi de l’incubateur dans une armoire de biosécurité et retirez soigneusement le sac en plastique et le film d’étanchéité.

Retirez le couvercle de la cheville de la plaque de provocation et rincez les cellules planctoniques dans le PBS comme précédemment, en gardant le bas de la plaque de provocation pour l’analyse ultérieure de l’OD600. Après le rinçage, placez le couvercle de la cheville dans le fond de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm. Enveloppez le côté de la plaque avec un film de paraffine, en faisant attention de ne pas obstruer le fond des puits périphériques.

Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-la sur le lecteur de plaque et démarrez une lecture cinétique sur une période de 24 heures, en lançant le protocole cinétique de résazurine précédemment conçu. Pour quantifier la croissance des cellules planctoniques qui peut ou non se produire pendant le défi, lisez la DO 600 de l’ensemble du fond de la plaque de défi à l’aide d’un lecteur de microplaques. Voici un exemple de disposition d’une plaque de défi, utilisant deux dilutions complètes pour titrer les concentrations de composés.

Les biofilms cultivés ont été traités avec de la néoproïne, ou son complexe de cuivre. Les lectures OD600 du fond de la plaque de provocation après 24 heures ont révélé que le complexe de cuivre néo-proïne, mais pas la néoculproïne seule, empêchait l’excrétion et la croissance ultérieure de cellules viables à partir de biofilms traités à des concentrations de 1,25 micromolaire ou plus. Les biofilms correspondants ont ensuite été testés par le test de la résazurine.

L’inspection visuelle après 24 heures permet une réponse rapide, oui-non, si plusieurs plaques sont analysées en parallèle. La résazurine devient rose dans les puits contenant des biofilms viables, mais reste bleue lorsque le biofilm a été éradiqué. Une lecture cinétique de la conversion de la résazurine peut révéler des effets dépendants de la concentration sur la viabilité du biofilm, comme le montre ici la gentamicine.

Le retard dépendant de la concentration dans le début de la conversion du colorant est indicatif d’une diminution de la viabilité du biofilm. Lors de cette procédure, il est important de ne pas se rappeler de ne pas cogner les chevilles contre le côté des puits.