Ciblage biofilm Associated

Le but général de cette procédure est de cultiver facilement et de manière reproductible des biofilms bactériens dans un format de plaque de 96 puits, sur des picots attachés au couvercle, afin de réaliser des tests de sensibilité aux antibiotiques à l’aide d’un colorant de viabilité. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte et du développement d’antibiotiques, en explorant l’activité sur des cellules associées aux biofilms, qui sont souvent plus représentatives des états d’infection in vivo. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de tester facilement des biofilms préformés dans un essai en trois étapes et de déterminer l’inhibition à l’aide d’un colorant de viabilité couramment utilisé.

Pour commencer, cultivez un organisme producteur de biofilm dans un milieu riche en nutriments. Inoculez la souche de Staphylococcus aureus Newman à partir d'une conservation glycérolée dans 10 millilitres de milieu Muller-Hinton. Effectuez toutes les manipulations impliquant S. aureus avec des gants et à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique.

Incuber pendant 16 heures à 37 degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Ajouter le volume de culture calculé dans un tube à centrifuger et former un culot cellulaire en centrifugeant pendant une minute à 10 000 G. Pour préparer l'inoculum de biofilm, aspirer le milieu de croissance usé et resuspendre le culot cellulaire dans 20 millilitres de CRPMI. À l’aide d’une pipette multipipette de 200 microlitres, ajouter 125 microlitres d’inoculum provenant d’un réservoir de 25 millilitres dans chaque puits des lignes A à G de la plaque inférieure.

Remplir 125 microlitres de milieu CRPMI stérile dans chaque puits de la rangée H comme témoin de stérilité. Prendre le couvercle à picots et le maintenir au-dessus du fond de la plaque avec les picots orientés vers le bas. Aligner soigneusement chaque picot avec son puits respectif.

Évitez tout contact physique entre la plaque et les broches. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle. Scellez le couvercle à la plaque avec un film de paraffine afin d'éviter l'évaporation, puis placez-la dans un sac en plastique refermable en assurant une fermeture étanche.

Gardez le volume d'air dans le sac aussi faible que possible afin de minimiser l'évaporation. Incubez la plaque sans agitation à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Le jour du test de biofilm, prenez une plaque neuve de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de CRPMI, prééquilibré à température ambiante, dans chaque puits des lignes B à H. Diluez jusqu'à quatre composés test séparément, dans 1,0 millilitre de CRPMI, à 2x la concentration finale souhaitée.

Ajouter 200 microlitres du composé 1 dans les puits A1-A3. 200 microlitres du composé 2 dans les puits A4-A6. 200 microlitres du composé 3 dans les puits A7-A9. Et 200 microlitres du composé 4 dans les puits A10-A12. Diluer en série les composés testés à l’aide d’une pipette multicanal.

Commencez par transférer 100 microlitres de la rangée A vers la rangée B, puis mélangez. De cette manière, continuez à transférer 100 microlitres de puits en puits. Mélangez après chaque transfert, et arrêtez à la rangée F. Après le mélange, éjectez 100 microlitres de la rangée F dans un récipient de déchets.

Ne pas transférer de liquide dans les rangées G et H. Enfin, ajouter 100 microlitres de CRPMI dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette multicanal, afin d’obtenir un volume final de 200 microlitres. Ajouter 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate dans une plaque stérile neuve à 96 puits, comportant des puits de dimensions identiques à celles de la plaque d’initiation du biofilm. Ensuite, retirer le sac en plastique et le film parafilm de la plaque d’initiation du biofilm incubée.

Soulevez le couvercle verticalement, en évitant tout contact entre les broches et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Conservez la partie inférieure pour une analyse ultérieure de l'OD600. Éliminez les cellules planctoniques en plaçant le couvercle à broches sur la plaque contenant du PBS.

Immergez les broches pendant cinq secondes. Retirez-les du PBS, puis immergez-les à nouveau, en prenant soin de ne pas heurter les parois des puits avec les broches. Placez le couvercle de broches rincé dans la plaque de challenge.

Évitez tout contact inutile entre les broches et la plaque inférieure, car cela endommagerait le biofilm et conduirait à des résultats incohérents. Scellez la plaque avec un film de paraffine et placez-la dans un sac en plastique refermable, comme précédemment. Incubez la plaque, sans agitation, pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Prenez le fond de la plaque d'initiation du biofilm et resuspendez les bactéries dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Mesurez l’OD600 à l’aide d’un lecteur de microplaque adapté afin de confirmer la croissance dans tous les puits, sauf les témoins de stérilité de la rangée H. Utilisez un lecteur de plaque équipé d’une chambre d’incubation et capable d’effectuer des mesures cinétiques de fluorescence pour détecter la conversion de la résazurine. Configurez une mesure cinétique de fluorescence de 24 heures avec une excitation à 530 nanomètres et une émission à 590 nanomètres.

Régler la température de la chambre à 37 degrés Celsius et programmer la lecture de la plaque toutes les 20 minutes. Configurer le lecteur de plaque pour effectuer la mesure à partir du fond de la plaque conformément aux instructions du fabricant. Préparer le lavage de la plaque en ajoutant 200 microlitres de PBS dans chaque puits d'une plaque stérile de 96 puits à l'aide d'une pipette multicanal.

Ensuite, préparez le milieu de récupération de biofilm en ajoutant 400 microlitres d'une solution mère de résazurine à 0,8 milligramme par millilitre à 20 millilitres de milieu CRPMI, afin d'obtenir une concentration finale de 16 microgrammes par millilitre de résazurine. Puis, ajoutez 150 microlitres de milieu de récupération de biofilm à chaque puits d'une nouvelle plaque 96-puits à l’aide d’une pipette multicanal. Transférez la plaque d'essai de l'incubateur vers une cabine de sécurité biologique et retirez soigneusement le sac en plastique et le film scellé.

Retirez le couvercle à picots de la plaque de challenge et rincez les cellules planctoniques dans du PBS comme précédemment, en conservant le fond de la plaque de challenge pour une analyse ultérieure de l'OD600. Après le rinçage, placez le couvercle à picots dans le fond de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm. Enveloppez les bords de la plaque avec du film parafilm, en prenant soin de ne pas obstruer le fond des puits périphériques.

Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-la sur le lecteur de plaques et lancez une lecture cinétique sur une période de 24 heures en démarrant le protocole cinétique de résazurine précédemment configuré. Afin de quantifier la croissance des cellules planctoniques, qui peut ou non survenir pendant le test, mesurez l'OD600 de toute la face inférieure de la plaque de test à l'aide d'un lecteur de microplaques. On voit ici un exemple de disposition d'une plaque de test, utilisant deux dilutions complètes pour titrer les concentrations du composé.

Les biofilms cultivés ont été traités avec la néocuproïne ou son complexe au cuivre. Les mesures d'absorbance à 600 nm du fond de la plaque d'essai après 24 heures ont révélé que le complexe cuivrique de la néocuproïne, mais pas la néocuproïne seule, empêchait le détachement et la croissance subséquente de cellules viables provenant des biofilms traités, à des concentrations de 1,25 micromolaire ou plus. Les biofilms correspondants ont ensuite été analysés par le test au résazurine.

L’inspection visuelle après 24 heures permet d’obtenir rapidement une réponse binaire oui/non lorsque plusieurs plaques sont analysées en parallèle. La résazurine devient rose dans les puits contenant des biofilms viables, mais reste bleue lorsque le biofilm a été éliminé. Une lecture cinétique de la conversion de la résazurine peut révéler des effets concentration-dépendants sur la viabilité du biofilm, comme illustré ici avec la gentamicine.

Le retard dépendant de la concentration dans le début de la conversion du colorant indique une diminution de la viabilité du biofilm. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de ne pas heurter les broches contre les parois des puits.