Name: Ciblage biofilm Associated Staphylococcus aureus Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Apprenez à cultiver des biofilms de Staphylococcus aureus en format 96 puits pour tester la sensibilité aux antibiotiques avec le colorant resazurine. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des agents antimicrobiens contre les infections résistantes.

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Nous remercions Saran Kupul pour son assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention R01-AI104952 des NIH à FW. Un soutien supplémentaire a été fourni par le Centre de recherche sur le sida (CFAR) de l’Université de l’Alabama à Birmingham (UAB), un programme financé par les NIH (P30 AI027767) qui a été rendu possible par les instituts NIH suivants : NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. biofilm Initiation <ol><li> Cultiver une culture de biofilm organisme produisant dans un milieu riche en nutriments. Inoculer Staphylococcus aureus souche Newman dans 10 ml de milieu Mueller-Hinton à partir d&#39; un stock de glycérol. Effectuer tous les travaux impliquant la manipulation de S. aureus avec des gants et dans une enceinte de biosécurité. </li><li> Incuber pendant 16 heures à 37 ° C sur un agitateur rotatif (100-200 rpm). </li><li> Déterminer la DO 600 de la culture en utilisant un spectrophotomètre et d&#39; une cuvette standard (longueur de trajet: 1 cm). </li><li> Calculer le volume (V) de la culture nécessaire pour préparer 20 ml d&#39;inoculum avec OD 600 (inoculum) de 0,1 à chelexed médias Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) 9 en utilisant la formule: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (culture )] Remarque: La référence 9 fournit des détails sur la préparation cRPMI. <ol><li> Ajouter le volume calculé de culture (ci-dessus) dans un tube de centrifugeuse et un culot de cellules par centrifugation pendant 1 min à 10 000 x g. Pour prepare biofilm inoculum, aspirer le milieu de culture et remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml passé cRPMI. </li></ol></li><li> Verser inoculum dans un réservoir de 25 ml. </li><li> Retirez délicatement le couvercle d&#39;une plaque de cheville 96 puits stérile en le tirant vers le haut. Remarque: Il faut prendre soin de ne pas contaminer les chevilles qui pendent du couvercle. Le couvercle peut être placé à l&#39;envers sur une surface propre au sein d&#39;une enceinte de sécurité biologique. </li><li> En utilisant une pipette multi-canal de 200 pi, ajouter 125 inoculum ul à chaque puits de lignes A à G de la plaque inférieure. </li><li> Remplissez moyen cRPMI 125 ul stérile dans chaque puits de la rangée H comme un contrôle de stérilité. </li><li> Prenez le peg-couvercle et le maintenir au-dessus du fond de la plaque avec les chevilles vers le bas. Alignez soigneusement les piquets individuels avec leurs puits respectifs. Éviter tout contact physique entre la plaque et les chevilles. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle vers le bas. Évitez les désalignements comme réajustements effectués après les chevilles ont touché la plaque de fond peut contcontrôles de stérilité aminer dans la rangée H. </li><li> Sceller le couvercle à la plaque avec un film de paraffine pour éviter l&#39;évaporation et le placer dans un sac en plastique refermable, scellant hermétiquement. Gardez le volume d&#39;air dans le sac aussi bas que possible pour minimiser l&#39;évaporation. </li><li> Incuber sans agitation à 37 ° C pendant 48 heures dans un incubateur à CO 2 de 5%. Note: 48 h de croissance a été optimale pour S. aureus, mais varieront en fonction de l&#39;organisme utilisé. Remarque: Bien que l&#39; incubation statique est un bon point de départ pour optimiser le dosage, en secouant doucement à 150 rpm sur un agitateur de microplaques est une variante possible qui peut améliorer la formation de biofilm de certains S. aureus. </li></ol> 2. Préparation de la plaque biofilm Défi <ol><li> Le jour du défi de biofilm prendre une plaque de 96 puits fraîche et ajouter 100 pi de cRPMI, équilibrées à la température ambiante, à chaque puits de lignes B à H. Pour éviter des résultats incohérents, utiliser une plaque de 96 puits qui peut contenir 200 pides supports lorsque les pions sont à l&#39;intérieur, et comporte des puits ayant des dimensions identiques à celles de la plaque biofilm d&#39;initiation. </li><li> Diluer jusqu&#39;à 4 composés testés séparément dans 1,0 ml de cRPMI à 2 x la concentration finale désirée, afin de tenir compte de la dilution finale dans l&#39;étape 2.7. Note: Un bon point de départ est 8 fois supérieure à la concentration inhibitrice des cellules planctoniques. </li><li> Ajouter 200 pi de composé 1 dans le puits A1 à A3, le composé 2 dans les puits A4 à A6, composé 3 dans les puits A7 à A9 et composé 4 dans les puits A10 à A12. </li><li> En série diluer les composés d&#39;essai à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux et transférer 100 pi de la ligne A à la ligne B et mélanger. </li><li> De cette manière, continuer à transférer 100 ul puits à puits. Mélanger après chaque transfert et arrêter la ligne F. </li><li> Après le mélange, expulser 100 pi de la ligne F dans un conteneur de déchets. Ne pas transférer tout liquide aux lignes G et H. </li><li> Ajouter 100 ul de cRPMI à chaque puits de la plaque à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux pouramener le volume à 200 ul. Voir la Figure 1 pour mise en page finale de la plaque. </li></ol> 3. biofilm Défi <ol><li> Ajouter 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) à une plaque de 96 puits stérile fraîche qui comporte des puits ayant des dimensions identiques à celles de la plaque biofilm d&#39;initiation. </li><li> Retirez le sac en plastique et un film de paraffine de incubé plaque biofilm d&#39;initiation. </li><li> Soulevez le couvercle vers le haut. Éviter tout contact entre les piquets et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Gardez partie inférieure pour la suite OD 600 analyse (voir 3.8). </li><li> Rincez les cellules planctoniques en plaçant le peg-couvercle sur la plaque contenant du PBS (de l&#39;étape 3.1). Immerger chevilles pendant 5 secondes, sortir de la PBS, et submergez une fois de plus, en faisant attention de ne pas frapper les chevilles contre les côtés du puits. </li><li> Placez le peg-couvercle rincés dans la plaque de défi. Évitez tout contact inutile entre les piquets et plaque de fond, car cela endommagerait le biofilm conduisant àdes résultats incohérents. </li><li> plaque d&#39;étanchéité avec un film de paraffine et placer dans un sac en plastique refermable comme décrit à l&#39;étape 1.10. </li><li> Incuber la plaque sans agitation pendant 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Prendre en bas de la plaque biofilm d&#39;initiation de 3,3. Resuspendre les bactéries dans chaque puits à l&#39; aide d&#39; une pipette multicanaux et mesurer la DO 600 avec un lecteur de microplaque approprié pour confirmer la croissance se produisant dans tous les puits , mais les contrôles de stérilité dans la rangée H. </li></ol> 4. biofilm Détermination <ol><li> Utiliser un lecteur de plaque muni d&#39;une chambre d&#39;incubation et capable d&#39;effectuer des mesures de fluorescence pour détecter la cinétique de conversion résazurine. Mettre en place une cinétique mesure de fluorescence 24 heures en utilisant une excitation de 530 nm et 590 nm émission. </li><li> Réglez la température de la chambre à 37 ° C et la plaque ont lu toutes les 20 min. Configurer le lecteur de plaque à mesurer à partir du fond de la plaque selon le constructeur instructions. </li><li> Préparer la plaque de lavage en ajoutant 200 pi de PBS avec une pipette multicanaux à une plaque de 96 puits stérile. </li><li> Préparer le milieu de récupération de biofilm par addition de 400 ul de 0,8 mg / ml de résazurine solution mère à 20 ml de milieu cRPMI à une concentration finale de 16 pg / ml de résazurine. Note: résazurine est un irritant connu de la peau. Utilisez un sarrau de laboratoire, des lunettes de protection et des gants lors de la manipulation. CRPMI que les médias de récupération de biofilm a été utilisé car il fournit le signal de fond le plus bas, mais il peut être remplacé par les médias Mueller Hinton, le cas échéant. </li><li> Ajouter 150 ul de milieu de récupération de biofilm avec une pipette multicanaux à chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits fraîche. </li><li> Transfert de plaque de défi de l&#39;incubateur dans une enceinte de sécurité biologique et retirez soigneusement le sac en plastique et le film d&#39;étanchéité. </li><li> Retirez le peg-couvercle de la plaque de défi et rincer les cellules planctoniques dans du PBS comme décrit dans 3.4. Gardez le fond de la plaque de défi pour OD ultérieure 600 analyse (voir 4.10). </li><li> Après rinçage, placer la cheville couvercle dans la partie inférieure de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm. </li><li> Envelopper le côté de la plaque avec un film de paraffine, en faisant attention à ne pas obstruer le fond des puits de périmètre. Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-le sur le lecteur de plaque et de commencer une lecture cinétique sur une période de 24 heures en lançant précédemment fait résazurine protocole cinétique de l&#39;étape 4.1. </li><li> Pour quantifier la croissance des cellules planctoniques qui peuvent ou peuvent ne pas se produire pendant défi, lisez la DO 600 de l&#39;ensemble du fond de la plaque de défi en utilisant un lecteur de plaque micro. Suivez les instructions données à l&#39;étape 3.8. Remarque: mélanger soigneusement le contenu de chaque puits comme cellules excrétion hors du biofilm ont tendance à croître dans les touffes au fond du puits. Les bulles dans le puits vont fortement interférer avec OD 600 lectures et doivent être évités ou supprimés avant la lecture. </li></ol>

<ol><li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement%3A+the+possible+role+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Rev+%28Pavia%29%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases).</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hacking+into+bacterial+biofilms%3A+a+new+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intensive+Care%22%5BJournal%5D)">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19(2011).</li>
<li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+laboratory+reference+strains+mirror+%27real-world%27+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li>
<li>Kwasny, S. M., Opperman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+biofilm+cultures+of+Gram-positive+pathogens+grown+in+a+microtiter+format+used+for+anti-biofilm+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MBEC+Assay+System%3A+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li>
<li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+%28MBC-P%29+and+biofilm+cells+%28MBC-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854(2014).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persisters%3A+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53(2006).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit un dosage de biofilm modifié pour déterminer l&#39; activité d&#39;inhibiteurs testés sur S. biofilms aureus mettant l&#39; accent sur ​​l&#39;état métabolique des cellules de biofilm associé. Alors que l&#39;initiation de biofilm décrit et procédures de contestation des recommandations du fabricant principalement simulées, l&#39;utilisation de résazurine colorant pour détecter et quantifier les cellules associées à un biofilm qui survivent un défi inhibiteur 24 h simplifie consi...

Microbes pathogènes peuvent former des biofilms in vivo conduisant à des infections chroniques non actifs 1. L&#39; infection par le biofilm associé est un facteur de risque grave de procédures médicales qui impliquent l&#39; implantation d&#39;objets étrangers (par exemple, le remplacement des os artificiels, des implants mammaires) ou l&#39;installation des tubes trachéaux ou cathéters urinaires 2. Dans ces contextes, le traitement anti-infectieux est presque toujours nécessaire que les infections à base de biofilm sont rarement effacés sur leur propre, même chez les personnes immunocompétentes. Staphylococcus aureus est l&#39; un des agents pathogènes les plus fréquemment observés impliqués dans les complications liées à biofilm qui se produisent lors de l&#39;utilisation de dispositifs médicaux invasifs 3. Malheureusement, la nature même de biofilms comme une barrière protectrice qui les rend plus résistantes au traitement que les cellules planctoniques 1,4, et l&#39; évaluation de l&#39; efficacité clinique prédit est un élément essentiel à la fois initialele développement de médicaments, ainsi que la surveillance de la résistance aux médicaments. Il est de plus en plus reconnu que les conditions de laboratoire, axées sur les cultures planctoniques, peuvent ne pas représenter fidèlement la maladie dans le monde réel 5. Aggravant encore le problème, la réplication des phénotypes biofilm est difficile, et les modèles de biofilm existants sont fastidieux et souffrent de haute inter et intra-essai variabilité 6. Ainsi, de nombreux chercheurs, par nécessité, par défaut aux dosages cellulaires planctoniques de sensibilité aux médicaments, ce qui pourrait négliger un aspect important de la virulence bactérienne et la maladie. Nous décrivons ici le protocole de dosage de bactéries, en particulier S. aureus, dans les biofilms pré-cultivés en utilisant une base de 7,8 à 96 puits de système de biofilm. Bien que le protocole pour la formation de biofilm et de défi suit essentiellement la recommandation du fabricant, nous présentons une méthodologie riche en information alternative pour quantifier la viabilité du bioFilm après la provocation. En bref, les bactéries sont mises en culture dans la plaque de cheville, où les biofilms se forment sur les pions en saillie fixés au couvercle de la plaque. Après la formation du biofilm, les ergots sont légèrement trempées dans le puits d&#39;une plaque fraîche rempli avec du PBS pour éliminer les cellules planctoniques. Le peg-couvercle, avec biofilms attachés, est transféré à une nouvelle plaque de défi, contenant diverses concentrations d&#39;antibiotiques à doser. Après une seconde incubation, les couvercles sont de nouveau retirées, lavées et transférées à une plaque de recouvrement contenant un colorant résazurine, où ils sont soumis à une incubation finale. la conversion résazurine peut être enregistré cinétiquement ou pris comme une lecture du point final après une période de récupération définie. Cette méthode de quantification de la viabilité des biofilms à base de colorant diffère considérablement des UFC (unités formant colonies) fastidieuses méthodologie basée-count décrit dans le protocole original 7. OD 600 mesures de la plaque de défi de la drogue et la résazurine cinétique de conversion servent de viabilité de lectureouts de planctoniques et biofilm cellules, respectivement, offrant une information riche et techniquement simple test rapide, fiable, pour la survie de biofilm.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>Suivre les recommandations du fabricant</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 medium chélexé pendant 1 h avec de la résine Chelex 100 puis complété par 10 % de résine non chelexée RPMI-1640</td></tr><tr><td>Chelex 100 Bio</td><td>Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC-plaques</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &micro ; g/ml dans de l’eau DI&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Filtre stérile</td></tr><tr><td>Micro Plate Shakeking Platform&nbsp ;</td><td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Lecteur de plaques</td><td>Logiciel Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Enregistrement et analyse de la conversion de la résine</td></tr><tr><td>Neocuproine</td><td>Sigma</td><td>N1501&nbsp ;</td><td>préparer un stock de 10 mM dans 100 % d’éthanol, stocker à -80 &ordm ; C</td></tr><tr><td>Sulfate</td><td>de cuivre Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>préparer une solution mère de 100 mM dans l’eau, stocker à 4 &ordm ; C</td></tr><tr><td>Cu-Neocuproine</td><td>Self-Made</td><td></td><td>Généré en mélangeant des molarités égales de néoculproine et de sulfate de cuivre. Le mélange a été dilué dans un milieu CRPMI jusqu’à la concentration désirée.</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

ciblage biofilm associated<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; utilisation de résazurine basé essai de sensibilité aux médicaments

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

La plupart des bactéries pathogènes sont capables de former des biofilms pendant l’infection, mais en raison de la difficulté de manipuler et d’évaluer les biofilms, la grande majorité des travaux de laboratoire sont effectués avec des cellules planctoniques. Ici, nous décrivons un test de biofilm sur plaque cheville tel qu’il a été réalisé avec Staphylococcus aureus. Les biofilms bactériens sont cultivés sur des chevilles fixées à un couvercle de plaque de microtitration de 96 puits, lavés par immersion douce dans un tampon et placés dans une plaque de provocation médicamenteuse. Après l’incubation subséquente, ils sont à nouveau lavés et déplacés vers une plaque de récupération finale, dans laquelle le colorant fluorescent resazurin sert d’indicateur de viabilité. Ce test offre une facilité d’utilisation, une fiabilité et une reproductibilité considérablement accrues, ainsi qu’une multitude de données lorsqu’il est effectué sous forme de lecture cinétique. De plus, ce test peut être adapté à une approche de criblage de médicaments à moyen débit par laquelle une lecture fluorescente du point final est prise à la place, offrant ainsi une voie pour les efforts de découverte de médicaments.

Le dosage de la résazurine est suffisamment sensible pour détecter de manière fiable très peu de cellules viables capables de se répliquer dans un milieu exempt de drogue après la provocation. Dans cette méthodologie, nous définissons le biofilm l&#39;éradication de concentration minimale que la plus faible concentration à laquelle aucune conversion de résazurine est vu dans les 24 heures. Le dosage de la résazurine repose sur des molécules oxydantes présentes dans des cellules métaboliq...

La plupart des infections bactériennes produisent un biofilm. En raison de leur environnement, les bactéries associées au biofilm sont souvent phénotypiquement résistantes aux médicaments. Les nouvelles molécules antibactériennes qui tuent les bactéries dans les biofilms sont donc une priorité élevée. Nous établissons un test pour dépister rapidement les composés antimicrobiens efficaces pour éradiquer les biofilms.

Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Le but général de cette procédure est de cultiver facilement et de manière reproductible des biofilms bactériens dans un format de plaque de 96 puits, sur des picots attachés au couvercle, afin de réaliser des tests de sensibilité aux antibiotiques à l’aide d’un colorant de viabilité. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte et du développement d’antibiotiques, en explorant l’activité sur des cellules associées aux biofilms, qui sont souvent plus représentatives des états d’infection in vivo. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de tester facilement des biofilms préformés dans un essai en trois étapes et de déterminer l’inhibition à l’aide d’un colorant de viabilité couramment utilisé.Pour commencer, cultivez un organisme producteur de biofilm dans un milieu riche en nutriments. Inoculez la souche de Staphylococcus aureus Newman à partir d'une conservation glycérolée dans 10 millilitres de milieu Muller-Hinton. Effectuez toutes les manipulations impliquant S. aureus avec des gants et à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique.Incuber pendant 16 heures à 37 degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Ajouter le volume de culture calculé dans un tube à centrifuger et former un culot cellulaire en centrifugeant pendant une minute à 10 000 G. Pour préparer l'inoculum de biofilm, aspirer le milieu de croissance usé et resuspendre le culot cellulaire dans 20 millilitres de CRPMI. À l’aide d’une pipette multipipette de 200 microlitres, ajouter 125 microlitres d’inoculum provenant d’un réservoir de 25 millilitres dans chaque puits des lignes A à G de la plaque inférieure.Remplir 125 microlitres de milieu CRPMI stérile dans chaque puits de la rangée H comme témoin de stérilité. Prendre le couvercle à picots et le maintenir au-dessus du fond de la plaque avec les picots orientés vers le bas. Aligner soigneusement chaque picot avec son puits respectif.Évitez tout contact physique entre la plaque et les broches. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle. Scellez le couvercle à la plaque avec un film de paraffine afin d'éviter l'évaporation, puis placez-la dans un sac en plastique refermable en assurant une fermeture étanche.Gardez le volume d'air dans le sac aussi faible que possible afin de minimiser l'évaporation. Incubez la plaque sans agitation à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Le jour du test de biofilm, prenez une plaque neuve de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de CRPMI, prééquilibré à température ambiante, dans chaque puits des lignes B à H. Diluez jusqu'à quatre composés test séparément, dans 1,0 millilitre de CRPMI, à 2x la concentration finale souhaitée.Ajouter 200 microlitres du composé 1 dans les puits A1-A3. 200 microlitres du composé 2 dans les puits A4-A6. 200 microlitres du composé 3 dans les puits A7-A9. Et 200 microlitres du composé 4 dans les puits A10-A12. Diluer en série les composés testés à l’aide d’une pipette multicanal.Commencez par transférer 100 microlitres de la rangée A vers la rangée B, puis mélangez. De cette manière, continuez à transférer 100 microlitres de puits en puits. Mélangez après chaque transfert, et arrêtez à la rangée F. Après le mélange, éjectez 100 microlitres de la rangée F dans un récipient de déchets.Ne pas transférer de liquide dans les rangées G et H. Enfin, ajouter 100 microlitres de CRPMI dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette multicanal, afin d’obtenir un volume final de 200 microlitres. Ajouter 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate dans une plaque stérile neuve à 96 puits, comportant des puits de dimensions identiques à celles de la plaque d’initiation du biofilm. Ensuite, retirer le sac en plastique et le film parafilm de la plaque d’initiation du biofilm incubée.Soulevez le couvercle verticalement, en évitant tout contact entre les broches et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Conservez la partie inférieure pour une analyse ultérieure de l'OD600. Éliminez les cellules planctoniques en plaçant le couvercle à broches sur la plaque contenant du PBS.Immergez les broches pendant cinq secondes. Retirez-les du PBS, puis immergez-les à nouveau, en prenant soin de ne pas heurter les parois des puits avec les broches. Placez le couvercle de broches rincé dans la plaque de challenge.Évitez tout contact inutile entre les broches et la plaque inférieure, car cela endommagerait le biofilm et conduirait à des résultats incohérents. Scellez la plaque avec un film de paraffine et placez-la dans un sac en plastique refermable, comme précédemment. Incubez la plaque, sans agitation, pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.Prenez le fond de la plaque d'initiation du biofilm et resuspendez les bactéries dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Mesurez l’OD600 à l’aide d’un lecteur de microplaque adapté afin de confirmer la croissance dans tous les puits, sauf les témoins de stérilité de la rangée H. Utilisez un lecteur de plaque équipé d’une chambre d’incubation et capable d’effectuer des mesures cinétiques de fluorescence pour détecter la conversion de la résazurine. Configurez une mesure cinétique de fluorescence de 24 heures avec une excitation à 530 nanomètres et une émission à 590 nanomètres.Régler la température de la chambre à 37 degrés Celsius et programmer la lecture de la plaque toutes les 20 minutes. Configurer le lecteur de plaque pour effectuer la mesure à partir du fond de la plaque conformément aux instructions du fabricant. Préparer le lavage de la plaque en ajoutant 200 microlitres de PBS dans chaque puits d'une plaque stérile de 96 puits à l'aide d'une pipette multicanal.Ensuite, préparez le milieu de récupération de biofilm en ajoutant 400 microlitres d'une solution mère de résazurine à 0,8 milligramme par millilitre à 20 millilitres de milieu CRPMI, afin d'obtenir une concentration finale de 16 microgrammes par millilitre de résazurine. Puis, ajoutez 150 microlitres de milieu de récupération de biofilm à chaque puits d'une nouvelle plaque 96-puits à l’aide d’une pipette multicanal. Transférez la plaque d'essai de l'incubateur vers une cabine de sécurité biologique et retirez soigneusement le sac en plastique et le film scellé.Retirez le couvercle à picots de la plaque de challenge et rincez les cellules planctoniques dans du PBS comme précédemment, en conservant le fond de la plaque de challenge pour une analyse ultérieure de l'OD600. Après le rinçage, placez le couvercle à picots dans le fond de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm. Enveloppez les bords de la plaque avec du film parafilm, en prenant soin de ne pas obstruer le fond des puits périphériques.Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-la sur le lecteur de plaques et lancez une lecture cinétique sur une période de 24 heures en démarrant le protocole cinétique de résazurine précédemment configuré. Afin de quantifier la croissance des cellules planctoniques, qui peut ou non survenir pendant le test, mesurez l'OD600 de toute la face inférieure de la plaque de test à l'aide d'un lecteur de microplaques. On voit ici un exemple de disposition d'une plaque de test, utilisant deux dilutions complètes pour titrer les concentrations du composé.Les biofilms cultivés ont été traités avec la néocuproïne ou son complexe au cuivre. Les mesures d'absorbance à 600 nm du fond de la plaque d'essai après 24 heures ont révélé que le complexe cuivrique de la néocuproïne, mais pas la néocuproïne seule, empêchait le détachement et la croissance subséquente de cellules viables provenant des biofilms traités, à des concentrations de 1,25 micromolaire ou plus. Les biofilms correspondants ont ensuite été analysés par le test au résazurine.L’inspection visuelle après 24 heures permet d’obtenir rapidement une réponse binaire oui/non lorsque plusieurs plaques sont analysées en parallèle. La résazurine devient rose dans les puits contenant des biofilms viables, mais reste bleue lorsque le biofilm a été éliminé. Une lecture cinétique de la conversion de la résazurine peut révéler des effets concentration-dépendants sur la viabilité du biofilm, comme illustré ici avec la gentamicine.Le retard dépendant de la concentration dans le début de la conversion du colorant indique une diminution de la viabilité du biofilm. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de ne pas heurter les broches contre les parois des puits.

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