A l'étape par le protocole de l'étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

L’objectif global de cette intervention chirurgicale est de remplacer l’épithélium pigmentaire de la rétine dysfonctionnel, ou EPR, afin de trouver un remède possible pour les maladies liées à l’EPR, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’optométrie sur la thérapie cellulaire et la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut fournir une modalité de transport pour le substrat de remplacement cellulaire ou les dispositifs d’administration de médicaments vers l’espace sous-rétinien.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la vitrectomie et de la chirurgie sous-rétinienne chez le lapin, elle peut également être utilisée sur d’autres organismes modèles, tels que les porcs, les singes ou les humains. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car non seulement la chirurgie intraoculaire est complexe, mais le personnel, l’organisation et la technologie de cette procédure doivent également être bien synchronisés. Fabian Thieltges, post-doctorant, et Ralf Brinken, infirmier en chirurgie, tous deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure de chargement des instruments.

Avant de commencer l’opération, confirmez le niveau d’anesthésie approprié et appliquez une pommade oculaire sur l’autre œil non opéré de l’animal. Ensuite, placez le lapin sous un microscope chirurgical sur son côté gauche, avec l’œil droit vers le haut et le nez légèrement surélevé par un pli de couverture. Désinfectez l’œil pendant une minute avec quelques gouttes de povidone iodée.

Ensuite, rincez l’œil avec du BSS stérile et couvrez la tête de l’animal avec un drapé stérile avec une ouverture oculaire prédécoupée. Placez un morceau d’incision chirurgicale collante de 12 x 17 centimètres sur l’œil et utilisez des ciseaux pour exposer l’œil avec une incision horizontale médiane. À l’aide d’un pied à coulisse inversé, déplacez l’œil en position allongée et fixez le tissu avec une suture en soie 3-0.

Ensuite, utilisez une paire de ciseaux Vannas pour inciser la conjonctive près du limbe, à environ un millimètre des vaisseaux sanguins adjacents, et élargissez la péritomie parallèlement au limbe. Séparez brutalement la conjonctive, suivie d’une incision verticale perpendiculaire de six à sept millimètres pour faire un « T » dans la conjonctive. Faites une autre petite péritomie vers la position 2 heures.

Ensuite, insérez soigneusement l’extrémité d’une lame microvitréo-rétinienne de calibre 23 à travers la sclère, pointant vers le pôle postérieur de l’œil à 3,5 millimètres du limbe en position 8 heures. Pour éviter d’élargir l’incision, rétractez lentement la lame dans la même direction et pré-placez une suture Vicryl 7-0. Ensuite, insérez une canule de perfusion latérale personnalisée dans l’ouverture sclérale et utilisez la suture pré-placée pour fixer la canule.

Réglez la pression intraoculaire à 20 à 24 millimètres de mercure. Ensuite, utilisez un trocart à tête plate de calibre 25 pour percer la sclérotique à la position 2 heures, et insérez une lampe de lustre de calibre 25 dans le port. Fixez la lumière avec du ruban adhésif et réglez-la à environ 30 % de puissance, puis ajustez-la individuellement.

Utilisez un scalpel 20 pour retirer l’épithélium cornéen œdémateux afin de faciliter une meilleure visualisation intraoculaire. Maintenant, effectuez une autre sclérotomie avec la lame microvitréo-rétinienne de calibre 23 à 10 heures et placez une suture Vicryl en forme de U 7-0 autour de la sclérotique incisée sans faire complètement le nœud. Insérez l’extrémité d’un vitrector à grande vitesse dans l’incision et commencez la vitrectomie autour de l’orifice d’entrée.

Coupez l’humeur vitrée en petits morceaux à raison d’un maximum de 2 000 à 3 000 coupures par minute, en poursuivant la vitrectomie sur le disque optique et les fibrae medullares, et en aspirant au maximum 200 millimètres de mercure. Pour séparer doucement l’humeur vitrée de la rétine, tenez le vitrecteur sur le pôle postérieur et inférieur du disque et continuez à aspirer sans couper. Lorsque le décollement postérieur du vitré est terminé, injectez par voie intravitrée environ 50 microlitres du composé d’intérêt pour visualiser le vitré flottant lors de son ablation presque totale.

Lorsque l’œil a été préparé, rincer trois fois la culture cellulaire d’implantation avec du BSS de qualité ophtalmique non supplémenté. Ensuite, remplissez une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 millimètres avec 10 millilitres de BSS de qualité ophtalmique et ajoutez l’insert de culture cellulaire dans la boîte. Centrez la boîte sous un microscope optique et utilisez une aiguille creuse ovale pointue sur mesure pour percer un substrat plat en forme de haricot de 2,4 x 1,1 millimètres avec deux bords longs et deux bords arrondis hors de la culture cellulaire.

Inondez doucement l’aiguille par le deuxième port avec BSS pour rincer l’implant dans la boîte de culture cellulaire remplie de BSS. Pour obtenir un troisième bord, faites une incision de 0,5 millilitre dans l’une des extrémités rondes de l’implant et utilisez une pince à membrane de calibre 23 pour transférer l’implant dans la station de charge sur mesure. Assurez-vous que l’implant est en position verticale, puis utilisez la pince pour pousser doucement l’implant complètement dans l’instrument de tir jusqu’à ce que tout le tissu soit fixé à l’intérieur de la pointe et placez la pointe du lanceur dans la station de chargement sous BSS jusqu’à ce que les cellules soient implantées.

Pour permettre l’implantation des cellules sous la rétine, approchez la rétine neurale avec une aiguille d’injection sous-rétinienne extensible de calibre 41 reliée à une seringue étanche au gaz et injectez du BSS sous-rétinien pour créer un décollement de la rétine de la bleb. Lorsque la bulle a un diamètre d’environ 2 à 3 disques, utilisez des ciseaux VR-ciseaux verticaux de calibre 23 pour agrandir la rétinotomie à 1,5 millimètre et utilisez un couteau d’incision de 1,4 millimètre pour étendre avec précision la sclérotomie de 10 heures à une approche de calibre 20. Ensuite, essayez de faire passer un mannequin de tir de calibre 20 à travers la sclérotomie, en élargissant l’incision si nécessaire pour assurer une transition douce mais confortable du tireur chargé.

Ensuite, passez le shooter chargé à travers l’incision sclérale à 20 à 24 millimètres de mercure jusqu’au bord de la rétinotomie et injectez l’implant sous-rétinienne à partir d’une position épirétinienne. Le tireur doit passer rapidement à travers la sclérotique du premier coup, alors assurez-vous d’une sclérotomie de taille optimale. Les cellules EPR doivent ensuite être implantées sous-rétinienne à un angle faible pour éviter de coincer le bord d’attaque de l’implant au niveau de la membrane de Bruch.

Ajustez l’implant de manière à ce qu’il soit placé sous la rétine à une distance raisonnable de la rétinotomie. Ensuite, retirez l’orifice de la sclérotomie et injectez 25 microlitres de triamcinolone à travers l’orifice du lustre. À l’aide de sutures 7-0, fermez les sclérotomies de 2 et 10 heures et vérifiez qu’il n’y a pas de fuite.

Retirez la canule de perfusion et fermez immédiatement la dernière sclérotomie avec la suture 7-0 Vicryl pré-placée. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, injectez du BSS pour ajuster la pression intraoculaire au besoin, pendant la palper. Enfin, suturez la conjonctive avec du Vicryl 7-0 et retirez la soie proptosante en prenant soin d’éviter le plexus veineux orbitaire profond.

La greffe sous la rétine a un taux de réussite chirurgicale d’environ 60 % lorsqu’une vitrectomie par forage est effectuée, qui passe à plus de 75 % lorsqu’un décollement postérieur du vitré est induit. Ici, une image de réflectance infrarouge d’un ophtalmoscope laser à balayage d’épithéliums pigmentaires rétiniens cultivés par xénotransplantation sur une membrane en polyester après une procédure sans complication est montrée, l’atrophie des photorécepteurs résultant de la réaction immunitaire apparaissant comme un halo autour de l’implant. Dans cette image de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral correspondant, on peut observer un amincissement de la couche nucléaire externe en réponse à la xénotransplantation de l’EPR, principalement dans la rétine avec une bande hyper-réfléchissante visible au-dessus de l’implant.

La rétine neurale adjacente à l’implant, cependant, présente des bandes de réflexion presque normales, suggérant une livraison atraumatique de l’implant. Comme observé par la coloration H/E, une cicatrisation sous-rétinienne et une atrophie de la couche nucléaire externe se produisent chez les lapins xénotransplantés non immunodéprimés. La membrane de Bruch sous l’implant semble également être contiguë, le choriocapillaire contenant des érythrocytes dispersés, confirmant ainsi l’absence de traumatisme subi lors de l’administration de l’implant.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si aucune complication n’est rencontrée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de créer une bulle rétinienne et une rétinotomie juste assez grandes pour s’adapter à l’implant. De plus, une intervention chirurgicale plus rapide donnera généralement de meilleurs résultats.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la tomographie par cohérence optique ou l’histologie peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que le succès de la transplantation, la biocompatibilité sous-rétinienne et la survie des cellules transplantées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie des cellules souches et des biomatériaux pour explorer l’administration sous-rétinienne de dérivés de cellules souches et/ou de substrats porteurs biofonctionnalisés pour les maladies rétiniennes, en particulier l’EPR. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une vitrectomie et une chirurgie d’implantation sous-rétinienne chez le lapin.

N’oubliez pas que travailler avec le cristallin, l’interface vitréo-rétinienne et sous-rétinienne peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu’un bon positionnement de la main, une bonne visualisation, une pression intraoculaire stable, doivent toujours être prises lors de cette procédure.