Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

L’objectif global de ce protocole est d’isoler différentes populations de cellules souches et de kératinocytes épidermiques de la peau dorsale de la souris. Ce protocole permet à l’utilisateur d’isoler simultanément plusieurs populations cellulaires de la peau dorsale de la souris. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, fiable et qu’elle peut être utilisée pour isoler des types de cellules spécifiques d’intérêt à partir d’un mélange de populations hétérogènes de cellules cutanées.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Yahav Yosefzon de mon laboratoire. Commencez par utiliser une tondeuse électrique pour raser tous les poils dorsaux d’une souris âgée de 50 à 80 jours dans la phase télogène du cycle du follicule pileux, en gardant la tondeuse aussi près que possible de la peau, sans endommager la peau et la couche sous-cutanée. Ensuite, utilisez de l’éthanol à 70 % pour désinfecter la peau et éliminer tout résidu de poils.

Placez la souris sur un pavé de dissection. Ensuite, utilisez des pinces pour soulever la peau près de la queue et entaillez la peau avec des ciseaux. Pour prélever toute la peau dorsale, coupez soigneusement le tissu dans une direction postérieure-antérieure, en séparant la peau du fascia.

Lorsque toute la peau a été enlevée, épinglez les deux bords adjacents du tissu sur un tapis de dissection, côté cheveux vers le bas. Ensuite, à l’aide d’une pince incurvée, appliquez une légère pression pour empêcher la peau de se déchirer et grattez doucement la graisse avec un scalpel émoussé jusqu’à ce que le derme soit clair et net. Lorsque toute la graisse a été retirée, placez la peau côté derme vers le bas dans une boîte de culture stérile de 100 millimètres et redressez le tissu jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de plis.

Lavez la peau avec 10 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium, en redressant à nouveau la peau si nécessaire. Ensuite, retirez le PBS et incubez le tissu dans 10 millilitres de 0,25 % de trypsine, en prenant soin que la peau soit dépliée et flotte librement. À la fin de l’incubation, à l’aide d’une pince incurvée pour maintenir la peau en place, grattez tous les poils de la peau, en commençant par la queue et en suivant la direction de la croissance des poils.

Comme les follicules ont tendance à former de petits amas, grattez de petites zones à la fois pour réduire autant que possible la taille des amas Lorsque tous les follicules pileux ont été collectés, transférez la peau glabre dans une nouvelle boîte de culture et hydratez le tissu avec 10 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium. Confirmez que tous les follicules pileux ont été enlevés.

Ensuite, utilisez un scalpel et une pince pour décomposer les follicules jusqu’à ce qu’une suspension de follicule pileux unique soit obtenue. Ensuite, triturez vigoureusement la solution de follicule pileux avec une pipette de 10 millilitres pendant quelques minutes pour briser tous les amas Transférez ensuite les cellules dans des tubes de 50 millilitres sur de la glace, pré-étiquetés avec les numéros d’animal et d’échantillon.

Maintenant, aspirez le PBS de la peau et utilisez-le pour rincer la boîte de culture cellulaire qui contenait la suspension de follicules pileux. Mélangez le lavage avec les cellules du follicule pileux et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez le premier tube de 50 millilitres et la passoire avec 10 millilitres de tampon de coloration.

Filtrez ensuite la suspension à travers une passoire de 40 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres, et lavez le deuxième tube avec cinq à 10 millilitres de tampon de coloration frais. Ensuite, faites tourner les cellules deux fois, en les lavant dans cinq millilitres de tampon de filtrage frais lors de la deuxième centrifugation. Après le deuxième essorage, remettez la pastille en suspension dans 800 microlitres de tampon de coloration frais.

Transférez ensuite 25 à 50 microlitres de cellules dans les tubes de contrôle non colorés et DAPI, et ajoutez suffisamment de tampon de coloration pour porter le volume total de chaque tube de contrôle jusqu’à 300 microlitres. Ajoutez maintenant les anticorps primaires et le DAPI dans les tubes d’échantillon appropriés et mélangez les cellules en effleurant doucement. Étiquetez les cellules pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité en les effleurant toutes les 10 minutes pour les maintenir en suspension.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec environ quatre millilitres de tampon de coloration par tube, et remettez les granules en suspension dans 800 microlitres de tampon de coloration. Filtrez ensuite les cellules dans des tubes de fax avec des capuchons de crépine pour assurer une suspension unicellulaire pendant leur analyse. Dans ces graphiques, différents modèles d’expression de surface des cellules CD34 et Sca-1 au sein de la population alpha six positif bêta un positif des cellules épithéliales cutanées sont montrés.

Les cellules ont d’abord été contrôlées en fonction de leur expression de l’intégrine alpha six et de l’intégrine bêta un. Les cellules de l’intégrine alpha six positives de l’intégrine bêta un positif ont ensuite été contrôlées en fonction de leur expression CD34 et Sca-1. Deux populations distinctes de cellules ont été observées.

Les cellules Sca-1 négatives alpha six bêta un CD34 positives, qui représentent les cellules souches du follicule pileux, et les cellules CD34 négatives alpha bêta un Sca-1 positives, qui représentent les kératinocytes épidermiques. En règle générale, 1,5 à cinq fois 10 à la cinquième alpha six bêta une cellules positives par animal ou des cellules souches du follicule pileux CD34 positives. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en environ huit heures, si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier la peau dorsale de la souris et d’isoler les cellules souches du follicule pileux et les kératinocytes épidermiques.