Name: Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie pour visualiser la régénération vasculaire hépatique chez la souris après hépatectomie partielle. Ce protocole combine injection de contraste, micro-CT et reconstruction 3D pour quantifier la croissance vasculaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient le financement par le ministère allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) via le réseau de biologie des systèmes « Virtual Liver », numéros de subvention 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). Les auteurs remercient également Frank Schubert pour son soutien technique.

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Allemagne. Étant donné que le système veineux porte a été visualisée séparément du système veineux hépatique, des animaux séparés ont été nécessaires pour les différents arbres vasculaires. 1. Réactifs Préparation <ol><li> solution saline Héparine <ol><li> Ajouter 0,1 ml d&#39;héparine dans 10 ml de sérum physiologique (5 UI / ml). </li></ol></li><li> mélange de composés de silicone <ol><li> Ajouter 2 ml MV-120 dans un tube de 5 ml. Diluer MV-120 en ajoutant 3 ml de diluant MV résultant en une solution à 40%. </li></ol></li></ol> Injection 2. Portal Venous système silicone <ol><li> laparotomie <ol><li> Placer la souris dans la chambre d&#39;induction de l&#39;anesthésie et anesthésier avec 2% d&#39;isoflurane et de 0,3 L / min d&#39;oxygène. </li><li> Fixer la souris anesthésiée sur la table d&#39;opération en utilisant du ruban à l&#39;inhalation continue de 2% estoflurane et 0,3 L / min d&#39;oxygène. Vérifiez l&#39;orteil-pincement réflexe de retrait de la souris et lancez l&#39;opération si le réflexe est absent. </li><li> Faire une incision transversale sur l&#39;abdomen à l&#39;aide de ciseaux pour la couche de peau et un coagulateur électrique pour la couche musculaire. Déplacer les intestins sur le côté gauche à l&#39;aide des conseils de coton et de couvrir les intestins avec une solution saline gaze imbibée. </li></ol></li><li> l&#39;insertion du cathéter <ol><li> Disséquer la veine porte sous le microscope en utilisant des micro-pinces. Placer une suture de soie 6-0 sous la veine extrahépatique, dans environ 1 mm de distance de sa bifurcation et l&#39;attacher lâchement pour une utilisation ultérieure. </li><li> Injecter solution préparée à l&#39;héparine-solution saline via pénienne veine (mâle) ou veine cave inférieure (femelle) pour héparinisation systémique pendant 5 min. </li><li> Insérez la jauge 26 (26 G) cathéter avec aiguille dans la veine porte et le fixer avec une pince </li></ol></li><li> Heparin-solution saline et composé de silicone perfusion <ol><li> Charge héparine-solution saline solution dans 5 ml seringue et tourner sur le dispositif de perfusion. Remplir complètement le cathéter avec une solution saline à l&#39;héparine pour éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Raccorder le tube d&#39;extension au cathéter et les fixer fermement. Démarrer la perfusion saline à l&#39;héparine avec un débit de 0,4 ml / min de perfusion. </li><li> Ligaturer suture 6-0 soie pré-placée pour fixer le double du cathéter et bloquant le flux sanguin de la veine splénique et de la veine mésentérique. Euthanatize la souris par exsanguination par perfusion sous anesthésie. </li><li> Rincez le foie en utilisant une solution saline pendant toute la procédure de perfusion afin de le garder humide. </li><li> Ajouter 0,1 ml durcisseur dans le tube MV-120. Changer la seringue d&#39;héparine-solution saline à la seringue de silicone. </li><li> Lancer silicone perfusion avec un débit de perfusion de 0,2 ml / min pendant environ 1 min à préremplir le système de cathéter et pour remplir le système de la veine porte. Arrêtez silicone perfusion lorsque les vaisseaux à la surface deviennent bleus. </li></ol></li><li> Échantillonnage <ol><li> Gardez le foie in situ until le silicone est polymérisée complètement au bout d&#39;environ 15 à 30 min. Disséquer ligaments reliant le foie et les organes adjacents avec soin de garder le foie intact. Explanter le foie et le mettre dans le formol pour la fixation. </li></ol></li></ol> Injection 3. hépatique système veineux silicone <ol><li> Effectuer laparotomie comme effectué à l&#39;étape 2.1 et exposer champ opératoire entièrement. </li><li> l&#39;insertion du cathéter <ol><li> Disséquer la veine porte sous le microscope en utilisant des micro-pinces. Placer une suture de soie 6-0 sous la veine extrahépatique, dans environ 1 mm de distance de sa bifurcation et l&#39;attacher lâchement pour une utilisation ultérieure. </li><li> Injecter solution préparée à l&#39;héparine-solution saline via pénienne veine (mâle) ou veine cave inférieure (femelle) pour héparinisation systémique pendant 5 min. </li><li> Insérez un 26 G cathéter (cathéter 1) avec l&#39;aiguille dans la veine porte et le fixer avec une pince. Insérez un autre 26 G cathéter (cathéter 2) avec l&#39;aiguille dans la veine cave inférieure et le fixer avec une pince. </li><li> Ligaturer les branches de la veine cave inférieure (y compris les veines rénales gauche et droite) et son extrémité distale à l&#39;aide 6-0 synthétique monofilament, polypropylène non absorbable suture. </li></ol></li><li> Heparin-solution saline et composé de silicone perfusion <ol><li> Chargez une solution d&#39;héparine-solution saline dans 5 ml seringue et tourner sur le dispositif de perfusion. Remplir complètement le cathéter 1 avec une solution saline à l&#39;héparine pour éviter les bulles d&#39;air. Raccorder le tube d&#39;extension pour cathéter 1 et le fixer solidement. Lancer héparine-solution saline perfusion à un débit de 0,4 ml / min. </li><li> Ligaturer suture 6-0 soie pré-placée pour fixer le double du cathéter et bloquant le flux sanguin de la veine splénique et de la veine mésentérique. Euthanatize la souris par exsanguination par perfusion sous anesthésie. </li><li> Rincez le foie en utilisant une solution saline pendant toute la procédure de perfusion afin de le garder humide. Ajouter 0,1 ml durcisseur dans le tube MV-120. Échange héparine-solution saline seringue avec une seringue de silicone. </li><li> Placez une pince sur le suprahepatic veine cave inférieure pour obstruer l&#39;écoulement du foie. </li><li> Connecter le tube d&#39;extension au cathéter 2 et commencer silicone perfusion avec un débit de perfusion de 0,2 ml / min pendant environ 2 min pour atteindre un volume vasculaire hépatique objectif tel que rapporté. Arrêtez silicone perfusion lorsque les vaisseaux à la surface deviennent bleus. </li></ol></li><li> Échantillonnage <ol><li> Disséquer ligaments hépatiques évitant toute blessure au foie. Explanter le foie et le mettre dans le formol pour la fixation. </li></ol></li></ol> 4. Micro-CT (μCT) Numérisation Pour analyser l&#39;échantillon de foie explanté utilisant μCT, les étapes suivantes sont nécessaires. <ol><li> Prélever l&#39;échantillon de foie de la solution de fixation. Placez le foie sur le lit μCT. Mettez le lit μCT avec l&#39;échantillon de foie dans le μCT. </li><li> Acquérir topogramme avant de commencer l&#39;analyse. Utilisez un sous-balayage pour le petit échantillon de foie et deux sous-balayages pour les grands échantillons. </li><li> Sélectionner un81; le protocole CT avec une résolution élevée (par exemple, HQD-6565-390-90). Ce protocole acquiert 720 projections avec 1032 x 1012 pixels au cours d&#39;une rotation complète avec le temps de 90 s par sous-balayage balayage. Démarrez le scan μCT. </li></ol> 5. Les articles série histologiques <ol><li> Incluez l&#39;échantillon de foie dans la paraffine dans son ensemble après la numérisation μCT. Découper l&#39;échantillon de paraffine dans l&#39;ensemble des sections de 4 pm, conduisant à une série de 2 000 à 2 500 parties. </li><li> sections de tache avec la technique de coloration appropriée pour visualiser les événements moléculaires d&#39;intérêt tels que Ki-67 comme marqueur de prolifération et HMGB1 comme marqueur des lésions ischémiques. Déterminer la séquence de la coloration à l&#39;égard à la question scientifique. </li><li> Utilisez tout un scanner de diapositives à digitaliser les coupes colorées. </li><li> Effectuer 3D-reconstruction de l&#39;arbre (s) vasculaire (déjà possible) et de visualiser en 3D la distribution d&#39;événements moléculaires en ce qui concerne l&#39;arbre vasculaire (recherche en cours). </li></ol>

<ol><li>Bearden, S. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+alignment+in+adult+mouse+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles.</a> Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).</li>
<li>Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+parameter+values+for+physiologically+based+pharmacokinetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.Ind.Health%22%5BJournal%5D)">Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models.</a> Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).</li>
<li>Dai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-Induced+Intracranial+Dolichoectasia+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice.</a> Neurosurgery. , (2015).</li>
<li>Ding, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+angiocrine+signals+from+sinusoidal+endothelium+are+required+for+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration.</a> Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).</li>
<li>Downey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ex-vivo+micro-computed+tomographic+imaging+of+blood+vessels+and+necrotic+regions+within+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors.</a> PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2-dependent+infiltrating+macrophages+promote+angiogenesis+in+progressive+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+quantitative+measures+describing+micromorphology+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization.</a> Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci.Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microCT-FMT+imaging+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis.</a> J.Vis.Exp. (100), (2015).</li>
<li>Jing, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiomorphometric+quantitative+analysis+of+vasculature+utilizing+micro-computed+tomography+and+vessel+perfusion+in+the+murine+mandible%5BTitle%5D)+AND+%22Craniomaxillofac.Trauma+Reconstr%22%5BJournal%5D)">Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible.</a> Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).</li>
<li>Melloul, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+magnetic+resonance+imaging%3A+an+efficient+tool+to+assess+liver+volume+and+intrahepatic+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy.</a> J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).</li>
<li>Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+histological+whole+slide+images+guided+by+vessel+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.Pathol.Inform%22%5BJournal%5D)">Registration of histological whole slide images guided by vessel structures.</a> J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).</li>
<li>Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vasculature+for+liver+surgical+planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.Med.Imaging%22%5BJournal%5D)">Analysis of vasculature for liver surgical planning.</a> IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).</li>
<li>Shergill, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+of+VEGF-+and+NO-dependent+angiogenesis+does+not+impair+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Regul.Integr.Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration.</a> Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).</li>
<li>Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide+2+increases+efficacy+of+distraction+enterogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis.</a> J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+and+imaging+techniques+to+study+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration.</a> Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).</li>
<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Contrastante l&#39;arbre vasculaire par injection de silicone et de balayage μCT a été introduit dans des modèles de tumeurs et des modèles de maladies neurologiques fréquemment pour étudier la progression angiogénique 5,7,8,10. Améliorations à la méthode de l&#39;injection de silicone ont été faites dans la présente étude pour la visualisation et la quantification de la croissance vasculaire après hépatectomie partielle chez la souris. Il y a un certain nombre d&#39;étapes critiq...

La régénération du foie est souvent déterminée en mesurant l&#39;augmentation du poids du foie et de volume et en évaluant le taux de prolifération des hépatocytes 16. Cependant, la régénération du foie est non seulement induit la régénération parenchymateuse mais aussi la régénération vasculaire 6. Par conséquent, la croissance vasculaire doit être étudiée plus avant en ce qui concerne son rôle dans la progression de la régénération du foie. Visualisation du système vasculaire hépatique est essentielle pour faire progresser notre compréhension de la régénération vasculaire. De nombreuses méthodes indirectes ont été développées pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la régénération vasculaire hépatique. Traditionnellement, la détection des cytokines (facteur de croissance vasculaire endothéliale, VEGF) 14, les chimiokines et leurs récepteurs (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 ont été le pilier pour étudier la régénération vasculaire. Cependant, un modèle 3D conjointement avec l&#39;analyse quantitative de la vasculature ajouterait anatomique critiqueinformations pour acquérir une meilleure compréhension de la relation importante entre parenchyme hépatique et la régénération vasculaire. Pour visualiser le système vasculaire du foie, ce qui nécessite contrastante les arbres vasculaires, les souris ont reçu une injection d&#39;un agent de contraste radio-opaque caoutchouc de silicone directement dans le portail ou un arbre vasculaire veineux hépatique. Après polymérisation de la silicone et de l&#39;explantation de l&#39;organe, les échantillons de foie ont été soumis à un balayage μCT en utilisant un scanner CT. Les analyses ont donné lieu à voxel images représentations de la silicone d&#39;injection 9 spécimens. Pour le contrôle qualité, le système vasculaire a été visualisé en premier en 3D en utilisant le logiciel pré-clinique. La segmentation a été effectuée en fixant un seuil entre l&#39;intensité des tissus mous et l&#39;intensité de la cuve. Le masque de cuve résultant a été visualisé en utilisant le rendu de surface. Le logiciel a également permis la détermination manuelle de deux paramètres de vasculcroissance ar: longueur maximale du navire et le rayon. Un logiciel préclinique a été ensuite utilisé pour la reconstruction 3D des arbres vasculaires et le calcul ultérieur des territoires vasculaires alimentant ou drainant 13. De plus, ce logiciel détermine automatiquement certains paramètres de la croissance vasculaire, tels que la longueur totale de toutes les structures vasculaires visibles également connu sous le nom de longueur d&#39;arête ou le volume total de la cuve totale. La procédure de silicone de perfusion a été réalisée chez des souris naïves et chez les souris ayant subi une hépatectomie partielle de 70% (PH). Les foies ont été prélevés à différents temps d&#39;observation après résection pour l&#39;analyse vasculaire et parenchymateuse régénération du foie en utilisant la technique de visualisation et de quantification précitée. Les objectifs principaux de ce film sont les suivants: (1) démontrer l&#39;injection technique délicate nécessaire pour atteindre contraste optimal et (2) montrent le potentiel fr profit qui en résulteom une analyse détaillée de l&#39;échantillon résultant en utilisant μCT et coupes en série histologiques. Après avoir vu ce film, le lecteur devrait avoir une meilleure compréhension de la façon d&#39;injecter composé de silicone dans un système vasculaire spécifique et de l&#39;utilité et l&#39;applicabilité de la technique.

<table><tbody><tr><td>PERFUSOR&reg ; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg ;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>micro ciseaux</td><td>Outils de science fine (F&middot ; S&middot ; L)</td><td>N° 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Outils pour les sciences fines (F&middot ; S&middot ; L)</td> <td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinces applicateur</td><td>Outils de science fine (F&middot ; S&middot ; L)</td><td>N° 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pince droite</td><td>Outils de science fine (F&middot ; S&middot ; L)</td><td>N° 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pince incurvée</td><td>Outils de sciences fines (F&middot ; S&middot ; L)</td><td>N° 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>porte-aiguille</td><td>Outils de sciences fines (F&middot ; S&middot ; L)</td><td>N° 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 5 ml</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Lignes d’extension et de raccordement</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, intérieur & oslash ; 1,2 mm</td></tr><tr><td>6-0 soie (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg ; Diluant MV</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg ; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (bleu)</td><td></td></tr><tr><td>MV Agent de durcissement</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Héparine 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td><td></td></tr><tr><td>Imalytics Logiciel préclinique</td><td>Imagerie moléculaire expérimentale, Université RWTH d’Aix-la-Chapelle, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, Brême, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp ; Scanner de diapositives numérique</td><td>Hamamatsu Electronic Press, Japon&nbsp ;</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>Tomoscope Duo CT&nbsp ;</td><td>CT Imaging GmbH, Erlangen, Allemagne</td><td>TomoScope&reg ; &nbsp ; Synergie</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des vasculaire et parenchymateuse régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Un procédé d&#39;injection de silicone modifié a été utilisé pour la visualisation de l&#39;arbre vasculaire hépatique. Cette procédure est composée d&#39; une injection in vivo du composé de silicone, par l&#39; intermédiaire d&#39; un cathéter 26 G, dans le portail ou la veine hépatique. Après l&#39; injection de silicone, les organes ont été explantées et préparés pour les micro-CT (μCT) à balayage ex vivo. La procédure d&#39;injection de silicone est techniquement difficile. La réalisation d&#39;un résultat positif nécessite une vaste expérience de microchirurgie du chirurgien. L&#39;un des défis de cette procédure consiste à déterminer le taux de perfusion adéquate pour le composé de silicone. Le taux de perfusion du composé de type silicone doit être définie sur la base de l&#39;hémodynamique du système vasculaire d&#39;intérêt. débit de perfusion inappropriée peut conduire à une perfusion incomplète, la dilatation artificielle et rupture des arbres vasculaires. La reconstruction en 3D du système vasculaire a été basée sur des tomodensitogrammes et a été réalisée en utilisantun logiciel pré-clinique tel que HepaVision. La qualité de l&#39;arbre vasculaire reconstruit était directement liée à la qualité de silicone perfusion. paramètres vasculaires suite calculés indiquant la croissance vasculaire, tels que le volume vasculaire total ont été calculées sur la base des reconstructions vasculaires. Contrastant l&#39;arbre vasculaire avec du silicone permis ultérieure histologique travail-up de l&#39;échantillon après la numérisation μCT. L&#39;échantillon peut être soumis à des coupes sériées, l&#39;analyse histologique et de numérisation de diapositives ensemble, et par la suite à la reconstruction en 3D des arbres vasculaires à partir d&#39;images histologiques. Ceci est la condition sine qua non pour la détection d&#39;événements moléculaires et de leur distribution par rapport à l&#39;arbre vasculaire. Ce procédé d&#39;injection de silicone modifiée peut également être utilisée pour visualiser et reconstruire les systèmes vasculaires des autres organes. Cette technique a le potentiel d&#39;être largement appliquée à des études concernant l&#39;anatomie vasculaire et la croissance dans différents animaux undes modèles de maladies nd.

Critères de qualité La qualité de l&#39;injection de silicone peut être évaluée à l&#39;oeil nu pendant la procédure. Les petits vaisseaux à la surface du foie se remplissent progressivement avec le composé bleu. Si la structure vasculaire normale a été observée sur la surface du foie, la qualité de l&#39;injection de caoutchouc de silicone était bonne. Si le volume de perfusion était insuffisant, les petits v...

Les outils utilisés pour visualiser la régénération vasculaire nécessitent des méthodes pour contraster les arbres vasculaires. Ce film a démontré une technique d’injection délicate utilisée pour obtenir un contraste optimal des arbres vasculaires et illustre les avantages potentiels résultant d’une analyse détaillée de l’échantillon résultant à l’aide de coupes en série μCT et histologiques.

Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Visualisation de la régénération vasculaire et parenchymateuse après une hépatectomie partielle de 70 % chez des souris normales. Traditionnellement, la régénération hépatique est évaluée en mesurant l'augmentation du poids et du volume du foie, ainsi qu'en déterminant le taux de prolifération des hépatocytes. De nos jours, nous nous intéressons à la régénération vasculaire du foie chez la souris et souhaitons visualiser et quantifier la croissance vasculaire.Ainsi, nous établissons le flux de travail pour l'imagerie de la régénération vasculaire. Ce flux de travail comprend quatre étapes : la mise en contraste de l'arbre vasculaire, l'acquisition de coupes tomodensitométriques, la reconstruction 3D, et l'analyse quantitative et qualitative des images obtenues. Le flux de travail commence par la mise en contraste de l'arbre vasculaire.Tout d'abord, nous exposons le foie, soit normal, soit résecté, puis nous injectons le composé de contraste au silicone polymérisable soit dans la veine porte, soit dans la veine hépatique, selon le système vasculaire étudié. Ensuite, les foies explantés sont analysés par micro-TDM. Après l'acquisition des images, nous réalisons une reconstruction vasculaire 3D à l'aide du logiciel préclinique Imalytics.Si la qualité technique des images obtenues est suffisante, une reconstruction 3D peut être réalisée à l'aide de HepaVision. Ce programme est utilisé en clinique pour la planification de la chirurgie hépatobiliaire. En plus de la visualisation 3D de l'arbre vasculaire, ce logiciel permet la visualisation et le calcul du volume hépatique, du foie entier ainsi que de chaque lobe, en se basant sur les vaisseaux fournisseurs et de drainage.Après la reconstruction, nous pouvons déterminer des paramètres supplémentaires indiquant la croissance vasculaire, tels que la longueur et le diamètre d'un vaisseau spécifique, à l'aide de techniques informatiques. Cela permettra une description quantitative de la croissance vasculaire. D'autre part, les échantillons de Microfil fixés au formol peuvent être coupés en sections sérielles.Les coupes sérielles peuvent être colorées et numérisées à l'aide d'un scanner de lame entière. Après un recalage rigide et élastique des coupes sérielles, les arbres vasculaires tridimensionnels des systèmes veineux porte et veineux hépatique peuvent être reconstruits. Dans une étape ultérieure, nous souhaitons explorer la distribution spatiale des événements moléculaires.Un exemple d'événement moléculaire d'intérêt dans la régénération hépatique est l'apparition du marqueur de prolifération Ki-67 dans les noyaux des hépatocytes et sa distribution spatiale au sein des arbres vasculaires reconstruits en 3D. Ensuite, nous allons donner une introduction détaillée sur la manière d'effectuer l'injection de Microfil. Préparation des réactifs.Pour le mélange composé de Microfil, nous avons besoin du diluant MV, du composé MV, dans notre cas, le MV-120 bleu, et de l'agent de durcissement. Nous avons également besoin de pipettes, d'un tube et d'une pipette. Préparez deux millilitres de MV-120 dans un tube de cinq millilitres.Ensuite, diluez en ajoutant trois millilitres de diluant MV. Mélangez en agitant doucement. Pour la solution de sérum salé hépariné, ajoutez 1 millilitre d'héparine dans 10 millilitres de sérum salé.Préparation de la table d'opération. Tout d'abord, nous avons besoin d'un microscope, ensuite, d'une série de consommables. Des fils de suture en soie 6-0 et en polypropylène 6-0, des seringues de cinq millilitres et d'un millilitre, des aiguilles de calibre 30 et de calibre 21, un tube d'extension pour relier la seringue au cathéter, un cathéter de calibre 26 avec insertion par aiguille, des embouts en coton et de la gaze.Troisièmement, des instruments chirurgicaux sont nécessaires. Des instruments microchirurgicaux, des pinces et un coagulateur électrique. Quatrièmement, une pompe de perfusion est nécessaire.Préparation de l'animal. Placer la souris dans la chambre d'induction d'anesthésie et anesthésier la souris avec 2 % d'isoflurane et 0,3 millilitre par minute d'oxygène. Fixer la souris anesthésiée sur la table d'opération à l'aide de rubans adhésifs, avec une inhalation continue de 2 % d'isoflurane et de 0,3 millilitre par minute d'oxygène.Injection de microfil, système veineux porte. Réaliser une incision transversale sur l'abdomen à l’aide de ciseaux pour la couche cutanée et d’un électrocoagulateur pour la couche musculaire. Déplacer les intestins vers le côté gauche à l’aide de coton-tiges et recouvrir les intestins avec un pansement imbibé de sérum physiologique.Dissez la veine porte au microscope. Placez une suture en soie 6-0 sous la veine porte extra-hépatique à environ un millimètre de sa bifurcation. Serrez-la légèrement pour une utilisation ultérieure.Injectez la solution de sérum salin hépariné par voie veineuse pénienne pour une héparinisation systémique pendant cinq minutes. Cette animation démontrera la procédure d'insertion du cathéter. Tout d'abord, placez la suture en soie 6-0 sous la veine porte extra-hépatique, puis insérez le cathéter de calibre 26 dans la veine porte et fixez-le à l’aide d’une pince.Lier la suture préalablement placée pour fixer le cathéter et bloquer l'écoulement sanguin provenant de la veine splénique et de la veine mésentérique. Nous allons ici démontrer la procédure chirurgicale. Insérer le cathéter de calibre 26 avec aiguille.Insérez davantage le cathéter et retirez lentement l'aiguille en même temps. Fixez le cathéter à l'aide d'une pince. Remplissez complètement le cathéter avec une solution de sérum salé hépariné afin d'éviter les bulles d'air.Connecter le tube d'extension au cathéter et les fixer solidement. Mettre en marche la pompe de perfusion. Commencer la perfusion de sérum salé hépariné avec un débit de 0,4 millilitre par minute.Observer les lobes droits devenir pâles immédiatement après la perfusion. Rincer le foie à l'aide de solution saline pour le maintenir humide pendant toute la procédure de perfusion. Euthanasier la souris par exsanguination via la perfusion sous anesthésie.Poursuivre la perfusion d'héparine pendant plusieurs minutes jusqu'à ce que tout le foie devienne pâle. Avant la perfusion au Microfil, ajouter 0,1 millilitre d'agent de réticulation au composé Microfil préparé afin d'accélérer le processus de polymérisation. Charger le composé Microfil dans une seringue de cinq millilitres et dans un tube d'extension.Éliminer les bulles d'air en injectant la solution de sérum salé hépariné dans le cathéter, comme précédemment. Connecter le tube au cathéter et le fixer solidement. Commencer l'injection de Microfil à un débit de 0,2 millilitre par minute pendant environ une à deux minutes.Observer l'agent bleu se répandre lentement dans les branches de la veine porte. Arrêter la perfusion lorsque la structure vasculaire bleue apparaît à la surface de chaque lobe hépatique, comme indiqué par un cercle rouge. Laisser le foie reposer pendant au moins 15 minutes pour permettre la polymérisation du composé Microfil.Injection de microfil, système veineux hépatique. La procédure suit essentiellement les mêmes étapes que l'injection dans le système veineux porte. Placer un ligature en soie 6-0 sous la veine porte extra-hépatique à environ un millimètre de sa bifurcation.Insérez ensuite un cathéter dans la veine porte et fixez-le à l’aide d’une pince. Insérez un autre cathéter dans la veine cave inférieure et fixez-le également avec une pince. Ligez la suture préalablement placée afin de fixer le cathéter et bloquer le flux sanguin provenant de la veine splénique et de la veine mésentérique.Placer une pince sur la veine cave inférieure sus-hépatique pour obstruer l'écoulement du foie. Liger les branches de la veine cave inférieure, y compris les deux veines rénales et l'extrémité distale de la veine cave inférieure. Rincer le foie à l'aide d'une solution saline héparinée par le cathéter un.Perfuser le système veineux hépatique avec le composé Microfil par le cathéter deux. Résultats, reconstruction Micro CT. Nous avons obtenu des reconstructions vasculaires 3D à l'aide du logiciel préclinique Imalytics après un balayage Micro CT.La régénération vasculaire dans les systèmes veineux porte et hépatique est apparue sous forme d'allongement et d'élargissement des structures vasculaires principales combinés à l'émergence de vaisseaux plus petits. Au deuxième jour postopératoire, les arbres vasculaires des lobes résiduels se sont allongés. Au septième jour postopératoire, de nouvelles petites branches issues de la même veine porte principale et de la veine hépatique sont devenues visibles.Résultats, reconstruction codée en couleurs en 3D de l'arbre vasculaire hépatique et des territoires hépatiques dépendants. Chaque lobe du foie a été facilement visualisé en trois dimensions après la reconstruction codée en couleurs par HepaVision. Comme indiqué dans le tableau, les volumes hépatiques du foie entier et de chaque lobe ont été déterminés, comme illustré ici, pour le système veineux hépatique d'un foie normal.Résultats, sections sériées et reconstruction. D'autre part, l'échantillon Microfil fixé au formol a été soumis à une sectionnement sérié. Les sections sériées colorées ont été numérisées à l'aide d'un scanner de diapositives complet et utilisées pour la reconstruction de l'arbre vasculaire des deux systèmes.Il s'agit de coupes transversales d'une série de sections sériées de foie de souris avant et après recalage rigide et élastique. Après le recalage informatique, les systèmes veineux porte et veineux hépatique peuvent être reconstruits en un seul modèle 3D. Cette étape, qui est longue à effectuer manuellement et par calcul, nécessite une optimisation supplémentaire.L'étape suivante, à savoir la visualisation de la distribution spatiale des événements moléculaires par rapport aux arbres vasculaires, est actuellement en cours de développement. Cette étape pourrait être envisagée comme une fusion des informations de micro-TDM issues de l'arbre vasculaire contrasté avec des informations histologiques, ou comme une visualisation 3D d'informations purement histologiques. Dans ce cas, les informations de micro-TDM serviraient de contrôle qualité pour la reconstruction 3D, basée sur l'histologie, qui est une méthode exigeante.Une fois obtenu, nous disposons d'un outil permettant d'étudier plus efficacement la régénération hépatique, en particulier la distribution spatiale des événements moléculaires et du parenchyme hépatique par rapport à la régénération vasculaire.

visualization-vascular-parenchymal-regeneration-after-70-partial

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Nous avons décrit un protocole permettant d’effectuer une hépatectomie partielle (PHx) et la transplantation de cellules par l’intermédiaire de rate en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris. Dans ce protocole, une incision est faite pour exposer et résection du lobe gauche du foie suivi d’une autre incision pour la transplantation intra-splénique de cellules.

Intra-splénique Transplantation d’hépatocytes après hépatectomie partielle en clin de œil. Souris SCID

Nous présentons ici une nouvelle méthode pour la résection partielle du lobe hépatique gauche chez les souris néonatales (jour 0). Ce nouveau protocole est convenable pour l’étude d’atteinte hépatique aiguë et réponse de blessures dans le cadre néonatal.

Une hépatectomie partielle lobulaire : Un modèle chirurgical pour la régénération du foie morphologique

Nous établissons une nouvelle technique chirurgicale pour un modèle de perfusion in vivo seul lobe de foie de rat comme une condition sine qua non pour étudier plus en vivo foie partielle d’ingénierie à l’avenir.

Une nouvelle Technique chirurgicale comme fondement pour In Vivo partielle génie hépatique chez le Rat

Ce protocole décrit la procédure pour enlever le lobe ventral du foie dans le poisson zèbre adulte pour permettre l’étude de la régénération de foie.

Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Les hépatocytes chargés de lipides sont inhérents à la régénération du foie, mais sont généralement perdus lors de la centrifugation par gradient de densité. Ici, nous présentons un protocole d’isolement cellulaire optimisé qui conserve les hépatocytes stéatotiques, produisant des populations représentatives d’hépatocytes en régénération après hépatectomie partielle chez la souris.

Isolement des hépatocytes régénérants après hépatectomie partielle chez la souris

Dans ce protocole, nous discutons de la mise en œuvre d’un modèle de transplantation hépatique orthotopique réussie (OLT) chez la souris. De plus, les adjuvants permettant d’analyser plus en détail la perméabilité de l’allogreffe après une OLT réussie chez une souris sont également discutés, en particulier à l’aide de la microtomodensitométrie (microCT).

Transplantation hépatique orthotopique réussie chez la souris à l’aide de l’angiographie par microtomodensitométrie

Il a été démontré que l’association de la partition hépatique et de la ligature de la veine porte pour l’hépatectomie échelonnée (ALPPS) entraîne une régénération hépatique remarquable plusieurs semaines après la première étape de la chirurgie. Des modèles animaux ayant subi l’ALPPS ont été développés pour explorer la capacité potentielle de régénération du foie et obtenir des résultats cliniques favorables.

Modèle murin de l’association de la partition hépatique et de la ligature de la veine porte pour une procédure d’hépatectomie échelonnée assistée par microscopie

Ce protocole fournit des informations techniques pour la reconstruction vasculaire à l’aide de la technique du brassard dans la transplantation hépatique orthotopique de souris.

Reconstruction vasculaire avec la technique du brassard dans la transplantation hépatique orthotopique de souris

Les organoïdes générés à partir des tumeurs des patients sont injectés orthotopiquement dans le foie de la souris. La résection du tissu hépatique non tumoral conduit à un environnement régénérateur dans le tissu hépatique où se trouve la tumeur.

Un modèle de xénogreffe organoïde dérivé d’un patient atteint d’un cancer hépatocellulaire pour étudier l’impact de la régénération hépatique sur la croissance tumorale

Le modèle murin d’hépatectomie partielle de 2/3 (66 %) est bien décrit dans la littérature, mais les hépatectomies plus étendues imitant le syndrome de petite taille après une transplantation hépatique ont rarement été utilisées. Nous décrivons une procédure d’hépatectomie prolongée à 78 % dans un modèle murin qui entraîne une létalité postopératoire d’environ 50 % chez des souris saines.

Hpatectomie prolongée à 78 % dans un modèle chirurgical de souris

Ce protocole présente un pipeline d’imagerie complet pour visualiser et modéliser la morphologie des cellules étoilées hépatiques dans le tissu hépatique intact. Cette approche combine le marquage fluorescent des fibroblastes utilisant la génétique de la souris, une préparation tissulaire in situ basée sur la perfusion hépatique, et une méthode modifiée de nettoyage tissulaire iDISCO pour obtenir une transparence optique.

Cartographie de la morphologie des cellules étoilées hépatiques dans des modèles murins de fibrose hépatique

Découvrez une méthode d'imagerie pour visualiser la régénération vasculaire hépatique chez la souris après hépatectomie partielle. Ce protocole combine injection de contraste, micro-CT et reconstruction 3D pour quantifier la croissance vasculaire.

Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

Explorer plus de vidéos