Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

Visualisation de la régénération vasculaire et parenchymateuse après une hépatectomie partielle de 70 % chez des souris normales. Traditionnellement, la régénération hépatique est évaluée en mesurant l’augmentation du poids et du volume du foie ainsi qu’en déterminant le taux de prolifération des hépatocytes. De nos jours, nous nous intéressons à la régénération vasculaire du foie chez la souris et souhaitons visualiser et quantifier la croissance vasculaire.

Ainsi, nous établissons le flux de travail pour l’imagerie de la régénération vasculaire. Le flux de travail se compose de quatre étapes : le contraste de l’arbre vasculaire, l’acquisition de tomodensitogrammes, la reconstruction 3D et l’analyse quantitative et qualitative des images résultantes. Le flux de travail commence par le contraste de l’arbre vasculaire.

Tout d’abord, nous exposons le foie, qu’il soit normal ou réséqué, puis nous injectons le composé de contraste de silicone polymérisant dans la veine porte ou la veine hépatique, en fonction du système vasculaire d’intérêt. Ensuite, les foies explantés sont soumis à un balayage dans un MicroCT. Après le scan, nous effectuons une reconstruction vasculaire 3D à l’aide du logiciel préclinique Imalytics.

Si la qualité technique des images résultantes est suffisamment bonne, la reconstruction 3D peut être effectuée à l’aide d’HepaVision. Ce programme est utilisé dans les cliniques pour la planification de la chirurgie hépatobiliaire. En plus de la visualisation 3D de l’arbre vasculaire, ce programme permet de visualiser et de calculer le volume du foie, du foie total et de chaque lobe, en fonction des vaisseaux d’alimentation et de drainage.

Après la reconstruction, nous pouvons déterminer des paramètres supplémentaires indiquant la croissance vasculaire tels que la longueur et le diamètre d’un vaisseau spécifique à l’aide de techniques informatiques. Cela permettra une description quantitative de la croissance vasculaire. D’autre part, les échantillons Microfil fixés au formol peuvent être coupés en sections en série.

Les coupes en série peuvent être colorées et numérisées à l’aide d’un scanner de lames entières. Après l’enregistrement rigide et élastique des coupes en série, des arbres vasculaires 3D des systèmes veineux portes et hépatiques peuvent être reconstruits. Dans une étape future, nous voulons explorer la distribution spatiale des événements moléculaires.

Un exemple d’événement moléculaire d’intérêt dans la régénération hépatique est l’apparition du marqueur de prolifération Ki-67 dans les noyaux d’hépatocytes et sa distribution spatiale dans les arbres vasculaires reconstruits en 3D. Ensuite, nous allons donner une introduction détaillée sur la façon d’effectuer l’injection de Microfil. Préparation des réactifs.

Pour le mélange de composés Microfil, nous avons besoin d’un diluant MV, d’un composé MV, dans notre cas, du MV-120 bleu, et d’un agent de durcissement. Nous avons également besoin de pipettes, d’un tube et d’un pipeteur. Préparez deux millilitres MV-120 dans un tube de cinq millilitres.

Ensuite, diluez-le en ajoutant trois millilitres de diluant MV. Mélangez-les en secouant doucement. Pour une solution saline d’héparine, ajoutez 1 millilitre d’héparine dans 10 millilitres de solution saline.

Préparation de la table d’opération. Premièrement, nous avons besoin d’un microscope, deuxièmement, d’un ensemble de consommables. Sutures en soie 6-0 et 6-0 en polypropylène, seringues de cinq millilitres et d’un millilitre, aiguilles de calibre 30 et 21, tube d’extension pour connecter la seringue et le cathéter, cathéter de calibre 26 avec insertion d’aiguille, embouts en coton et gaze.

Troisièmement, des instruments chirurgicaux sont nécessaires. Micro-instruments, pinces et coagulateur électrique. Quatrièmement, une pompe de perfusion est nécessaire.

Préparation de l’animal. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie et anesthésez-la avec de l’isoflurane à 2 % et de l’oxygène à 0,3 millilitre par minute. Fixez la souris anesthésiée sur la table d’opération à l’aide de rubans, avec une inhalation continue de 2 % d’isoflurane et de 0,3 millilitre par minute d’oxygène.

Injection de microfil, système veineux porte. Faites une incision transversale sur l’abdomen à l’aide de ciseaux pour la couche cutanée et d’un coagulateur électrique pour la couche musculaire. Sortez les intestins vers le côté gauche à l’aide d’embouts en coton et couvrez les intestins avec de la gaze imbibée de solution saline.

Disséquez la veine porte au microscope. Placez une suture en soie 6-0 sous la veine porte hépatique supplémentaire à une distance d’environ un millimètre de sa bifurcation. Attachez-le sans serrer pour une utilisation ultérieure.

Injectez la solution saline d’héparine par une veine du pénis pour une héparinisation systémique pendant cinq minutes. Cette animation montrera la procédure d’insertion du cathéter. Tout d’abord, placez la suture en soie 6-0 sous la veine porte hépatique supplémentaire, puis insérez le cathéter de calibre 26 dans la veine porte et fixez-le à l’aide d’une pince.

Lister la suture pré-placée pour fixer le cathéter et bloquer le flux sanguin de la veine splénique et de la veine mésentérique. Ici, nous allons démontrer la procédure chirurgicale. Insérez le cathéter de calibre 26 avec l’aiguille.

Insérez le cathéter davantage et retirez lentement l’aiguille en même temps. Fixez le cathéter à l’aide d’une pince. Remplissez complètement le cathéter avec une solution saline d’héparine pour éviter les bulles d’air.

Connectez le tube d’extension au cathéter et fixez-les fermement. Allumez la pompe de perfusion. Commencer la perfusion de sérum salin à l’héparine avec un débit de 0,4 millilitre par minute.

Observez les lobes droits devenir pâles immédiatement après la perfusion. Rincez le foie à l’aide d’une solution saline pour le garder humide pendant toute la procédure de perfusion. Euthanasier la souris par exsanguination par perfusion sous anesthésie.

Continuez la perfusion d’héparine pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que tout le foie devienne pâle. Avant la perfusion de Microfil, ajoutez 0,1 millilitre d’agent de durcissement dans le composé Microfil préparé pour accélérer la procédure de polymérisation. Chargez le composé Microfil dans une seringue de cinq millilitres et un tube d’extension.

Débarrassez-vous des bulles d’air en injectant la solution saline d’héparine dans le cathéter, comme auparavant. Connectez le tube au cathéter et fixez-le fermement. Commencer l’injection de Microfil avec un débit de 0,2 millilitre par minute pendant environ une à deux minutes.

Observez l’agent bleu se propager lentement dans les branches de la veine porte. Arrêtez la perfusion lorsque la structure vasculaire bleue apparaît à la surface de chaque lobe du foie comme indiqué par un cercle rouge. Laissez le foie pendant au moins 15 minutes pour la polymérisation du composé Microfil.

Injection de microfils, système veineux hépatique. La procédure suit essentiellement les mêmes étapes que l’injection dans le système veineux porte. Placez une suture en soie 6-0 sous la veine porte hépatique supplémentaire à une distance d’environ un millimètre de sa bifurcation.

Insérez ensuite un cathéter dans la veine porte et fixez-le à l’aide d’une pince. Insérez un autre cathéter dans la veine cave inférieure et fixez-le également à l’aide d’une pince. Lister la suture pré-placée pour fixer le cathéter et bloquer le flux sanguin de la veine splénique et de la veine mésentérique.

Placez une pince sur la veine cave inférieure suprahépatique pour obstruer l’écoulement du foie. Branches ligacées de la veine cave inférieure, y compris les veines rénales et l’extrémité distale de la veine cave inférieure. Rincer le foie à l’aide d’une solution saline d’héparine à l’aide d’un cathéter.

Perfuser le système veineux hépatique avec le composé Microfil via le cathéter deux. Résultats, reconstruction par micro-tomodensitométrie. Nous avons obtenu des reconstructions vasculaires 3D à l’aide du logiciel préclinique Imalytics après un scanner Micro CT.

La régénération vasculaire dans les systèmes veineux porte et hépatique est apparue sous la forme d’un allongement et d’un élargissement des principales structures vasculaires en combinaison avec une ramification de vaisseaux plus petits. Le deuxième jour postopératoire, les arbres vasculaires des lobes restants se sont allongés. Au septième jour postopératoire, de petites branches supplémentaires de la même veine porte principale et de la veine hépatique sont devenues visibles.

Résultats, reconstruction 3D codée en couleur de l’arbre vasculaire hépatique et des territoires hépatiques dépendants. Chaque lobe hépatique a été facilement visualisé dans les trois dimensions après reconstruction codée en couleur par HepaVision. Comme indiqué dans le tableau, les volumes hépatiques du foie total et de chaque lobe ont été déterminés, comme indiqué ici, pour le système veineux hépatique d’un foie normal.

Résultats, coupes en série et reconstruction. D’autre part, l’échantillon Microfil fixé au formol a été soumis à une section en série. Les coupes en série colorées ont été numérisées à l’aide d’un scanner de lames entières et utilisées pour la reconstruction de l’arbre vasculaire des deux systèmes.

Il s’agit de coupes transversales d’une pile de coupes en série de foie de souris avant et après l’enregistrement rigide et élastique. Après l’enregistrement par ordinateur, les systèmes veineux portals et hépatiques peuvent être reconstruits dans un seul modèle 3D. Cette étape manuelle et chronophage en termes de calcul doit être optimisée.

La prochaine étape, à savoir la visualisation de la distribution spatiale des événements moléculaires par rapport aux arbres vasculaires, est actuellement en cours de développement. Cette étape peut être envisagée comme une fusion des informations Micro CT dérivées de l’arbre vasculaire contrasté avec des informations histologiques ou comme une visualisation 3D d’informations purement histologiques. Dans ce cas, les informations de la Micro CT serviraient de contrôle de la qualité pour la reconstruction 3D exigeante, basée sur l’histologie.

Une fois cela réalisé, nous disposons d’un outil pour mieux étudier la régénération du foie. En particulier la distribution spatiale des événements moléculaires et le parenchyme hépatique en ce qui concerne la régénération vasculaire.