Name: Murine Hind Limb os long Dissection et moelle osseuse Isolation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez la dissection rapide des os longs des membres postérieurs de souris et l'isolation de la moelle osseuse par centrifugation. Cette méthode standardisée préserve l'intégrité tissulaire pour les analyses histologiques et les cultures cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NCI n° U54CA143803, CA163124, CA093900 et CA143055 à K.J.P. Les auteurs remercient les membres actuels et passés du laboratoire Weilbaecher, en particulier Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla et Hongju Deng, ainsi que les membres de l’Institut urologique Brady, en particulier les membres du laboratoire Pienta pour la lecture critique du manuscrit.

Tous les travaux des animaux a été approuvé par l&#39;Institutional Animal Care et utilisation Comité conformément aux recommandations énoncées dans le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Dissection 1. Hind Limb os long <ol><li> Euthanasier la souris conformément aux directives institutionnelles. </li><li> Placez la souris dans une position couchée et apposer en épinglant les quatre pattes à travers les coussinets des pattes de souris ci-dessous l&#39;articulation de la cheville. </li><li> Pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol, arrosant abondamment les jambes. </li><li> Faire une petite incision à la droite de la ligne médiane dans le bas ventre, juste au-dessus de la hanche. </li><li> Prolongez l&#39;incision dans la jambe et au-delà de l&#39;articulation de la cheville. </li><li> Tirez la peau et couper le muscle quadriceps ancré à l&#39;extrémité proximale du fémur pour exposer la face antérieure du fémur et la broche à partir de la jambe, en plaçant la tige à un angle de 45 degrés par rapport à la carte. </li><li> Avec le blade des ciseaux contre la face postérieure du fémur, couper les tendons du jarret loin de l&#39;articulation du genou. </li><li> Tirez la peau et les muscles ischio-jambiers ancrés à l&#39;extrémité proximale du fémur pour exposer la face postérieure du fémur et la broche à partir de la jambe, en plaçant la tige à un angle de 45 degrés par rapport à la carte. </li><li> Avec la pince, prise de l&#39;extrémité distale du fémur, juste au-dessus de l&#39;articulation du genou. Guide des lames des ciseaux de chaque côté de la diaphyse fémorale vers l&#39;articulation de la hanche, en faisant attention à ne pas couper dans le fémur lui-même. </li><li> Après avoir atteint la tête fémorale, indiquée par les ciseaux ouverture légèrement, tournez les ciseaux avec la lame supérieure des ciseaux mobiles directement sur la tête fémorale à disloquer le fémur, en faisant attention de ne pas casser l&#39;os en dessous de la tête fémorale. </li><li> Saisissez le haut de la diaphyse fémorale avec la pince, couper les tissus mous loin de la tête fémorale pour le libérer de l&#39;acétabulum. </li><li> Tirez l&#39;ensemble de l&#39;os de la jambe, y comprisfémur, le genou et le tibia, le haut et loin du corps, découpant soigneusement le tissu conjonctif et les muscles de la jambe de liaison à la peau. </li><li> Éparpille l&#39;articulation de la cheville et de nouveau utiliser les ciseaux dans un mouvement de torsion pour disloquer le tibia. </li><li> Saisissant l&#39;extrémité distale du tibia, en prenant soin de ne pas couper les tendons, tirez le tibia et loin du corps et la carte de la broche. </li><li> Couper tout tissu conjonctif restant fixer l&#39;os long à la souris au niveau du genou. </li><li> Enlever tout muscle ou du tissu conjonctif supplémentaire attaché au fémur et au tibia. </li><li> Pour toutes les applications qui nécessitent l&#39;os restent intacts (histologie, histomorphométrie, tests biomécaniques, etc.), Procéder à des protocoles internes standards (comme dans 4-7). Pour isoler la moelle osseuse, passez à la section 2. </li></ol> 2. Préparation à long os pour moelle osseuse Isolation <ol><li> Utilisation de la pince, saisir le fémur avec la rotule opposée unee l&#39;extrémité proximale (tête fémorale) vers le bas. </li><li> Éparpille l&#39;articulation du genou et d&#39;utiliser les ciseaux dans un mouvement de torsion pour disloquer le tibia et le fémur. </li><li> Couper tout tissu conjonctif tenant le fémur et le tibia ensemble. </li><li> Utilisation de la pince, saisir le fémur avec la face antérieure opposée et l&#39;extrémité proximale (extrémité de la tête fémorale) vers le bas. </li><li> Guide des ciseaux jusqu&#39;à la diaphyse fémorale aux condyles. </li><li> Tournez doucement les ciseaux et en arrière pour enlever les condyles, la rotule, et l&#39;épiphyse pour exposer la métaphyse. </li><li> Retirez tout musculaire supplémentaire ou de tissu conjonctif attaché au fémur à l&#39;aide des pinces, des ciseaux, et Kimwipes. </li><li> À l&#39;aide de la pince, saisir le tibia avec la face antérieure tournée à l&#39;opposé et l&#39;extrémité distale (extrémité de la cheville) vers le bas. </li><li> Si l&#39;épiphyse tibiale est intact, guider les ciseaux jusqu&#39;à l&#39;arbre du tibia aux condyles. </li><li> Tournez doucement les ciseaux et en arrière pour enlever les condyles et épiphyse pour exposer la métaphyse. </li><li> Retirez tout musculaire supplémentaire ou de tissu conjonctif attaché au tibia à l&#39;aide des pinces, des ciseaux, et Kimwipes. </li></ol> 3. Bone Marrow Isolation <ol><li> Pousser une aiguille de 18 G à travers le fond d&#39;un tube à microcentrifugation de 0,5 ml. </li><li> Placez les os longs (maximum de 2 fémurs et 2 tibias) dans le tube, le genou-end end vers le bas vers le bas et fermer le couvercle. </li><li> Nest le tube de 0,5 ml de microcentrifugation dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger les tubes emboîtés à ≥10,000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 15 sec. </li><li> Vérifier que la moelle osseuse a été filé à des os par inspection visuelle. Les os doivent apparaître blanc et il devrait y avoir un grand culot visuel dans le plus grand tube. </li><li> Jeter le tube de 0,5 ml de microcentrifugation avec les os. </li><li> Suspendre la moelle osseuse dans une solution appropriée (par exemple, PBS, milieux de culture, le tampon FACS) et procéder à protocole expérimental (ADN, ARN, ou l&#39; isolement de la protéine,l&#39;analyse par FACS, ou une culture cellulaire primaire). </li></ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons une méthode simple et efficace pour l’ablation des os longs postérieurs de la souris et l’isolement ultérieur de la moelle osseuse. Cette méthode maintient l’intégrité structurelle et cellulaire élevée des os et de la moelle osseuse et a un faible temps de manipulation, minimisant la probabilité de fracture ou de marquage osseux induit par l’utilisateur qui peut influencer les analyses en aval. De plus, la méthode de centrifugation pour isoler la moelle osseuse ne nécessite pas de couper l’os pour exposer l’espace de la moelle osseuse ou de liquide pour rincer la moelle osseuse, réduisant ainsi les points de contamination potentiels. De plus, la technique de centrifugation a un débit relativement élevé avec un temps de manipulation plus faible que les autres méthodes, réduisant ainsi le temps de traitement.
Une forte variation est inhérente aux études in vivo sur la souris en raison de la forte variation phénotypique d’une souris à l’autre. Afin de maximiser l’impact de la recherche des études coûteuses et laborieuses sur les souris, il est essentiel de minimiser les erreurs expérimentales techniques9,10. Le temps écoulé entre le sacrifice d’un animal et l’analyse en aval ou la fixation des tissus introduit des variations expérimentales qui peuvent surmonter des changements subtils et réduire les grandes différences entre les groupes. Par conséquent, un traitement rapide des échantillons est essentiel pour une analyse précise des données. Les techniques de dissection d’os long et d’isolement de la moelle osseuse décrites ici sont optimisées pour un traitement rapide des animaux et des échantillons afin de réduire les variations techniques.
Ce protocole peut être largement appliqué à de nombreux domaines de recherche, notamment l’étude du tissu osseux lui-même ou l’interrogation des cellules de la moelle osseuse. De plus, cette approche simple de la dissection des os longs permettra aux chercheurs dans des domaines connexes d’interroger directement les contributions osseuses afin d’élargir nos connaissances sur le dysfonctionnement de la moelle osseuse dans des pathologies autrement peu étudiées.

L’étude des os longs et des cellules de la moelle osseuse est au cœur d’une myriade de disciplines de recherche, y compris, mais sans s’y limiter, la biologie osseuse, la biologie du cancer, l’immunologie, l’hématologie et la biomécanique. L’os est un organe très dynamique qui, avec le cartilage, forme le squelette pour fournir un soutien mécanique contre la charge et la protection des organes internes. De plus, les composants minéraux de l’os constituent un puits de stockage pour les molécules de signalisation critiques que sont le calcium et le phosphore, ainsi que d’autres facteurs1. Enfin, les os abritent la moelle osseuse et, avec les ostéoblastes formant l’os métaboliquement actifs et les ostéoclastes résorbants osseux, fournissent la niche de cellules souches nécessaire au maintien des populations de cellules hématopoïétiques et lymphoïdes.
L’os et la moelle osseuse sont affectés dans de nombreux troubles, conduisant souvent à un dysfonctionnement de la moelle osseuse, à de graves douleurs osseuses et à des fractures pathologiques. L’os est un site commun de métastases dans de nombreuses tumeurs solides, notamment le cancer du sein et le cancer de la prostate, où les cellules tumorales engagent directement la niche de la moelle osseuse pour initier le cercle vicieux des métastases osseuses et déplacer les cellules souches hématopoïétiques2,3. Les tumeurs malignes hématopoïétiques, y compris le myélome et la leucémie, sont caractérisées par un dysfonctionnement de la moelle osseuse ainsi que par une dérégulation du remodelage osseux sain1. D’autres troubles squelettiques non malins sont également des domaines de recherche actifs, tels que l’arthrose, l’ostéoporose, la scoliose et le rachitisme. Même chez un individu par ailleurs en bonne santé, une défaillance biomécanique d’un os entraîne une fracture douloureuse. Tous ces troubles représentent des domaines de recherche actifs dans le but d’identifier de nouvelles mesures préventives et de nouveaux schémas thérapeutiques pour réduire la morbidité et la mortalité.
Pour étudier la pléthore de rôles de l’os et de la moelle osseuse, à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques, il est essentiel pour les chercheurs de disposer d’une méthode standardisée simple et efficace de dissection des os longs de souris pour le traitement rapide de grandes expériences in vivo. Le protocole de dissection décrit ici convient à toutes les analyses d’os longs, y compris l’imagerie ex vivo, l’histologie, l’histomorphométrie et les tests de force, entre autres. De même, une méthode standardisée d’isolement de la moelle osseuse avec une récupération élevée des cellules de la moelle osseuse et une faible variabilité entre les utilisateurs est importante pour l’analyse expérimentale telle que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou la PCR quantitative (qPCR) ainsi que pour les applications en aval telles que la culture cellulaire primaire de cellules de moelle osseuse.

<table><tbody><tr><td>Pinboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciseaux&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td>à dissection</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille</td><td></td><td></td><td></td>16 G</tr><tr><td>1,5 ml Microtube à</td><td></td><td></td><td></td>centrifuger</tr><tr><td>0,5 ml Tube</td><td></td><td></td><td></td>à</tr><tr><td>microcentrifuger</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine hind limb os long dissection et moelle osseuse isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

L’étude de l’os et de la moelle osseuse est essentielle dans de nombreux domaines de recherche, notamment la biologie osseuse fondamentale, l’immunologie, l’hématologie, les métastases cancéreuses, la biomécanique et la biologie des cellules souches. Malgré l’importance de l’os dans les états sains et pathologiques, il s’agit d’un organe largement sous-étudié en raison du manque de connaissances spécialisées sur la dissection osseuse et l’isolement de la moelle osseuse. Les souris sont un organisme modèle commun pour étudier les effets sur les os et la moelle osseuse, ce qui nécessite une méthode standardisée et efficace pour la dissection des os longs et l’isolement de la moelle osseuse pour le traitement de grandes cohortes expérimentales. Nous décrivons une procédure de dissection simple pour l’ablation du fémur et du tibia qui convient aux applications en aval, y compris, mais sans s’y limiter, l’analyse histomorphologique et les tests de résistance. De plus, nous décrivons une procédure rapide pour l’isolement de la moelle osseuse des os longs par centrifugation avec un temps de manipulation limité, idéale pour le tri cellulaire, la culture cellulaire primaire ou l’extraction d’ADN, d’ARN et de protéines. Le protocole est rationalisé pour un traitement rapide des échantillons afin de limiter les erreurs expérimentales, et est normalisé pour minimiser la variabilité d’un utilisateur à l’autre.

Le protocole décrit ici est optimisé pour la dissection rapide du fémur de la souris et le tibia avec un minimum de dommages au tissu osseux. Cette technique convient à un certain nombre d&#39;analyses en aval, y compris des études de biomécanique, histomorphométrie (Figure 1A - B), et l&#39; histologie (figure 1C) 4,7. Le histomophometric représentant de la reconstruction micoCT 3D (Figure 1A - B) montre que les deux os spongieux et la coque corticale sont maintenus qui permet une quantification précise des paramètres structurels normalisés pour histomorphométrie osseuse, y compris le numéro trabéculaire, l&#39; épaisseur et l&#39; espacement; volume osseux; et l&#39; épaisseur corticale, entre autres 8. La section histologiques représentant montre un formaline fixe et décalcifiée tibia H &amp; E tachée (figure 1C). L&#39;image montre l&#39;intégrité de la b calcifiéeune et cellulaire de la moelle osseuse pour l&#39;analyse histologique. La procédure d&#39;isolement de la moelle osseuse préserve la stérilité de l&#39;espace médullaire, a une faible manipulation pour réduire la contamination, et ne nécessite pas la coupe de l&#39;os long, réduisant ainsi la perte de rendement de la moelle osseuse. Cette moelle osseuse est adapté à de nombreuses applications en aval, y compris de cytométrie de flux 5 et PCR analyses. En outre, cette procédure peut être utilisée pour isoler la moelle osseuse pour la culture de cellules primaires de cellules de moelle osseuse, y compris les ostéoclastes et les ostéoblastes (figure 2A - B) 4,6. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" /> Reconstruction Figure 1. histomorphologique et analyses histologiques de souris os long. Trois dimensions microCT d&#39;un tibia de souris montrant (A) la coque corticale externe et (B </s<html> trong&gt;) os trabéculaire (barre d&#39;échelle = 0,5 mm). (C) histologiques H &amp; E tache d&#39;un tibia décalcifiée et en coupe (4x). Images courtoisie de Katherine Weilbaecher, School of Medicine, USA Université de Washington. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" /> Figure 2. Primary Bone Marrow culture cellulaire pour la différenciation des ostéoclastes et des ostéoblastes. (A) TRAP coloration pour ostéoclastes multinucléés après 7 jours dans les médias ostéoclastogénique (4x). (B) La phosphatase alcaline (couleur violette) pour ostéoblastes et alizarine rouge (couleur rouge) tache pour la minéralisation après 21 jours dans les médias ostéogénique. Images courtoisie de Katherine Weilbaecher, School of Medicine, USA Université de Washington.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nous présentons ici un protocole pour la dissection des os longs des membres postérieurs (fémurs et tibias) de la souris de laboratoire. Nous décrivons en outre une technique rapide d’isolement de la moelle osseuse de ces os qui utilise la centrifugation pour retirer la moelle osseuse de l’espace de la moelle osseuse.

Murine Hind Limb os long Dissection et moelle osseuse Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

L'objectif général de cette procédure de dissection des os longs et d'isolement de la moelle osseuse est de retirer rapidement et de manière systématique les os longs et de recueillir la moelle osseuse pour des analyses ultérieures. Cette méthode permet de répondre à des questions clés liées à la biologie de la moelle osseuse, à la métastase cancéreuse et à l'immunologie. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le processus de dissection est rapide et standardisé, et que la procédure d'isolement de la moelle osseuse est relativement stérile. Commencez par positionner la souris en position dorsale.Ensuite, épingler les quatre coussinets des pattes sous l'articulation de la cheville et vaporiser la souris avec de l'éthanol à 70 %, en imbibant soigneusement les pattes. Puis, pratiquer une petite incision à droite de la ligne médiane dans la région abdominale inférieure, juste au-dessus de la hanche, et prolonger l'incision le long de la patte jusqu'au-delà de l'articulation de la cheville. Relever la peau.Ensuite, couper le muscle quadriceps fixé à l'extrémité proximale du fémur afin d'exposer la face antérieure du fémur, puis écarter le muscle de la jambe à l'aide d'une épingle placée selon un angle de 45 degrés par rapport à la planche. En appuyant les ciseaux contre la face postérieure du fémur, détacher les muscles ischio-jambiers de l'articulation du genou. Puis tirer vers l'arrière la peau et les muscles ischio-jambiers fixés à l'extrémité proximale du fémur afin d'exposer la face postérieure de l'os, et écarter les muscles ischio-jambiers de la jambe à l'aide d'une épingle placée selon un angle de 45 degrés.Avec la pince, saisissez l'extrémité distale du fémur juste au-dessus de l'articulation du genou. Ensuite, guidez les lames des ciseaux de chaque côté de la diaphyse fémorale en direction de l'articulation de la hanche. Une fois arrivé à la tête fémorale, tournez les ciseaux de manière à placer la lame supérieure directement au-dessus de la tête fémorale afin de luxer le fémur.À présent, saisissez le sommet du fémur avec la pince et sectionnez les tissus mous autour de la tête fémorale afin de libérer le fémur de l'acétabulum. Ensuite, tirez délicatement l'ensemble de l'os de la jambe, y compris le fémur, le genou et le tibia, vers le haut et à l'écart du corps, et coupez soigneusement les tissus conjonctifs et les muscles reliant la jambe à la peau. Une fois que tous les tissus conjonctifs ont été retirés, hyper-étirez l'articulation de la cheville et tournez les ciseaux comme précédemment démontré pour luxer le tibia.En tenant l'extrémité distale du tibia et en prenant soin de ne pas sectionner les tendons, tirez le tibia vers le haut et à l'écart du corps et du tableau à broches. Ensuite, retirez tout tissu conjonctif restant attaché à l'os long au niveau du genou, ainsi que tout muscle ou tissu conjonctif supplémentaire fixé au fémur et au tibia. Pour préparer l'os long à l'isolement de la moelle, saisissez le fémur avec la rotule orientée vers l'arrière et la tête fémorale dirigée vers le bas.Étendez excessivement l'articulation du genou et tournez les ciseaux pour déboîter le tibia du fémur. Ensuite, retirez tout tissu conjonctif reliant le fémur et le tibia. Puis, saisissez le fémur avec la face antérieure orientée vers l'extérieur et la tête fémorale orientée vers le bas, et faites glisser les ciseaux le long du fût fémoral jusqu'aux condyles.Faites pivoter doucement les ciseaux en va-et-vient pour retirer les condyles, la rotule et l'épiphyse, exposant ainsi la métaphyse. Ensuite, utilisez la pince, les ciseaux et les compresses Kimwipes pour enlever tout muscle ou tissu conjonctif supplémentaire attaché au fémur. Puis, saisissez le tibia avec la face antérieure orientée vers l'arrière et l'extrémité de la cheville dirigée vers le bas.Si l'épiphyse tibiale est intacte, guider les ciseaux le long du diaphyse du tibia jusqu'aux condyles et faire pivoter doucement les ciseaux en va-et-vient pour retirer les condyles et l'épiphyse, exposant ainsi la métaphyse tibiale. Ensuite, retirer tout muscle ou tissu conjonctif supplémentaire attaché au tibia, comme vient de l'être démontré. Pour prélever la moelle osseuse, insérer d'abord une aiguille de calibre 18 à travers le fond d'un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre.Ensuite, placez les os longs dans le tube, l'extrémité du genou vers le bas, puis fermez le couvercle. Insérez le tube de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et centrifugez les tubes à une force supérieure ou égale à 10 000 ×g dans une microcentrifugeuse pendant 15 secondes. Vérifiez par inspection visuelle que la moelle osseuse a été expulsée des os.Les os doivent apparaître blancs, et un gros culot doit être visible dans le tube de plus grande taille. Ensuite, jeter les os dans le tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre, et suspendre la moelle osseuse dans la solution appropriée pour l'analyse en aval souhaitée. Cette technique de dissection rapide convient à plusieurs analyses en aval, notamment la histomorphométrie et l'histologie.En effet, comme le montre cette reconstruction 3D représentative par micro-CT histomorphométrique, l'os spongieux et la corticale sont préservés, permettant une quantification précise des paramètres structuraux normalisés pour l'histomorphométrie osseuse. Dans cette coupe histologique représentative d'une tibia fixée dans du formol, colorée à l'H&E et décalcifiée, on peut observer le maintien de l'intégrité de l'os calcifié ainsi que de la moelle osseuse cellulaire pour l'analyse histologique. De plus, la moelle osseuse isolée par cette procédure convient à de nombreuses applications en aval, notamment la culture primaire d'ostéoclastes ou d'ostéoblastes.Une fois maîtrisée, la technique peut être réalisée en environ sept minutes, de la dissection de l'os long à l'isolement de la moelle osseuse, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien positionner la souris afin de faciliter la dissection. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la cytométrie en flux (FACS) ou d'autres techniques cellulaires uniques, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les modifications des populations cellulaires de la moelle osseuse.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de disséquer rapidement les os longs de souris et d'isoler la moelle osseuse par centrifugation.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Cette vidéo décrit un protocole détaillé permettant d'isoler la moelle osseuse entière fraîche des membres postérieurs de la souris afin d'étudier les anomalies de la moelle osseuse chez les patients atteints de troubles sanguins tels que la leucémie.

Prélèvement de moelle osseuse sur une patte postérieure de souris

Ce protocole décrit une procédure de prélèvement en série de moelle osseuse fémorale (BM) sans nécessiter le sacrifice de souris. Cette procédure facilite les études longitudinales de la composition en BM des souris au fil du temps et fournit un accès en série aux cellules à l’intérieur de la BM pour les études ex vivo et de transplantation.

Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.

Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Le succès de la transcriptomique unicellulaire/mononoyau et de la multi-omique dépend en grande partie de la qualité des cellules/noyaux. Par conséquent, l’isolement des cellules/noyaux des tissus et leur purification doivent être hautement standardisés. Ce protocole décrit la préparation des noyaux du cerveau et de la moelle osseuse pour l’essai multiome à noyau unique en aval.

Préparation de noyaux de cerveau et de moelle osseuse de haute qualité pour les dosages multiomes à noyau unique

Ici, une méthode basée sur la cytométrie phosphoflow est décrite pour analyser la signalisation en aval des voies mTORC1, JAK/STAT5 et MAPK dans des cellules de leucémie myéloïde humaine aiguë xénogreffées chez la souris et obtenues à partir d’aspirations de moelle osseuse. Les niveaux de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 et p-ERK1/2 sont mesurés simultanément à l’aide d’un cytomètre en flux spectral de nouvelle génération à haute sensibilité.

Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

Découvrez la dissection rapide des os longs des membres postérieurs de souris et l'isolation de la moelle osseuse par centrifugation. Cette méthode standardisée préserve l'intégrité tissulaire pour les analyses histologiques et les cultures cellulaires.

Murine Hind Limb os long Dissection et moelle osseuse Isolation

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