Name: Procédure pour évaluer lefficacité de floculants pour lélimination des particules dispersées dans des extraits de plantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Découvrez une approche expérimentale pour évaluer l'efficacité des floculants dans l'élimination des particules dispersées dans les extraits de plantes. Cette méthode optimise la clarification et réduit les coûts de traitement.

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Je tiens à remercier le Dr Thomas Rademacher pour avoir fourni les graines de tabac transgéniques et Ibrahim Al Amedi pour la culture des plants de tabac. Je tiens à remercier le Dr Richard M Twyman pour son aide éditoriale et le professeur Rainer Fischer pour les discussions fructueuses. Ce travail a été financé en partie par la subvention avancée du Conseil européen de la recherche ''Future-Pharma'', numéro de proposition 269110, la Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fondation Fraunhofer Future) et les programmes internes Fraunhofer-Gesellschaft sous la subvention n°. Attirer 125-600164.

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L&#39;auteur n&#39;a aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

L&#39;aspect le plus important à considérer lors de la mise en place d&#39; un DoE pour caractériser la floculation des particules est que la conception doit en principe être en mesure de détecter et de décrire les effets prévus ou possibles 36,38, par exemple l&#39;influence du pH, le type de polymère et la concentration de polymère 16. Par conséquent, il est important d&#39;évaluer la fraction de l&#39;espace de conception (FDS) avant de commencer les expériences réelles. Fds est la frac...

Les plantes sont largement utilisées pour produire des produits alimentaires tels que les jus de fruits, mais ils peuvent aussi être développés comme des plates - formes pour la fabrication de plus forte valeur ajoutée des produits biopharmaceutiques 1-3. Dans les deux cas, le traitement en aval (DSP) commence souvent par l&#39;extraction de liquides à partir de tissus tels que les feuilles ou les fruits, suivie par la clarification des extraits chargés de particules de 4,5. Pour la fabrication de produits biopharmaceutiques, les coûts de DSP peuvent représenter jusqu&#39;à 80% des coûts de production globaux 6,7 et cela reflète en partie la forte charge des particules présentes dans des extraits préparés par des méthodes perturbatrices telles que l&#39; homogénéisation à base de lame 8,9 . Bien que la sélection rationnelle des couches de filtre pour correspondre à la distribution des tailles de particules dans l&#39;extrait peut augmenter la capacité de filtrage et de réduire les coûts 10,11, l&#39;amélioration ne peut jamais dépasser la limite de capacité absolue définie par le nombre de particules qui doivent être retenues parunité de surface de filtre pour obtenir des éclaircissements. Le plafond peut être levée si moins de particules atteignent la surface des meilleurs filtres dans le train de filtration, et ceci peut être réalisé que si les particules dispersées sont mélangées avec des polymères connus comme agents floculants qui favorisent l&#39; agrégation pour former de grands floculats 12. Ces flocs peuvent être conservés plus en amont par des filtres grossiers et moins coûteux sac, ce qui réduit la charge de particules atteignant la plus fine et les filtres de profondeur plus chers. Les polymères doivent avoir des profils de sécurité adaptés à leurs applications, par exemple pour les produits biopharmaceutiques , ils doivent être conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), et généralement , ils doivent avoir une masse molaire&gt; 100 kDa et peut être soit neutre ou chargé 13. Considérant que floculants neutres agissent généralement par réticulation des particules dispersées provoquant leur agrégation et la formation de flocs avec des diamètres&gt; 1 mm 11, des polymères chargés de neutraliser la charge de dparticules ispersed, réduisant leur solubilité et provoquant ainsi la précipitation 14. La floculation peut être améliorée en ajustant des paramètres tels que le pH du tampon ou de la conductivité et du type de polymère ou de concentration, en fonction des propriétés de l&#39;extrait 15,16. Pour les extraits de tabac prétraités avec 0,5-5,0 g L -1 polyéthylènimine (PEI), une augmentation de plus de 2 fois la capacité de filtration en profondeur a été rapporté dans un processus à l&#39; échelle pilote 100-L. Le coût de ce polymère est inférieure à 10 € kg -1 de sorte que son introduction dans le processus ont entraîné des économies de coûts d&#39;environ € 6.000 pour les filtres et consommables par lot 16 ou encore plus lorsqu&#39;il est combiné avec base de cellulose filtre aides 17. Même ainsi, les modèles prédictifs sont nécessaires pour évaluer les a priori des avantages économiques de floculants parce que leur inclusion peut nécessiter des étapes de maintien de 15-30 min 16,18, ce qui entraîne des coûts supplémentaires d&#39;investissement pour le stockageles chars. Cependant, il n&#39;y a pas de modèles mécanistes disponibles qui peuvent prédire les résultats de ces expériences en raison de la nature complexe de la floculation. Par conséquent, une expérience de conception de-plus appropriés (DoE) approche 19 a été développé comme décrit dans cet article. Un protocole pour la procédure générale DoE a récemment été publiée 20. Dispositifs à petite échelle sont maintenant disponibles pour le criblage à haut débit des conditions de floculation 21. Toutefois, ces dispositifs ne peuvent pas simuler de façon réaliste les conditions au cours de la floculation des extraits de plantes, car les dimensions du récipient de réaction (~ 7 mm pour les puits sur une plaque à 96 puits) et les particules ou flocs peuvent être inférieur à un ordre de grandeur d&#39;intervalle. Cela peut affecter le mélange des modèles et donc la puissance prédictive du modèle. En outre, il peut être difficile de réduire les processus impliquant la précipitation en raison de changements non linéaires dans la conduite de mélange et le précipité stabilité 22. Par conséquent, cet article décrit un système de criblage paillasse échelle avec un débit de 50-75 échantillons par jour, ce qui donne des résultats qui sont évolutives à partir du volume de réaction de 20 ml initiale à un processus à l&#39;échelle pilote 100 L 16. Lorsqu&#39;il est combiné avec une approche DoE, ce qui permet aux modèles prédictifs pour être utilisés pour l&#39;optimisation des processus et de la documentation dans le cadre d&#39;un concept de qualité par la conception. La méthode décrite ci - dessous peut également être adapté aux produits biopharmaceutiques produites dans des procédés à base de culture cellulaire, où les floculants sont également considérés comme un outil de réduction des coûts 23. Il peut également être utilisé pour modéliser la précipitation des protéines cibles à partir d&#39; un extrait brut dans le cadre d&#39;une stratégie de purification, comme l&#39;a démontré pour la β-glucuronidase produite dans le canola, le maïs et le soja 24,25. Une description détaillée des propriétés de floculant peut se trouver ailleurs 16,26 et il est important de veiller à ce que le polymère concentrations sont soit non toxique ou au- dessous des niveaux nocifs dans le produit final 11.

<table><tbody><tr><td>2100P Turbidimètre portable</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>Turbidimètre</td></tr><tr><td>2G12 Anticorps</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Anticorps de référence</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>Dispositif SPR</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Filtre à manches</td></tr><tr><td>Catiofast VSH</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Agent</td></tr> <tr><td>floculantCentrifugeuse 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>Tube à</td></tr><tr><td>réaction Tube à centrifuger 50 ml Autonome</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Tube à réaction</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5375.1</td><td>Agent floculant</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>software</td></tr><tr><td>Phosphate disodique</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp ; 4984.3&nbsp ;</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Engrais</td></tr><tr><td>Forma -86C Congélateur</td><td>ULT ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Congélateur</td></tr><tr><td>Serre</td><td>n.a.n.a.Pour</td><td></td> <td>la culture des plantes</td></tr><tr><td>Grodan Cubes de laine de roche 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Bloc de laine de roche</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Composant de média</td></tr><tr><td>K700P 60D</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>Couche filtrante en profondeur</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Couche filtrante en profondeur</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>Toile filtrante</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pH-mètre / conductimètre</td></tr><tr><td>Osram cool white 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Source lumineuse</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Pour</td> <td>la culture des plantes</td></tr><tr><td>Polymin P</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Floculant</td></tr><tr><td>POLYTRON PT 6100 D</td><td>Kinematica</td><td>11010110</td><td>Dispositif d’homogénéisation avec outil à lame personnalisé</td></tr><tr><td>Protein A</td><td>Life technologies</td><td>10-1006</td><td>Protéine de liaison aux anticorps</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Composant du milieu</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Lecteur de plaques de fluorescence</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Boîtier de filtre</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS mesure de la distribution granulométrique</td></tr></tbody></table>

procédure pour évaluer l&#39;efficacité de floculants pour l&#39;élimination des particules dispersées dans des extraits de plantes

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Les plantes sont importantes pour l’homme non seulement parce qu’elles fournissent des produits de base tels que des denrées alimentaires, des aliments pour animaux et des matières premières, mais aussi parce qu’elles peuvent être utilisées comme plateformes de fabrication de produits à valeur ajoutée tels que les produits biopharmaceutiques. Dans les deux cas, il peut être nécessaire de clarifier les extraits liquides de plantes pour éliminer les particules. Une clarification optimale réduit les coûts de filtration et de centrifugation en augmentant la capacité et la longévité. Cela peut être réalisé en introduisant des polymères chargés connus sous le nom de floculants, qui réticulent les particules dispersées pour faciliter la séparation solide-liquide. Il n’existe pas de modèles de floculation mécaniste pour des mélanges complexes tels que les extraits de plantes, c’est pourquoi des modèles empiriques sont utilisés à la place. Ici, une procédure de plan d’expériences est décrite qui permet le criblage rapide de différents floculants, optimisant la clarification des extraits de plantes et réduisant considérablement la turbidité. Les modèles prédictifs qui en résultent permettent d’identifier des conditions de processus robustes et des ensembles de polymères aux propriétés complémentaires, par exemple la floculation efficace dans les extraits à conductivités spécifiques. Les résultats présentés pour les extraits de feuilles de tabac peuvent facilement être adaptés à d’autres espèces ou tissus végétaux et faciliteront ainsi le développement de procédés en aval plus rentables pour les produits de base et les produits pharmaceutiques d’origine végétale.

Floculation de l&#39;extrait de tabac avec différents polymères Le procédé décrit ci - dessus a été utilisée avec succès pour développer un procédé pour la floculation des extraits de tabac lors de la fabrication d&#39;un anticorps monoclonal (l&#39;anticorps anti - VIH neutralisant 2G12) et une protéine fluorescente (DsRed) (figure 1) 16, et a depuis été transféré à d&#39;autres protéines, y compri...

La procédure de plan d’expériences présentée ici permet d’évaluer différents floculants en fonction de leur capacité à agréger des particules dispersées dans des extraits de plantes, réduisant ainsi la turbidité et les coûts de traitement en aval.

Procédure pour évaluer l&#39;efficacité de floculants pour l&#39;élimination des particules dispersées dans des extraits de plantes

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier des floculants capables d'améliorer l'élimination des particules dispersées présentes dans les extraits végétaux. Cela est réalisé en mettant en place un plan expérimental permettant d'identifier les polymères les plus efficaces ainsi que les paramètres contrôlant l'agrégation de ces particules dispersées. La deuxième étape définit le flux de travail, qui correspond aux opérations unitaires utilisées dans une application à grande échelle.Ensuite, des extraits de feuilles sont préparés en tant qu'agents floculants dans diverses conditions et analysés afin de mesurer la turbidité et le rendement de récupération du produit. Les résultats indiquent les conditions optimales de floculation et les polymères appropriés, selon une évaluation basée sur un modèle de plan d'expériences, que nous abrégeons en DoE. Le principal avantage de cette technique par rapport à la clarification traditionnelle utilisant uniquement la filtration en profondeur est que la capacité du filtre peut être augmentée de plusieurs fois, réduisant ainsi les coûts globaux du procédé.La floculation peut augmenter le diamètre effectif des particules et faciliter leur élimination par centrifugation ou filtration. Par conséquent, les paramètres de processus environnementaux pertinents pour la procédure de floculation doivent d'abord être identifiés. Généralement, plusieurs paramètres de ce type existent.Ainsi, une approche par plan d'expériences (DoE) est appropriée en raison du manque de modèles mécanistiques. Le plan d'expériences est établi en sélectionnant des paramètres fondés sur des données de la littérature et des connaissances antérieures. Les paramètres typiques incluent le temps d'incubation ainsi que le type et la concentration du polymère.Les résultats expérimentaux utilisés pour évaluer l'efficacité de la floculation, tels que la filtrabilité, sont également définis avant l'expérience. Ces informations sont ensuite intégrées à un plan d'expériences (DoE) adapté au nombre de facteurs à étudier et au niveau de connaissance déjà acquis sur le système. Un flux de travail est élaboré afin d'intégrer toutes les étapes pertinentes pour la floculation et le traitement à l'échelle de laboratoire des extraits végétaux.Le volume de l'aliquote doit être suffisamment faible pour permettre un haut débit d'échantillons. Les performances des équipements de laboratoire doivent être corrélées à celles des dispositifs à échelle de procédé. Les plantes sont cultivées de manière à représenter le procédé final.Tous les équipements sont préparés avant de commencer les expériences d'extraction et de floculation. Les solutions mères de floculant sont préparées soigneusement en tenant compte de toute pré-dilution effectuée par le fabricant. Le choix d'une même concentration mère pour tous les floculants simplifie les pipetages ultérieurs, réduisant ainsi le risque d'erreurs.Les composants du tampon, le pH et la conductivité de chaque solution mère fraîche de floculant sont préparés de manière à correspondre aux conditions des extraits. Le plan expérimental (DoE) est converti en un schéma de pipetage indiquant les volumes de solutions mères à ajouter aux échantillons d'extrait végétal. Les échantillons d'extrait végétal sont préparés à partir de feuilles de tabac récoltées, en utilisant les tampons correspondant aux conditions à tester dans le plan expérimental.Pendant l'agitation de l'extrait, des aliquotes sont préparées, correspondant au volume prédéfini. Cela garantira une distribution homogène des particules dans tous les échantillons. Du tampon d'extraction est ajouté à chaque aliquote afin que chaque échantillon ait le même volume une fois le stock de floculant ajouté.Le volume de solution mère défini dans la DOE est ajouté à l'échantillon de manière séquentielle, selon l'ordre aléatoire des essais. Le polymère est réparti de façon homogène dans tout l'échantillon en agitant immédiatement le tube après l'ajout du polymère, ce qui permet également de garantir la reproductibilité des résultats de floculation. La méthode peut facilement être modifiée pour tester des combinaisons de floculants ou l'ajout répété d'un même floculant.Mais cela doit être mis en œuvre dans le plan d'expériences (DoE). La formation des flocs nécessite généralement un temps d'incubation de trois à 30 minutes. Il est nécessaire de respecter les temps d'incubation définis dans le plan d'expériences afin d'obtenir des résultats reproductibles.On peut utiliser soit la vitesse de sédimentation des flocs, soit la turbidité des filtrats et les capacités des filtres pour évaluer la performance du floculant. Il est également important de vérifier que les polymères n'interfèrent pas avec des produits tels que les protéines. Une fois la qualité des données confirmée, les informations peuvent être transférées dans le logiciel DoE.Les données expérimentales sont analysées à l'aide des outils intégrés au logiciel DoE, notamment la transformation des données, la sélection des facteurs et les outils de contrôle de qualité. En plus de l'utilisation de ces outils, le modèle final doit également être conforme aux lois fondamentales de la physique et de la thermodynamique. Une fois la qualité du modèle confirmée, celui-ci peut être utilisé pour prédire les conditions optimales de floculation.Sur la base des prévisions du modèle, l'espace de conception peut être restreint à la région la plus pertinente, pour laquelle un nouveau plan d'expériences (DoE) peut être établi, en répétant la procédure décrite précédemment. Les résultats peuvent ensuite être confirmés à l'échelle pilote ou industrielle. Dans cette étude représentative, les performances de 23 floculants synthétiques différents et de quatre floculants naturels ont été testées quant à leur capacité à floculer des extraits de feuilles de tabac selon une approche par plan d'expériences (DoE).En tenant compte de paramètres spécifiques aux polymères tels que la concentration et le type de polymère, mais aussi de paramètres de procédé, comme le temps d'incubation, la température, le pH du tampon et la conductivité. Grâce à une séquence de quatre plans expérimentaux IV-optimaux imbriqués, comprenant au total environ 200 aliquotes de 20 mL d'extrait, nous avons constaté que le Polymin P était le floculant le plus efficace pour les extraits de tabac dans une plage de pH comprise entre quatre et huit, à condition que la température se situe entre quatre et 30 degrés Celsius. Un temps d'incubation de 15 minutes s'est révélé suffisant pour la floculation, mais l'efficacité diminuait lorsque la conductivité dépassait 40 mS par cm.Cependant, l'approche DoE a montré que Catiofast VSH était complémentaire à Polymin P, permettant une floculation efficace à des conductivités supérieures à 40 mS par cm. Lorsque ces floculants ont été introduits dans le traitement en aval des extraits de tabac, la capacité des filtres de profondeur utilisés a augmenté de 3,2 à 5,7 fois, réduisant ainsi le coût des marchandises pour cette étape. Nous avons confirmé que les floculants n'entraînaient pas de réduction du rendement des protéines cibles, notamment un anticorps monoclonal, une protéine fluorescente, une lectine et différents candidats vaccins.Les conditions optimales de floculation ont également été confirmées à l'échelle pilote dans un lot de 100 L. Les résultats de la méthode des plans d'expériences (DoE) ont également été transférés avec succès à des extraits de tabac préparés à l'aide d'une presse à vis plutôt qu'à un homogénéisateur à lames, soulignant l'applicabilité étendue des informations recueillies. Nous avons également adapté la méthode pour tester des combinaisons de floculants, qui se sont révélées tout aussi efficaces.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez comprendre comment mettre en place des expériences de floculation pour des extraits végétaux en utilisant une approche par plan d'expériences (DoE).

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