Immobilisation de Multi-biocatalyseurs dans des billes d'alginate pour cofacteur Régénération et amélioration de réutilisabilité

L'objectif général de cette procédure expérimentale est de démontrer l'utilisation d'un système biocatalytique cellulaire entier couplé, immobilisé dans des billes d'alginate, afin d'améliorer le rendement de production et la réutilisabilité. C'est mon sujet de recherche, dans lequel j'ai apporté des réponses à des questions clés dans le domaine de la biocatalyse, telles que l'immobilisation des biocatalyseurs, leur stabilité, la régénération des cofacteurs et les biocatalyseurs cellulaires entiers. Le principal avantage de cette technique réside dans son approche simple mais souple permettant une production améliorée de nombreuses biomolécules importantes par des voies dépendantes de cofacteurs.

Deux souches recombinantes d'E. coli sont utilisées dans ce protocole. La souche SpNOx E. coli, qui exprime la NADH oxydase, et la souche HjLAD E. coli, qui exprime la L-arabinitol déshydrogénase. Étant donné que cette procédure est identique pour les deux souches d'E. coli, elle sera uniquement démontrée pour la souche HjLAD E. coli.

Inoculer une colonie unique d’*E. coli* HjLAD dans trois millilitres de milieu LB supplémenté avec 15 microgrammes par millilitre de Kétamycine, et incuber toute la nuit dans un agitateur incubateur. Le jour suivant, diluer la culture au 1/100 dans 200 millilitres de milieu LB frais contenant 15 microgrammes par millilitre de Kétamycine, puis incuber à 37 degrés Celsius à 250 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 atteigne environ 0,6. Induire l’expression de la protéine HjLAD en ajoutant 0,1 millimolaire d’IPTG au milieu de culture, puis poursuivre l’incubation à 25 degrés Celsius à 200 tr/min pendant six heures.

Récupérez les cellules induites par centrifugation à 3200 ×g et à 4 °C pendant 20 minutes. Éliminez le surnageant et poursuivez le traitement du culot cellulaire comme illustré dans le segment suivant. Pour commencer cette procédure, nous suspendons séparément les culots cellulaires de HjLAD E coli et de SpNox E coli dans un tampon Tris-HCl 50 millimolaire, à une densité cellulaire de cinq grammes de poids sec de cellules par litre.

Dans un tube rond de 14 millilitres, mélanger 600 microlitres de *E. coli* HjLAD à une concentration de cinq grammes de poids sec de cellules par litre, 600 microlitres de *E. coli* SpNOx à une concentration de cinq grammes de poids sec de cellules par litre, 100 microlitres de NAD+ à 20 millimolaire, et 150 microlitres de L-arabinitol à deux molaire. Compléter le volume réactionnel à deux millilitres en ajoutant 550 microlitres de Tris-HCl à 50 millimolaire. Incuber le mélange réactionnel à 30 degrés Celsius et 200 tr/min pendant huit heures.

Après huit heures, centrifuger le mélange à 3200 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes, puis récupérer le surnageant de la réaction. Pour quantifier la production de L-xylulose par un dosage colorimétrique, prélever 100 microlitres du surnageant recueilli dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 50 microlitres de cystéine à 1,5 %, 900 microlitres d'acide sulfurique à 70 % et 50 microlitres de Kar-Piz-All à 0,1 % dissous dans l'éthanol, puis mélanger délicatement en retournant le tube trois fois.

Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius et à 200 tr/min pendant 20 minutes. Mesurer l'absorbance optique du mélange réactionnel à 560 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre. Commencer le protocole d'immobilisation en préparant une solution d'alginate à 4 %.

Ajouter 0,8 gramme d'alginate de sodium à 20 millilitres d'eau distillée, puis chauffer le mélange afin de dissoudre l'alginate de sodium. Ajouter 600 microlitres d'Escherichia coli HjLAD à une concentration de cinq grammes de poids sec cellulaire par litre et 600 microlitres d'Escherichia coli SpNOx à une concentration de cinq grammes de poids sec cellulaire par litre à 1,2 millilitre de la solution d'alginate à 4 %. Mélanger les cellules et l'alginate par pipetage doux afin d'éviter la formation de bulles.

Pour garantir la formation de billes d'alginate de taille, de morphologie et de rigidité uniformes, il est essentiel d'ajouter la suspension de cellules dans l'alginate à une distance optimale, de manière lente et goutte à goutte, dans un volume suffisant de solution de chlorure de calcium afin de recouvrir toutes les billes. Aspirez la suspension de cellules dans l'alginate dans une seringue à l’aide d’une aiguille, puis ajoutez le mélange goutte à goutte dans une solution de chlorure de calcium à 0,3 molaire contenue dans un bécher de 100 millilitres sous agitation continue. Laissez les billes dans la solution de chlorure de calcium de deux à trois heures à température ambiante, sans agitation, afin de permettre la réticulation.

Versez délicatement la solution de chlorure de calcium dans un tube conique de 15 millilitres sans perturber les billes. Transférez les billes restantes dans un autre tube conique de 50 millilitres. Pour éliminer l'excès de chlorure de calcium et les cellules non encapsulées, lavez les billes avec un tampon Tris-HCl 50 millimolaire.

Ajoutez 10 millilitres de tampon aux billes et laissez la suspension reposer sans perturbation pendant trois à cinq minutes. Une fois que les billes se sont déposées au fond, décantez le tampon dans un autre récipient. Lavez ainsi les billes trois fois.

Ne pas centrifuger les billes à aucune étape, car elles se rompraient. Ne pas jeter le tampon de lavage Tris-HCl utilisé. Prélever les 30 millilitres de tampon de lavage utilisé avec la solution de chlorure de calcium utilisée collectée précédemment.

Éliminer par centrifugation les cellules d’E. coli non immobilisées en centrifugeant la solution de chlorure de calcium et de Tris-HCl à 3200 × g pendant 20 minutes. Transférer les billes lavées dans un tube. Évaluer ensuite la biosynthèse de l’L-xylulose selon la procédure décrite pour les culots cellulaires, mais en utilisant toutes les billes lavées à la place des culots cellulaires.

Pour évaluer la stabilité des biocatalyseurs immobilisés pour la production de L-xylulose, récupérez les billes après leur formation. Lavez-les deux fois avec 10 millilitres de tampon Tris-HCl 50 millimolaire sans centrifugation, comme indiqué précédemment. Utilisez toutes les billes lavées pour effectuer la réaction de production de L-xylulose, comme démontré précédemment.

Quantifiez la production de L-xylulose par un dosage colorimétrique, comme démontré précédemment. Répétez la réaction de production de L-xylulose pour le nombre de cycles de production souhaité, et mesurez la quantité de L-xylulose produite dans le surnageant de la réaction à chaque cycle. La production de L-xylulose est améliorée par ce système biocatalytique cellulaire couplé.

À partir d'une concentration initiale de 150 millimolaire de L-arabinitol, l'utilisation du biocatalyseur HjLAD E coli seul a produit un rendement de 79 % de L-xylulose. En comparaison, l'utilisation des cellules HjLAD E coli et SpNOx E coli dans un rapport de un à un a produit un rendement de 96 % de L-xylulose. Une évaluation des paramètres influençant l'efficacité de l'immobilisation du biocatalyseur a révélé que l'efficacité augmente avec la concentration croissante d'alginate de sodium dans la gamme de un à trois pourcents.

Cependant, des concentrations d'alginate de sodium supérieures à 2 % entraînent une diminution du rendement en L-xylulose. En utilisant une concentration d'alginate de sodium de 2 %, la concentration optimale de chlorure de calcium pour l'immobilisation et le rendement en L-xylulose a été déterminée à 0,3 molaire. La réutilisabilité du biocatalyseur a été évaluée.

Dans ce graphique, la production de L-xylulose au cours de sept cycles successifs de réutilisation de biocatalyseurs cellulaires couplés immobilisés et libres est indiquée respectivement en gris foncé et en gris clair. Bien que le rendement maximal en L-xylulose obtenu avec les biocatalyseurs cellulaires couplés immobilisés soit inférieur à celui obtenu avec un système cellulaire couplé libre, la réutilisabilité est améliorée par l'immobilisation. À l'issue de sept cycles successifs de réutilisation, les biocatalyseurs immobilisés ont conservé leur stabilité et ont maintenu 65 % du rendement initial en L-xylulose.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biocatalyse pour explorer les rendements de biocatalyseurs complets à base de cellules multiples, ainsi que les principales réactions impliquant des cofacteurs.