Évaluation de la neurogenèse primaire en Xenopus Embryons Utilisation de immunocoloration
12 avril 2016
Cet article présente une méthode pratique et rapide pour la visualisation de différentes populations de cellules neuronales dans le système nerveux central d'embryons de xénope utilisant immunofluorescence sur des coupes.
L’objectif global de cette expérience est de permettre une visualisation rapide et pratique de différentes populations de cellules neuronales dans le cerveau embryonnaire de xénope en développement. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse primaire, telles que l’observation du processus de régulation de la différenciation neuronale dans le système nerveux central du xénope. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’observation simultanée du pool de progéniteurs de cellules souches neurales, ainsi que d’un pool de neurones primaires différenciés au sein d’une seule expérience.
Pour commencer cette procédure, aspirez soigneusement cinq à dix embryons du flacon en verre à l’aide d’une pipette en plastique ou en verre sans introduire de bulles d’air. Transférez les embryons dans la chambre de montage et observez-les sous un stéréoscope. Remplissez la chambre de montage avec une solution de gélatine pour assurer la rigidité du bloc de section.
Ensuite, disposez les embryons côte à côte à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine. Marquez l’orientation de la tête en dessinant une flèche sur le bord de la chambre à l’aide d’un marqueur compatible cryogénique. Pour plusieurs groupes d’embryons, notez la description de chaque groupe sur le bord de la chambre correspondante.
Ensuite, placez soigneusement la chambre horizontalement dans une boîte en mousse à moitié remplie de glace sèche. Fermez le couvercle et laissez la chambre de montage geler une à la fois pendant cinq à dix minutes. Après cela, procédez à la cryosection ou conservez les échantillons congelés à 80 degrés Celsius pendant au moins une à deux semaines sans perdre en immunogénicité.
Dans cette procédure, retirez le bloc d’échantillon congelé de la chambre en appuyant sur le fond de la chambre à l’aide d’un bâton émoussé ou d’un doigt. Ensuite, ajoutez plusieurs gouttes de milieu de congélation des tissus sur le disque de maintien de l’échantillon. Montez le bloc d’échantillon avec l’extrémité antérieure des embryons pointant vers le haut et laissez le bloc monté à l’intérieur de la chambre du cryostat pendant environ une minute, ou jusqu’à ce que le milieu de congélation des tissus devienne opaque.
Installez immédiatement le disque de rétention de l’échantillon sur le microtome avec la face inférieure du bloc d’échantillon vers le haut. Coupez une partie du bloc d’échantillon à l’aide d’une lame lorsque le bloc d’échantillon est encore relativement mou. Ensuite, laissez le disque de rétention de l’échantillon sur le microtome pendant au moins cinq minutes pour permettre à sa température d’atteindre l’équilibre.
Ensuite, coupez progressivement le bloc d’échantillon jusqu’à ce que la tête des têtards soit visible à travers la gélatine translucide. Pour augmenter la vitesse de coupe, augmentez l’épaisseur de la section. Surveillez les performances du cryostat, telles que la netteté et l’angle de la lame, pour vous assurer que les sections suivantes sont générées dans une longue bande.
Une fois que les têtes de têtards deviennent visibles, ajustez les paramètres du cryostat à la normale, pour vous assurer que les tranches finies peuvent former des bandes et ne se chevauchent pas ou ne collent pas à la lame. Ensuite, continuez à tailler jusqu’à ce que la tête des têtards soit presque exposée. Brossez toutes les sections restantes sur la scène avant de commencer à collecter les sections d’échantillons.
Faites environ 10 à 15 sections et laissez-les former une longue bande. Retournez la plaque de verre de couverture épaisse sur le côté et retirez délicatement la bande de la lame à l’aide d’un pinceau à pointe fine. Ensuite, disposez-le sur la platine avec le grand axe parallèle à la lame.
Faites 10 à 15 sections et laissez-les former une longue bande sans les casser. Ce n’est peut-être pas facile et demande de la pratique. Une astuce consiste à essayer de ne pas appliquer la vitesse trop élevée sur le volant.
Au lieu de cela, tournez le volant avec précaution et lentement. Après cela, choisissez une lame chargée positivement à température ambiante et étiquetez-la avec un crayon. Ensuite, pressez-le rapidement et fermement sur la bande avec le côté étiqueté vers le bas.
Ensuite, retirez la lame de la chambre du cryostat. Répétez cette étape pour disposer 20 à 30 tranches en parallèle sur chaque diapositive. Faites sécher les côtés à l’air libre pendant 10 minutes, puis passez immédiatement à la procédure d’immunocoloration ou conservez les lames dans une boîte à lames à 80 degrés Celsius jusqu’à trois à six mois avant la procédure d’immunomarquage.
Ici, nous pouvons voir les plans de coupe correspondants du cerveau antérieur, du mésencéphale, du cerveau postérieur et de la moelle épinière d’un têtard de xénope qui seront utilisés pour fournir des références de position pour les images suivantes. Les coupes efficaces correspondantes, qui ont été colorées avec de l’Anti-Sox 3, de la tubuline anti-acétylée et du DAPI, montrent les emplacements relatifs des pools de cellules souches neurales ainsi que des neurofilaments dans le tube neural. Et voici les coupes transversales correspondantes colorées avec Anti-MyT1 et DAPI qui montrent les emplacements relatifs des neurones primaires différenciés dans le tube neural.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’assurer un temps de refroidissement suffisant pour le bloc d’échantillon dans la glace sèche. Sinon, le bloc d’échantillon risque de ne pas être assez dur et donc difficile à couper.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences du développement pour explorer la différenciation neuronale dans le système nerveux central du xénope. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire des coupes et d’observer des pools spécifiques de cellules neuronales dans un système nerveux central de xénope.
Aperçu
Cet article présente une méthode rapide permettant de visualiser différentes populations de cellules neuronales dans le système nerveux central d'embryons de Xenopus à l'aide d'une coloration immunofluorescente. Cette technique facilite l'observation des processus de différenciation neuronale dans une seule expérience.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Techniques d'immunofluorescence
Contexte
- La compréhension de la différenciation neuronale est essentielle en neurosciences du développement.
- Les embryons de Xenopus servent de modèle pour l'étude de la neurogenèse.
- La coloration immunofluorescente permet la visualisation de populations neuronales spécifiques.
- Cette méthode peut fournir des informations sur la régulation des cellules souches neurales.
Objectif de l'étude
- Développer une technique permettant l'observation simultanée des cellules souches progénitrices et des neurones différenciés.
- Faciliter l'étude de la neurogenèse primaire chez les embryons de Xenopus.
- Fournir une méthode fiable pour visualiser les populations neuronales dans le système nerveux central.
Méthodes utilisées
- Aspiration des embryons et préparation pour la cryocoupe.
- Utilisation d'un cryostat pour obtenir des sections minces des embryons.
- Coloration des sections avec des anticorps spécifiques afin de visualiser les populations neuronales.
- Observation des sections colorées au microscope pour analyser les résultats.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des réservoirs de cellules souches neurales et des neurones différenciés.
- Identification de populations neuronales spécifiques dans le prosencéphale, le mésencéphale, le rhombencéphale et la moelle épinière.
- Démonstration de l'efficacité de la technique, permettant son achèvement en environ deux heures.
- Validation de la méthode pour des études futures en neurosciences du développement.
Conclusions
- Cette technique améliore la capacité à étudier la différenciation neuronale chez Xenopus.
- Elle fournit un outil précieux aux chercheurs en neurosciences du développement.
- Des applications futures pourraient permettre des découvertes plus approfondies sur la neurogenèse et les processus associés.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle
Cette méthode permet la visualisation simultanée des cellules souches neurales progénitrices et des neurones primaires différenciés chez les embryons de Xenopus, facilitant ainsi la réduction des risques mécanistiques lors de la validation précoce des cibles. En fournissant des données quantitatives spatiales sur la différenciation neuronale, elle renforce la fiabilité prédictive de l'analyse des voies et de l'évaluation fonctionnelle des cibles. L'approche offre un système pertinent pour étudier les mécanismes neurogéniques dans un contexte pathologique, avec une continuité translationnelle vers les modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en visualisant simultanément des pools de cellules souches neurales et des neurones différenciés au cours d'une même expérience.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection précoce des risques biologiques grâce à l'observation directe de la dynamique de différenciation neuronale.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en reliant des perturbations moléculaires à des modifications observables au sein des populations neurogéniques.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-analyser : Produit des coupes standardisées et reproductibles, adaptées à l'imagerie à haut contenu et à l'analyse quantitative.
- Extensibilité : Permet la préparation de 20 à 30 coupes parallèles par lame pour le criblage multiplexé d'anticorps.
- Réutilisation de la plateforme : Autorise le stockage à long terme des lames à -80 °C pendant jusqu'à six mois, facilitant le traitement par lots et la comparaison entre expériences.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Fournit un système modèle de vertébré permettant d'étudier des mécanismes conservés de neurogenèse primaire applicables aux troubles du développement neurologique humain.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les observations découlant de la découverte et la validation préclinique en permettant des lectures phénotypiques cohérentes tout au long des stades de développement.
- Décisions ajustées au risque : Facilite les évaluations de poursuite ou d'abandon en quantifiant les changements entre les compartiments de progéniteurs et de neurones différenciés.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de découverte précoce en fournissant des données quantitatives, résolues spatialement, sur la différenciation neuronale, ce qui éclaire les étapes de validation de la cible et d'identification des candidats prometteurs.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en permettant la visualisation directe des niches neurogéniques et des résultats de différenciation.
- Criblage : Fournit des sections prêtes à l'analyse, de taille et d'orientation standardisées, pour une immunomarquage et une imagerie fiables.
- Analytique : Produit des mesures quantitatives à l'aide d'indicateurs d'intensité de fluorescence et de co-localisation (par exemple, populations Sox3+/AcTub+ par rapport à MyT1+) afin de comparer les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les travaux précliniques grâce à des mécanismes neurogéniques conservés chez les modèles de vertébrés, soutenant l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme histologique réutilisable pour l'interrogation itérative de cibles dans plusieurs projets et à différents points temporels.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en reliant directement les perturbations génétiques ou pharmacologiques à des modifications des pools de cellules souches et de neurones différenciés.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation grâce à des protocoles de cryocoupes et des conditions de stockage des lames qui préservent l'antigénicité pendant plusieurs mois.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une évaluation multiplexée des cibles dans un seul flux de travail histologique.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en fournissant des critères objectifs et visuels d'activité neurogénique lors de la progression du « hit » au « lead ».
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des embryons, la cryodisséction et les techniques d'immunofluorescence.
- Est tributaire d'une infrastructure comprenant un cryostat, un microtome et un microscope à fluorescence.
- Exige une standardisation interéquipes de l'orientation des coupes et des protocoles de coloration pour des résultats reproductibles.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation des paramètres d'encapsulation et de sectionnement.
- Les limitations pratiques incluent la fragilité des tissus lors du sectionnement et la nécessité d'un contrôle précis de la température pour préserver l'intégrité des échantillons.
