Name: Un roman Ovo Ex Banding Technique dAlter intracardiaque hémodynamique dans un système embryonnaire de poulet (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez la technique de bandage ex ovo pour modifier l'hémodynamique cardiaque chez l'embryon de poulet. Cette méthode permet d'étudier les conséquences génétiques des changements hémodynamiques sur le développement des valves cardiaques.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Robert Price et le personnel de l’Instrumentation Resource Facility de la faculté de médecine de l’Université de Caroline du Sud. Ce travail a été partiellement soutenu par une subvention de recherche supérieure SPARC du bureau du vice-président de la recherche de l’Université de Caroline du Sud (JDP/VM). De plus, ces travaux ont été soutenus par l’accord de recherche de Cook Biotech (JDP) et par FirstString Research Inc (JDP) et NIH 2 P20-RR016434-06 (JDP). De plus, la subvention NIH IDeA Networks of Biomedical Research Excellence (INBRE) pour la P20GM103499 de Caroline du Sud (JE)

embryons aviaires ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés en vertu des règlements IUCAC. 1. Obtenir Embryons pour la chirurgie <ol><li> Incuber 80 - 90 fécondés des œufs de poule Bovan (extrémités franches de haut) dans un humidifié (60%) rocker incubateur à 40 ° C pendant environ 72 heures pour obtenir des embryons à Hamilton et Hamburger (HH) étape 17. Déterminer le nombre exact d&#39;oeufs sur la base analyse de puissance et le taux d&#39;embryons 17 de survie. Utiliser des plateaux d&#39;œufs en plastique pour l&#39;incubation pour permettre la circulation d&#39;air suffisante. </li><li> Une fois que ce stade de développement souhaité est atteint, verser environ 20 ml (37 ° C) tampon chaud Tyrode (supplémenté avec du bicarbonate de sodium (1 g / L)) dans un 100 mm x 26 mm boîte de Pétri. </li><li> Stériliser une coquille d&#39;œuf avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> casser délicatement la coquille avec une poignée de scalpel et relâcher soigneusement son contenu dans le plat contenant du tampon de Tyrode. Jeter les embryons (i) si elles apparaissent visuellement anormale (ii) ilsne sont pas au stade de développement à droite (iii) ils sont mal orientés sur le jaune et / ou (iv) un saignement se produit. Conservez tous les embryons non soumis à une intervention chirurgicale immédiatement après avoir été placé ex ovo à 40 ° C afin de ne pas compromettre le développement. Note: Staging est effectuée sur la base de Hamilton et Hamburger 18. Anormalité d&#39;embryons de poulet est déterminé par l&#39;oeil nu et dans le champ de dissection. Veiller à ce que l&#39;embryon a le pliage approprié et à la flexion et de la vascularisation. </li></ol> 2. OFT Banding <ol><li> Tweeze sur chaque 1 cm de longs fils d&#39;une seule suture chirurgicale 11/0 en nylon et former un noeud lâche. UV stériliser tous les noeuds préformés. </li><li> Sous un microscope de dissection, assurer visuellement que le cœur bat à un rythme normal (~ 120 battements / min). Sinon, jetez l&#39;embryon. </li><li> Juste avant la chirurgie, appliquer 5 - 6 ml de (C 37 °) tampon chaud Tyrode à la surface de l&#39;embryon à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Passez une extrémité libre du noeud préformé sous l&#39;OFT, positionner le fil de suture à l&#39;OFT / ventricule jonction (OVJ) (ou l&#39;emplacement désiré), et passer l&#39;extrémité libre dans le noeud constriction ainsi l&#39;OFT, y compris les membranes entourant le cœur. </li><li> Après la chirurgie, mouiller la surface du jaune d&#39;oeuf avec 5 - 6 ml d&#39;une chaude (37 ° C) du tampon de Tyrode à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Maintenir les embryons de contrôle ex ovo que les embryons bagués; mais ne pas les soumettre à la procédure chirurgicale. </li><li> Incuber les embryons, pour la durée désirée, à 40 ° C dans un (60%) incubateur humidifié. </li><li> Une fois le point de temps désiré est atteint, exciser l&#39;embryon du jaune à l&#39;aide des ciseaux droits. Disséquer le cœur avec une pince fine et utiliser pour plusieurs études en aval tels que les changements dans la morphologie cardiaque due à l&#39; hémodynamique modifiée 17. </li></ol> 3. Confirmant que l&#39;intervention de baguage provoque un changement dans hémodynamique Remarque: le rétrécissement partiel provoquée par l&#39;intervention de cerclage conduit à une augmentation de la vitesse d&#39;écoulement du sang à l&#39;OVJ. Ce paramètre hémodynamique est commodément déterminée en utilisant l&#39;imagerie par échographie 2D, qui est effectuée au niveau du point de temps désiré de l&#39;expérience. <ol><li> Etant donné que seulement un seul embryon peut être imagée à la fois, maintenir tous les autres embryons désignés pour l&#39;imagerie par ultrasons dans un incubateur à 40 °. </li><li> Placez la boîte de Pétri contenant l&#39;embryon à imager sur un coussin chauffant à 40 ° C. </li><li> Remplissez le plat, jusqu&#39;au bord, avec un tampon chaud (37 ° C) Tyrode. Verser lentement la solution tampon dans le plat de manière à maintenir le jaune intact. Cependant, si l&#39;intégrité du jaune d&#39;oeuf est compromise au cours de cette étape, éliminer l&#39;embryon. </li><li> Orienter l&#39;embryon de telle sorte que l&#39;axe central de l&#39;embryon est perpendiculaire à la sonde à ultrasons qui est suspendu à partir d&#39;un support réglable. </li><li> Avec l&#39;opéra de machine à ultrasonsting en mode B, obtenir une image 2D du cœur battant à l&#39;écran et déplacer la scène (coussin chauffant) de telle sorte que l&#39;OFT, ventricule et OVJ sont clairement visibles. </li><li> Passez en mode pulsé onde (PW), à la fréquence de répétition d&#39;impulsion souhaitée (par exemple, 20 kHz) et d&#39; obtenir des données de vitesse exactement au OVJ. Une image en mode B du cœur battant est obtenu sur l&#39;écran. <ol><li> Déplacer la scène pour voir l&#39;OFT, le ventricule et l&#39;OVJ. Utilisation du logiciel de la machine à ultrasons, d&#39;obtenir des mesures de vitesse exactement au OVJ. </li></ol></li></ol> Remarque: Si le taux d&#39;un embryon cardiaque diminue lors de l&#39;imagerie, les données de vitesse ainsi obtenues ne doivent pas être utilisés pour l&#39;analyse. Tous les embryons utilisés pour des mesures de vitesse doivent de préférence être utilisés pour d&#39;autres expériences après l&#39;imagerie par ultrasons.

<ol><li>Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+outflow+tract+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac outflow tract anomalies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 499-530 (2013).</li>
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<li>Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+vitelline+vein+ligation+alters+intracardiac+blood+flow+patterns+and+morphogenesis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo.</a> Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).</li>
<li>Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraembryonic+venous+obstructions+lead+to+cardiovascular+malformations+and+can+be+embryolethal%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal.</a> Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).</li>
<li>Reckova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+is+a+key+epigenetic+factor+in+development+of+the+cardiac+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system.</a> Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).</li>
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<li>Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+hemodynamics+and+mechanical+properties+after+circulatory+intervention+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo.</a> J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).</li>
<li>Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Hemodynamics+in+the+Embryonic+Heart+Affects+Outflow+Valve+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Dev.+Dis%22%5BJournal%5D)">Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 473-481 (1951).</li>
<li>Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+dynamics+reflect+degree+of+outflow+tract+banding+in+Hamburger-Hamilton+stage+18+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos.</a> J R Soc Interface. 11 (100), (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette technique est relativement rapide et facile à réaliser, mais certains points clés doivent être gardés à l&#39;esprit afin d&#39;obtenir des résultats précis en aval. Les embryons doivent être maintenus ex ovo dans une boîte de Pétri contenant du tampon de Tyrode pour fournir une réhydratation adéquate. Il est également important d&#39;hydrater le jaune post-opératoire avec le tampon de Tyrode et assurez-vous que la chambre d&#39;incubation est suffisamment hydratée. Chirurgies ne doivent pas être effectué...

Les soupapes de sortie anormalement formées sont le type le plus courant de malformations cardiaques congénitales 1. Cependant, la structure et la fonction défectueuses des valves cardiaques, même si elles sont présentes à la naissance, ne peuvent devenir symptomatiques qu’à l’âge adulte. En fait, plusieurs maladies valvulaires chez l’adulte peuvent être attribuées à une origine congénitale. Le traitement de ces patients implique souvent le remplacement de valves défectueuses et, surtout, il a été démontré que les valves aortiques remplacées présentaient des anomalies congénitales 2. Étant donné que les processus critiques impliqués dans le développement des valves commencent tôt au cours de l’embryogenèse, l’importance de mieux comprendre les mécanismes qui régulent ces événements est soulignée. 
Le tube cardiaque primitif, qui est le premier organe fonctionnel d’un embryon, présente deux couches distinctes - un endocarde endothélial entouré de myocarde - séparées par une matrice extracellulaire (gelée cardiaque) qui est principalement produite et sécrétée par le myocarde 3-5. Au fur et à mesure que le développement se poursuit, des primordiums valvulaires (coussinets endocardiques) se forment, après la boucle vers la droite du cœur embryonnaire, par expansion locale de la gelée cardiaque au niveau du canal auriculo-ventriculaire (AV) et de la voie d’éjection (OFT) 4,6. Cette expansion est médiée par le processus hautement régulé de transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), au cours duquel la gelée cardiaque devient peuplée de cellules mésenchymateuses dérivées de l’endocarde 6. En plus de la population mésenchymateuse dérivée de l’EMT, les cellules de la crête neurale sont également impliquées dans la valvulogenèse de l’OFT 3. 
Les stimuli hémodynamiques, tels que le stress de cisaillement, sont des facteurs épigénétiques importants qui régulent le développement cardiaque chez l’embryon 7,8. À l’aide d’un système 3D in vitro, nous avons précédemment montré que le stress de cisaillement est un facteur influençant l’expression et le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire fibreuse (ECM) dans les coussins AV et OFT 9,10. De plus, des études menées par plusieurs chercheurs ont démontré que la modification du flux sanguin entraîne une formation incorrecte de valves et de septa 11-16. Récemment, en utilisant la nouvelle procédure de baguage présentée ici, nous avons montré que la modification de l’hémodynamique dans le cœur embryonnaire du poussin affecte les processus précoces impliqués dans la formation de la valve OFT 17.
La technique décrite ici fournit un nouveau modèle pour modifier l’hémodynamique dans le cœur de poussin en développement en resserrant partiellement l’OFT ex ovo. Cette procédure reproductible est relativement rapide et permet aux chercheurs d’obtenir un nombre suffisant d’embryons, de cœurs entiers, de tissus OFT, etc., pour des analyses en aval, y compris des études d’expression génique. De plus, ce nouveau modèle peut être utilisé pour étudier les effets « chroniques » de l’hémodynamique altérée sur le développement de la valve OFT.

<table><tbody><tr><td>Oeufs de poule Bovan fécondés</td><td>Clemson University, Clemson, SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11 / 0 Suture en nylon</td><td>Ashaway</td><td>S30001</td><td>UV stériliser les nœuds avant la chirurgie</td></tr><tr><td>100 x 26 mm boîte de Pétri</td><td>VWR</td><td>25387-030</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux droits</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Tyrodes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2145-10L</td><td>Filtrer avant utilisation&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Fisher</td><td>Scientific S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 Système d’imagerie par ultrasons</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11392</td><td></td></tr><tr><td>708 Transducteur à ultrasons&nbsp ;</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11171</td><td></td></tr></tbody></table>

un roman<em&gt; ovo ex</em&gt; banding technique d&#39;alter intracardiaque hémodynamique dans un système embryonnaire de poulet

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Le nouveau modèle présenté ici permet de comprendre l’influence de l’hémodynamique sur des processus spécifiques de développement cardiaque, au niveau cellulaire et moléculaire. Pour modifier l’hémodynamique intracardiaque, les œufs de poule fécondés sont incubés dans une chambre humidifiée afin d’obtenir des embryons du stade souhaité (HH17). Une fois ce stade de développement atteint, l’embryon est maintenu ex ovo et l’hémodynamique dans le cœur embryonnaire est modifiée par la constriction partielle de la voie d’écoulement (OFT) avec une suture chirurgicale à la jonction de l’OFT et du ventricule (OVJ). Les embryons témoins sont également cultivés ex ovo mais ne sont pas soumis à l’intervention chirurgicale. Les embryons bagués et témoins sont ensuite incubés dans un incubateur humidifié pendant la période de temps souhaitée, après quoi des ultrasons 2D sont utilisés pour analyser le changement de vitesse du flux sanguin à l’OVJ à la suite de l’anneau OFT. Une fois que les embryons sont maintenus ex ovo, il est important d’assurer une hydratation adéquate dans la chambre d’incubation afin d’éviter le dessèchement et éventuellement la mort de l’embryon. Grâce à ce nouveau modèle à bandes, il est désormais possible d’analyser les changements d’expression des acteurs clés impliqués dans le développement des valves et de comprendre le rôle de l’hémodynamique sur les réponses cellulaires in vivo, ce qui n’était pas possible auparavant.

Montré dans la figure 1 sont des instruments nécessaires pour le baguage OFT recommandé. La boîte de Pétri (figure 1A) contenant l&#39;embryon ex ovo doit être assez profond pour ne pas détruire l&#39;embryon lorsqu&#39;il est recouvert avec le couvercle. Des boîtes de Pétri profondes (figure 1c) doivent également être utilisés pour l&#39; imagerie par ultrasons afin de permettre à un volume suffisant de tampon de Tyrode à coule...

Pour la première fois, nous présentons ici une procédure de bande reproductible pour modifier l’hémodynamique dans le cœur en développement ex ovo. Ceci est réalisé en resserrant partiellement la voie d’écoulement (OFT).

Un roman<em&gt; Ovo Ex</em&gt; Banding Technique d&#39;Alter intracardiaque hémodynamique dans un système embryonnaire de poulet

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

L'objectif général de cette procédure de ligature ex ovo est de créer une altération reproductible et non létale de l'hémodynamique cardiaque afin d'étudier les conséquences génétiques qui en résultent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement cardiovasculaire, telles que le développement des valves cardiaques et les affections associées. L'intérêt de ce système réside dans sa capacité à étudier les voies génétiques qui répondent aux modifications de l'hémodynamique dans le cœur et les valves en développement, ainsi que dans l'identification d'un seuil critique au-delà duquel la récupération d'un cœur ne présente plus d'effets néfastes à long terme.Ainsi, la démonstration de la procédure sera réalisée par Lorain Junor, technicienne de mon laboratoire, et Monsieur Vinal Menon, étudiant en doctorat dans le laboratoire, qui montreront la manipulation des œufs et l'utilisation de l'appareil à ultrasons. Incuber de 80 à 90 œufs de poulet Bovan fécondés, en les plaçant avec leur extrémité arrondie vers le haut, sur des plateaux en plastique dans un incubateur rotatif humidifié réglé à 40 degrés Celsius. Laisser le développement durer envir

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