Name: Isolement et caractérisation dune tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Découvrez l'isolement de cellules souches cancéreuses du carcinome épidermoïde de la tête et du cou par cytométrie en flux multiparamétrique. Cette méthode permet d'étudier la résistance aux traitements et la récidive tumorale.

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Nous remercions Thibault Andrieu et Sébastien Dussurgey de la Plateforme de Cytométrie en Flux de l’UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) pour leurs conseils et leur aide lors de notre tri. Ce travail a été réalisé dans le cadre scientifique de l’ETOILE et du Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives locales sur les soins aux animaux. Tous les détails de cette étude ont été approuvés par le CECCAPP, un comité d&#39;éthique français. 1. La sélection d&#39;une population latérale (SP) par le colorant Hoechst efflux Dosage <ol><li> Coloration 50 millions de cellules avec le colorant Hoechst 33342. <ol><li> Préparer deux 15 ml dans des tubes stériles à fond conique: un tube marqué &quot;HOECHST&quot; et une étiqueté «Hoechst et vérapamil». Préparer 10 ml de solution de chlorhydrate de vérapamil 5 mM dans de l&#39;eau stérile. Préparer le milieu de culture (MC) pour les cellules souches. <ol><li> Pour préparer CM pour le SCC (CM-CSC), combiner les éléments suivants: Eagle modifié milieu de Dulbecco (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% de sérum de veau foetal (FCS), 0,04 mg / L d&#39;hydrocortisone , 100 U / ml de pénicilline, 0,1 g / l de streptomycine et 20 ug / L de facteur de croissance épidermique (EGFR). </li></ol></li><li> Sous une hotte à flux laminaire, trypsiniser cellules. Retirez le support, laver avec sle phosphate de terile une solution saline tamponnée (PBS) et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (0,5 g / L) pour un flacon de 75 cm. Incuber 3 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant du milieu de culture utilisé pour la lignée cellulaire parentale. Compter le nombre de cellules en utilisant un compteur de cellules. <ol><li> Pour préparer CM lignée cellulaire parentale (CM-P), de compléter DMEM avec 10% de FCS, 0,4 mg / L d&#39;hydrocortisone, 100 U / ml de pénicilline et 0,1 g / L de streptomycine). </li></ol></li><li> Diluer la suspension cellulaire obtenue à l&#39;étape 1.1.2 pour obtenir 10 7 cellules / ml dans du CM-P. Divisez la suspension cellulaire dans les 2 tubes préparés: mettre 100 pi (10 6 cellules) dans le tube &quot;Hoechst et vérapamil&quot; et 4 ml (4 x 10 7 cellules) dans le tube &quot;Hoechst&quot;. </li><li> Dans l&#39;échantillon &quot;Hoechst et vérapamil&quot;, ajouter 10 pi de solution de chlorhydrate de 5 mM vérapamil (concentration finale: 0,5 mM) et mélanger doucement. Ajouter 5 ul de 1 g / L de solution de Hoechst (concentration finale: 0,1 g / l). Dans l&#39;échantillon &amp; #34; Hoechst &quot;, ajouter 5 pl de 1 g / solution par 10 6 cellules (200 au total ul) L Hoechst Désormais, conserver les échantillons protégés contre l&#39; exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d&#39;aluminium.. </li><li> Incuber tous les tubes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 1 h 30 min. Mélanger doucement toutes les 15 min pour empêcher les cellules de s&#39;installer. </li><li> Tubes à centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot avec 2 ml de 1 x PBS. </li><li> Tubes à centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Resuspendre &quot;Hoechst et le vérapamil&quot; culot dans 500 pl de 5 mg / l d&#39;iodure de propidium (PI) dilué dans du tampon PBS et le culot &quot;HOECHST&quot; dans 4 ml de 5 mg / L PI dilué dans du tampon PBS. </li><li> Transfert solutions d&#39;échantillon à travers un tamis de 70 um cellulaire pour éliminer les agrégats et de recueillir des cellules individuelles dans des tubes pour l&#39;absorption de l&#39;échantillon sur la cytométrie de flux. Conserver les échantillons sur la glace et la protection contre l&#39;exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li></ol></li><li> jesolation de la population latérale Hors colorant Hoechst par Cell Sorting. <ol><li> Effectuer Hoechst séparation cellulaire négative sur une cytométrie en flux trieur avec les paramètres suivants: laser UV (355 nm), 2 détecteurs sur le chemin laser UV avec Hoechst bleu (450/50 BP) et rouge Hoechst (610/20 BP) filtres, et 2 collectionneurs. <ol><li> Tout d&#39;abord, analyser l&#39;échantillon &quot;Hoechst&quot; qui sert de contrôle positif pour la coloration et cytomètre de flux set-up. </li><li> Utilisation du logiciel cytomètre, sur la fenêtre &quot;Global Feuille&quot;, cliquez sur &quot;Dot Plot&quot; (cinquième top photo de droite) et de créer un graphique sur la feuille de calcul global. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez FSC-A (diffusion vers l&#39; avant) et sur ​​l&#39; abscisse, SSC-A (diffusion latérale) (figure 1A). De la même manière, créer un SSC-W par rapport SCC-H dot plot. Sur ce second tracé de points, pour créer une région de P1, cliquez sur &quot;Polygon gate&quot; (quatorzième top photo de droite) (figure 1B) 33. Note: La région P1 seraenglober des cellules individuelles et discriminer doublets. </li><li> Facultatif: Exclure PI cellules positives en créant une FSC-A par rapport à PI fermée sur P1. Sur cette parcelle de point, sélectionnez la population négative PI (P2) pour exclure les cellules mortes positives PI. </li><li> Utilisation du logiciel cytomètre, sur la fenêtre &quot;Global Feuille&quot;, cliquez sur &quot;Dot Plot&quot; et créer un graphique sur la feuille de calcul global. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez bleu Hoechst-A et abscisse, rouge Hoechst-A. Avec un clic droit sur la population, sélectionnez &quot;Afficher la population» et P1. Sur cette parcelle de point, créer une région (P2) pour sélectionner les cellules négatives population du côté de colorant Hoechst (SP) qui apparaît comme un bras latéral sur la gauche de la principale population de cellules (figure 1C). </li></ol></li><li> Analyser l&#39;échantillon &quot;Hoechst&quot; et de recueillir 10.000 événements. Pour veiller à ce que la porte P2, qui représente la population de SP, est bien placé, analyser l&#39;échantillon &quot;Hoechst et vérapamil&quot; (10.000 événements)d&#39;observer la disparition de la population de SP (figure 1D). </li><li> Collecter les SP Hoechst colorant cellules négatives dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de CM-CSC préparés 1.1.1.1. </li><li> A la fin du tri cellulaire, centrifuger la suspension de cellules à 250 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 1 ml de CM-SCC. Compter le nombre de cellules triées en utilisant un compteur de cellules et de transférer un nombre approprié de cellules dans un flacon de culture (voir le tableau 1). Ajouter CM-CSC et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 atmosphère. </li><li> Maintenir des cellules en culture dans les mêmes conditions pour un maximum de 2 passages jusqu&#39;à ce qu&#39;il y ait un minimum de 5 x 10 7 cellules (voir l&#39; étape 3, &quot;méthode de culture cellulaire»). </li></ol></li></ol> 2. Sélection de la haute / ALDH élevée Sous-population CD44 dans la population Side Classé <ol><li> Coloration 50 millions de cellules SP avec le kit de détection ALDH et CD44 Anticorps. <ol><li> Préparer sept tubes de 15 ml stériles étiquetés comme suit: «non marqué» (Tube a), &quot;CD44-APC&quot; (Tube b), &quot;IgG1-APC&quot; (Tube c), &quot;ALDH&quot; (Tube d), &quot;ALDH et DEAB &quot;(Tube e),&quot; ALDH et CD44-APC &quot;(Tube f),&quot; ALDH, DEAB et CD44-APC &quot;(Tube g). Conservez tous les tubes et réactifs à 4 ° C au cours de la coloration. </li><li> Préparer un tampon A avec 4,5 ml de tampon 1 (contenue dans le kit) et 45 pi de CD44-APC (allophycocyanine) anticorps (dilution 1: 100). Préparer un tampon B avec 100 ul de tampon 1 et 1 pi d&#39;anticorps IgG1-APC (dilution 1: 100). Préparer le tampon C avec 4 ml de tampon 1 et 20 ul du réactif de la trousse. </li><li> Préparer une suspension cellulaire des cellules préalablement trié (étape 1.2.5) à 10 7 cellules / ml. Ajouter 100 pl (10 6 cellules) de la suspension cellulaire sur les tubes a, b et c et 4 ml (4 x 10 7 cellules) à tubes f. Pour le moment, ne pas mettre les cellules dans des tubes d, e et g. </li><li> Centrifuger les tubes contenant les cellules à 250 xg pendant 5 min. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans des tubes a, b et c dans 100 ul de tampon 1. Ajouter 5 ul de diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB), un inhibiteur de l&#39;ALDH tubes e et g. <ol><li> Resuspendre les cellules dans le tube f avec 4 ml de réactif C et à transférer immédiatement 100 pl dans des tubes d, e et g. Incuber tous les tubes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30 min et protéger contre l&#39;exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d&#39;aluminium. Mélanger la suspension cellulaire doucement par tourbillonnement au bout de 15 min pour empêcher les cellules de se fixer. </li></ol></li><li> A partir de ce moment, garder les tubes sur la glace et à l&#39;abri de l&#39;exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d&#39;aluminium. Centrifuger tous les tubes à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant. </li><li> tube Resuspendre f dans 4 ml et tubes b et g avec 100 pi de tampon A. Tube Resuspendre c avec 100 pi de tampon B. Pour les autres tubes, ajouter 100 pi de tampon 1. Incuber 10 min à 4 °; C. </li><li> Centrifuger tous les tubes à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant. Rincer une fois avec 1 ml de tampon 1 (4 ml pour le tube f) et centrifuger à nouveau à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans le tube f 4 ml et de tous les autres tubes dans 1 ml de tampon 1. </li><li> Transférer les solutions d&#39;échantillon à travers 70 crépines cellulaires um pour éliminer les agrégats et de recueillir des cellules individuelles dans des tubes appropriés pour l&#39;absorption de l&#39;échantillon sur cytométrie de flux. </li></ol></li><li> Isolement du CD44 haute / ALDH haute cellule Population par Fluorescence tri cellulaire activé. <ol><li> Effectuer CD44 haute / ALDH haute tri cellulaire sur une cytométrie en flux trieur avec les paramètres suivants: laser bleu (488 nm) et le laser rouge (633 nm), 1 détecteur sur le chemin de laser bleu avec un filtre FITC (530/30), 1 détecteur sur le trajet du laser rouge avec un filtre d&#39;APC (660/20) et 2 collecteurs. </li><li> Utilisation du logiciel cytomètre, cliquez sur &quot;Dot Plo(Le cinquième top photo de droite) t &quot;pour créer une FSC-A par rapport SSC-A tracé de points tel que décrit dans la section 1.2.1.2, pour vérifier la morphologie des cellules et sélectionner une population composée de cellules individuelles avec un SSC-W par rapport SSC-H dot plot. </li><li> Utilisation du logiciel cytomètre, sur la fenêtre &quot;Global Feuille&quot;, cliquez sur &quot;Dot Plot&quot; et créer un graphique sur la feuille de calcul global. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez APC-A et abscisse, FITC-A afin de sélectionner la population à double teinté. Créer une porte en utilisant des tubes d et e pour sélectionner des cellules haute ALDH (Figure 2A). Nota: Les cellules positives disparaissent dans le tube électronique traité avec DEAB (figure 2B). <ol><li> Sur le même graphique, créer une deuxième porte en utilisant des tubes b et c afin de sélectionner les cellules CD44 élevées (Figure 2C et 2D). Les cellules positives disparaissent dans le tube contenant IgG1-APC. Analyser tubes f et g et créer une troisième porte qui comprend CD44 haute / ALDH &lt;sup&gt; cellules élevées (Figure 2E et 2F). Remarque: si des cellules positives sont présentes dans le tube contenant IgG1-APC (figure 2D), l&#39;interaction entre les cellules et l&#39;anticorps APC colorées ne sont pas spécifiques. </li></ol></li><li> Collecter CD44 haute / ALDH cellules élevées dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de CM-CSC. Collecter aussi CD44 bas / ALDH bas dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de CM 19. Note: Préparer CM-CSC comme décrit à l&#39;étape 1.1.1.1. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 250 g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre le culot avec 1 ml de CM-CSC. Comptez le nombre de cellules triées. </li></ol></li></ol> 3. Cellule Méthode Culture <ol><li> Après le double-tri des cellules telles que décrites ci - dessus, la plaque les cellules triées dans un flacon de culture approprié (tableau 1) avec CM-CSC à 37 ° C avec 5% de CO 2. Après 18-24 heures,vérifier si les cellules ont adhéré et changer le milieu de culture. Changer le milieu de culture tous les 3 jours jusqu&#39;à ce que les colonies d&#39;expansion est supérieur à 50% confluentes. </li><li> Utiliser le volume approprié de trypsine 0,5 g / l - de l&#39; EDTA (tableau 1) pour trypsiniser cellules du flacon de culture. Incuber les cellules 3 à 5 min à 37 ° C. Ajouter le volume approprié de CM-CSC (Tableau 1) pour arrêter l&#39;action de la trypsine. </li><li> Comptez le nombre de cellules obtenues et la plaque 4 x 10 5 cellules dans un flacon de culture de 175 cm² avec CM-CSC. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. A cette concentration, les cellules avec un temps de doublement de 24 h seront 70% confluentes en 7 jours. </li><li> Utilisez CSCs pour in vitro ou des expériences in vivo avant d&#39;avoir subi 3 passages. </li></ol> 4. Confirmation de la tumeur potentielle et SCC Caractéristiques <ol><li> Tumor Formation Sphère à confirmer le potentiel de tumeur de la CD44 haute / ALDHLes cellules élevées. <ol><li> Trypsiniser cellules comme décrit dans 3.2. Ajouter 1 x 10 6 cellules à un tube de 15 ml et on centrifuge à 250 g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans un DMEM: F12 (3: 1) FCS milieu sans, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de l&#39;héparine et 1x B27. Incuber les cellules dans un puits 6 de faible plaques d&#39; ancrage de flacon de culture à 37 ° C et 5% de CO 2. Remarque: Utilisez DMEM: F12 (3: 1) contenant 5% de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de l&#39;héparine et 1x B27 si la cellule ne se développe pas sans FCS. </li><li> Observer la formation de la sphère de la tumeur à l&#39; aide d&#39; un microscope optique à partir de 4 à 10 jours après le semis (figure 3A). Remarque: le diamètre de la sphère de la tumeur doit être supérieure à 35 um. Cellules CD44 haute / ALDH élevées vont montrer une tumeur formation plus rapide et plus intense de la sphère en termes de nombre et de la taille par rapport à CD44 faible / ALDH faible. </li></ol></li><li> Évaluation de In Vivo tumorigénicité AprèsInjection sous - cutanée de CD44 élevé ALDH élevées cellules / NOD-SCID Souris. <ol><li> Après le tri, remettre en suspension les cellules dans du PBS à trois concentrations différentes (10 4 cellules / ml, 10 5 cellules / ml, et 10 6 cellules / ml). Injecter sous - cutanée de 100 ul de 10 4 cellules / ml (10 3 cellules) dans la région du flanc droit de 6 souris. Faites de même pour 10 5 cellules / ml (10 4 cellules), et 10 6 cellules / ml (10 5 cellules). Note: dilution inférieure à 10 3 cellules peuvent être testées. </li><li> Injecter la même concentration de cellules CD44 ALDH bas / bas dans la région du flanc gauche. Moniteur injecté des souris pour un maximum de 10 semaines pour voir la progression tumorale 19. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode fiable pour l&#39;isolement réussi de cellules souches cancéreuses à partir d&#39;une lignée cellulaire spécifique qui est applicable à d&#39;autres lignées de cellules HNSCC. Tête et du cou CSCs isolés sont ensuite appropriés pour une caractérisation moléculaire in vitro et la validation fonctionnelle par la transplantation chez des souris immunodéficientes 19. Cependant, certaines modifications peuvent être testés en fonction de la population de côté ou les CD44 <sup...

Tête et cou épidermoïde carcinome (CETC) est une tumeur maligne commune dans le monde entier et malgré les progrès réalisés dans les traitements actuels, les patients ayant une maladie avancée ont un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans globale du patient est d&#39;environ 30%, malgré la combinaison d&#39;approches thérapeutiques, y compris la chirurgie, chimio-radiothérapie et-thérapies ciblées. Des études récentes attribuent une récidive locale et de métastases à distance à la survie des cellules souches comme le cancer (CSC) suivant des thérapies anticancéreuses 1. Il y a accumulation de preuves étayant l&#39;existence de cellules présentant des cellules souches propriétés (capacités état ​​indifférencié, auto-renouvellement et de différenciation, et l&#39; activité de la télomérase) dans diverses tumeurs solides , y compris du sein, du cerveau, de la prostate, du poumon, du côlon, du pancréas, du foie et de la peau 2- 10. Cependant, l&#39;origine de CSCs reste incertaine 11,12. Ils peuvent résulter de la transformation maligne des cellules souches normales 3,13 ou dedifferenciation des cellules tumorales qui acquièrent des caractéristiques telles que CCM-14,15. Par conséquent, la compréhension des voies distinctes relatives à CSCs permettra de mieux comprendre le diagnostic et le traitement des CETC résistant tôt. Il a été proposé que les cellules souches cancéreuses possèdent également des phénotypes résistants qui soustraient chimiothérapie et la radiothérapie classique, ce qui entraîne une rechute de la tumeur par rapport à la masse des cellules tumorales et 16-19 sont localisées dans des niches 20 hypoxique. De nombreux facteurs ont été proposés pour expliquer ces résistances de CSCS, tels que la propension à quiescence, amélioré la réparation de l&#39; ADN, des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire régulés à la hausse, et de balayage des radicaux libres 21. En outre, plusieurs voies moléculaires oncogéniques peuvent être spécifiquement activées dans CSCs 17. Afin d&#39;améliorer la connaissance des CSC pour-thérapies ciblées en outre, nous avons besoin de méthodes fiables pour l&#39;identification et l&#39;isolement des CSCs, en raison de l&#39;hétérogénéité des marqueurs liés à des cellules souches dansdivers types de cancers 22. En CETC, cellules souches , initiatrices de tumeurs ont été isolées à partir de tumeurs de patients primaire par le tri des cellules exprimant différents biomarqueurs du SCC (tels que la drogue efflux transporteurs expression 23, CD44 élevé, CD24 faible CD133 élevé, c-Met + phénotype 10,24, 25, ou ALDH haute activité 26) ou la culture de la tumeur primaire du patient pour former squamospheres qui ont des propriétés du SCC. Néanmoins, le nombre de squamospheres diminue considérablement après deux passages, donnant ainsi une petite taille de l&#39; échantillon pour une caractérisation des études 27. Par conséquent, des essais in vitro à partir de lignées cellulaires bien établies est une solution plus facile à concevoir des expériences en vue d&#39;améliorer la connaissance des CSC. Le but de cet article est de proposer une méthode pour isoler CSCs de lignées de cellules HNSCC utilisant cytométrie de flux multiparamétrique analyse unnd tri cellulaire. L&#39;expression de CD44 en corrélation avec plusieurs propriétés CCM y compris l&#39;activité de ALDH, Side Population (SP) phénotype, la capacité de formation sphéroïde et tumorigénicité sont utilisés pour isoler et caractériser cette sous-population de CSCs. CD44 est une glycoprotéine de surface cellulaire, est impliquée dans l&#39;adhésion cellulaire et la migration. CD44 est fortement exprimé dans de nombreuses tumeurs solides CSCs 28, y compris dans la tête et le cancer du col modèles 29-31. De plus, les cellules CD44 élevées peuvent générer in vivo d&#39; une tumeur hétérogène alors que les cellules CD44 faibles ne peuvent pas 10. Le dosage de PS est basé sur le potentiel différentiel des cellules à efflux le colorant Hoechst 22 par l&#39; intermédiaire de la famille ATP-binding cassette (ABC) , des protéines de transport surexprimés dans la membrane du SCC. Ce dosage comprend l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de transporteurs ABC tels que le vérapamil dans les échantillons témoins. Aldéhyde déshydrogénase (ALDH) est une enzyme intracellulaire qui est impliqué dans la conversion du rétinol à retl&#39; acide inoic lors de la différenciation des cellules souches début 25,26. Les cellules qui présentent une forte activité ALDH montrent le comportement des cellules souches comme dans HNSCC 26 et un très petit nombre de cellules élevées ALDH sont capables de générer des tumeurs in vivo 26,32. La combinaison de ces marqueurs et des propriétés a été utilisé avec succès par Bertrand e t al. , Pour étudier la résistance in vitro et in vivo de ces cellules souches cancéreuses à un rayonnement de photons et 19 ions carbone. Leurs résultats ont clairement montré que la combinaison de différents marqueurs cellulaires et propriétés sont plus sélectifs pour les études utiles sur les populations HNSCC CCM que les approches mono-marqueurs.

<table><tbody><tr><td>Sérum de veau fœtal Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone soluble dans l’eau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Mélange de noix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>La solution doit être préparée juste avant l’utilisation car elle est très instable</td></tr><tr><td>Héparine</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément (50x), moins la vitamine A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosif, toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation) catégorie 4</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation) catégorie 3</td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation) catégorie 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, anticorps humain</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, anticorps humain</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Coulter particule</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Olympus&nbsp ;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B Lignée cellulaire</td><td>Don de John Little' s</td> <td>Laboratoire-Lignée</td><td></td></tr> <tr><td>cellulaire FaDu</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à faible ancrage</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux carcinome sous-population ayant les cellules souches caractéristiques

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Malgré les progrès dans la compréhension de la tête et du cou carcinomes épidermoïdes (CETC) progression, le taux de survie à cinq ans reste faible en raison de la récidive locale et des métastases à distance. Une hypothèse pour expliquer cette récurrence est la présence de cellules souches comme le cancer (CCM) qui présentent une chimio- inhérente et radio-résistance. Afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d&#39;avoir des modèles expérimentaux qui valident l&#39;efficacité des traitements ciblés et donc de disposer de méthodes fiables pour l&#39;identification et l&#39;isolement des CSC. A cette fin, nous présentons un protocole pour l&#39;isolement des cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires humaines HNSCC qui repose sur la combinaison de deux tries successives de cellules réalisées par cellules activées par fluorescence (FACS). La première est basée sur la propriété de CSCs à surexpriment ATP-Binding Cassette (ABC) protéines de transport et donc exclure, entre autres, des colorants d&#39;ADN vitaux tels que Hoechst 33342. Les cellules triées avec eest la méthode sont identifiés comme une «population de côté» (SP). Étant donné que les cellules SP représentent un pourcentage faible (&lt;5%) des cellules parentales, une phase de croissance est nécessaire afin d&#39;augmenter leur nombre avant le second tri cellulaire. L&#39;étape suivante permet la sélection des cellules qui possèdent deux autres caractéristiques de cellules souches de CETC -à- dire de haut niveau du marqueur de surface cellulaire CD44 (CD44 haute) et la surexpression de l&#39; aldéhyde déshydrogénase (ALDH haute) expression. Depuis l&#39;utilisation d&#39;un marqueur unique a de nombreuses limites et les pièges pour l&#39;isolement des cellules souches cancéreuses, la combinaison de SP, CD44 et des marqueurs de l&#39;ALDH fournira un outil utile pour isoler CSCs pour d&#39;autres essais analytiques et fonctionnelles nécessitant des cellules viables. Les caractéristiques de souches comme des cellules souches cancéreuses a finalement été validés in vitro par la formation de tumorispheres et l&#39;expression de β-caténine.

L&#39;isolement des CSCs de lignées de cellules HNSCC requis deux tris successifs en raison de la très faible pourcentage de CSCs dans la lignée cellulaire parentale. Le premier tri est basé sur la capacité des cellules souches cancéreuses à exclure le colorant Hoechst du fait de transporteurs à efflux. Cela a abouti à l&#39; acquisition de 1-5% de la population totale des cellules triées (figure 1). Au cours du colorant Hoechst cellulaire négative tri, vérifier la taill...

Comprendre le rôle des cellules souches cancéreuses dans la récidive tumorale et la résistance aux thérapies est devenu un sujet de grand intérêt au cours de la dernière décennie. Cet article décrit l’isolement et la caractérisation de la sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC).

Isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les cellules souches cancéreuses à partir de carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou, ou lignées cellulaires de CECCT. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du traitement du cancer, notamment sur la manière d'utiliser la chimiothérapie pour surmonter la radio-résistance tumorale. Le principal avantage de cette technique est qu'elle utilise une combinaison de marqueurs pour obtenir une grande spécificité dans l'isolement des cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de CECCT.La procédure sera démontrée par Prescillia Battiston-Montagne, notre technicienne, et Marion Gilormini, doctorante de mon laboratoire. Pour sélectionner une population latérale de cellules souches cancéreuses au moyen du test d'efflux du colorant Hoechst, étiquetez d'abord un tube conique « Hoechst » et un autre « Hoechst et Vérapamil ». Ensuite, lavez une culture cellulaire de CSHN avec du PBS stérile, puis ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA.Après trois minutes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec du milieu de culture cellulaire frais et compter les cellules. Diluer la culture à une concentration de dix puissance sept cellules par millilitre dans du milieu complet pour la lignée cellulaire parentale. Ensuite, ajouter 100 microlitres dans le tube contenant Hoechst et Verapamil, et quatre millilitres de cellules dans le tube contenant Hoechst.Ensuite, mélanger délicatement 10 microlitres de solution de chlorure de vérapamil à cinq millimolaire dans l'échantillon contenant Hoechst et le vérapamil, suivi de cinq microlitres de Hoechst par une fois 10 à la puissance 6 cellules dans les deux tubes. Puis couvrir les échantillons avec du papier d'aluminium et les placer à 37 degrés Celsius. Après 90 minutes, en mélangeant doucement toutes les 15 minutes, centrifuger les tubes et resuspendre les culots dans deux millilitres de PBS.Après une centrifugation centrée, resuspendez le culot de Hoechst et de Vérapamil dans 500 microlitres de propidium iodure dans du PBS et le culot de Hoechst dans quatre millilitres du même tampon. Filtrez ensuite les échantillons à travers des tamis cellulaires de 70 microns dans des tubes FACS afin d'éliminer les agrégats éventuels, puis placez les échantillons sur de la glace à l'abri de la lumière. Ensuite, chargez l'échantillon de Hoechst sur le cytomètre en flux et ouvrez la fenêtre de feuille de travail globale dans le logiciel du cytomètre en flux.Cliquez sur « Dot Plot » pour créer un graphique sur la feuille de travail globale, puis cliquez avec le bouton droit pour sélectionner les paramètres de diffusion avant et de diffusion latérale. Créez un graphique de type « dot plot » largeur de diffusion latérale par hauteur de diffusion latérale de la même manière, puis cliquez sur « polygon gate » pour créer une région P1 sur le deuxième graphique afin de sélectionner les cellules simples et de discriminer les doublets. Ensuite, créez un graphique de type « dot plot » aire du Hoechst rouge par aire du Hoechst bleu, puis cliquez avec le bouton droit sur les cellules pour mettre en surbrillance la population P1.Ensuite, créez une région P2 pour sélectionner la population latérale de cellules négatives au colorant Hoechst, qui apparaît sous forme d'un bras latéral à gauche de la population principale de cellules, et récupérez 10 000 événements de l'échantillon Hoechst. Pour confirmer que la fenêtre P2 représentant la population latérale est correctement positionnée, récupérez également 10 000 événements de l'échantillon Hoechst et Vérapamil. La population latérale devrait alors disparaître.Ensuite, trier la population latérale de cellules négatives au colorant Hoechst dans un tube conique de 15 millilitres contenant un millilitre de milieu complet pour cellules souches cancéreuses. À la fin du tri, centrifuger les cellules et resuspendre le culot de la population latérale dans un millilitre de milieu complet frais pour cellules souches cancéreuses. Puis compter les cellules et les semer en nombre approprié dans un nouveau flacon de culture cellulaire.Pour sélectionner le sous-ensemble CD44-haut/ALDH-haut parmi les cellules de la population latérale triées, étiquetez d'abord sept tubes coniques stériles de 15 millilitres comme indiqué. Ensuite, diluez les cellules triées à une concentration de un fois 10 puissance sept cellules par millilitre dans un milieu pour cellules souches, puis répartissez 100 microlitres de cellules dans les tubes non marqués CD44-APC et IGG1-APC, et quatre millilitres de cellules dans le tube ALDH et CD44-APC, le tout sur de la glace. Faites centrifuger les cellules puis remettez en suspension les culots des tubes non marqués CD44-APC et IGG1-APC dans 100 microlitres du tampon un du kit ALDEFLUOR.Ensuite, ajoutez cinq microlitres de l'inhibiteur de l'ALDH, le DEAB, aux tubes ALDH et DEAB, ALDH DEAB et CD44-APC. Resuspendez les cellules du tube ALDH et CD44-APC dans quatre millilitres du réactif C contenant quatre millilitres du tampon un et 20 microlitres du réactif du kit, puis transférez immédiatement 100 microlitres de ces cellules dans les tubes ALDH, ALDH et DEAB, ainsi que ALDH DEAB et CD44-APC. Placez ensuite tous les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes, à l'abri de la lumière, en mélangeant les échantillons après 15 minutes par vortexage doux.À la fin de l'incubation, centrifuger tous les échantillons et jeter les surnageants. Ensuite, placer tous les tubes sur de la glace et resuspendre le culot ALDH et CD44-APC dans quatre millilitres de tampon A, un culot CD44-APC et ALDH DEAB et les culots CD44-APC dans 100 microlitres du même tampon. Resuspendre le culot IGG1-APC dans 100 microlitres de tampon B et les tubes non colorés ALDH et ALDH et DEAB dans 100 microlitres de tampon un.Après 10 minutes, centrifuger à nouveau tous les échantillons, puis les laver avec 1 millilitre de tampon un pour tous les échantillons sauf l'échantillon ALDH et CD44-APC, qui est lavé avec 4 millilitres de tampon un. Après la deuxième centrifugation, resuspendre tous les culots dans 1 millilitre de tampon un frais, sauf l'échantillon ALDH et CD44-APC, qui est resuspendu dans 4 millilitres de tampon un. Charger maintenant le tube ALDH et CD44-APC dans le cytomètre en flux et créer un diagramme en points APC par fitsy pour visualiser la population doublement marquée.Ensuite, chargez le tube ALDH pour créer un seuil pour les cellules à forte expression d'ALDH. Les cellules positives doivent disparaître lorsque le tube ALDH et DEAB est chargé. Sur le même graphique, créez un second seuil à l’aide des tubes CD44-APC et IGG1-APC afin de sélectionner les cellules à forte expression de CD44.Les cellules positives disparaîtront lorsque le tube IGG1-APC sera chargé. Ensuite, chargez les tubes ALDH et CD44-APC ainsi que les tubes ALDH DEAB et CD44-APC pour créer une troisième fenêtre incluant les cellules CD44-hautes/ALDH-hautes. Utilisez le tube de double marquage ALDH-CD44 pour positionner la dernière fenêtre sur les cellules doublement positives.Ensuite, trier les cellules CD44-hautes/ALDH-hautes dans un tube conique de 15 millilitres contenant un millilitre de milieu complet pour cellules souches-like cancéreuses, en collectant les cellules CD44-basses/ALDH-basses dans un millilitre de milieu complet de culture cellulaire selon les besoins. Après le deuxième tri, ensemencer les cellules CD44-hautes/ALDH-hautes dans un flacon de culture cellulaire approprié avec du milieu complet pour cellules souches-like cancéreuses, puis placer le flacon dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 18 à 24 heures. Lorsque les cellules se seront fixées au fond du flacon, changer le milieu de culture et replacer le flacon dans l’incubateur.Pour confirmer le potentiel tumoral des cellules CD44-hautes/ALDH-hautes, réalisez une trypsination de la monocouche de cellules souches cancéreuses comme indiqué afin d'obtenir une suspension monocellulaire, puis transférez un fois dix puissance six cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Après centrifugation des cellules, resuspendez le culot dans un milieu pauvre en sérum supplémenté avec du facteur de croissance épidermique humain recombinant, de l'héparine et du B27, puis incubez les cellules dans une boîte de Pétri à faible adhérence dans l'incubateur de culture cellulaire jusqu'à l'observation de sphéroïdes tumoraux par microscopie optique. Lorsque le tri est effectué pour la première fois sur une nouvelle lignée cellulaire, il est nécessaire de confirmer le potentiel tumoral de cette lignée, attesté par sa capacité à former des sphéroïdes tumoraux en milieu sans sérum in vitro.En outre, la PCR quantitative devrait démontrer une forte expression de la bêta-caténine et d'autres marqueurs propres aux cellules souches par les cellules CD44-haut/ALDH-haut. Les cellules CD44-haut/ALDH-haut devraient également être capables de former des tumeurs in situ lorsqu'elles sont injectées en faibles quantités, comparées aux cellules CD44-bas/ALDH-bas. Une fois maîtrisée, chaque tri cellulaire devrait pouvoir être réalisé en cinq heures s'il est effectué correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de protéger les échantillons marqués avec un fluorochrome de l'exposition directe à la lumière. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que les tests d'invasion et de migration, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'implication des cellules souches cancéreuses dans le processus métastatique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer pour explorer les mécanismes d'échappement tumoral dans le cancer du SCCN.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de CSHN à l'aide d'une analyse cytométrique en flux multiparamétrique et d'un tri cellulaire. N'oubliez pas que le travail avec des cellules tumorales et des agents intercalants de l'ADN peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'une blouse de laboratoire et de gants doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Un dispositif de cloisonnement microfluidique pour étudier la migration des cellules souches du cancer est décrit. Cette nouvelle plate-forme crée un microenvironnement cellulaire viable et permet la visualisation microscopique de locomotion de cellules vivantes. Très mobiles cellules cancéreuses sont isolées pour étudier les mécanismes moléculaires de l'infiltration agressive, pouvant conduire à des thérapies plus efficaces futures.

Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

Dans cette vidéo, nous décrivons l’isolement d’une sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou à l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence ou FACS. La population latérale isolée de cellules peut être utilisée pour une analyse plus poussée en aval.

Essai de discrimination de la population du côté cancéreux : une méthode pour isoler des cellules souches cancéreuses à l’aide d’un test d’efflux de colorant de Hoechst

Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment...

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

L'isolement des cellules souches cancéreuses (CCM) directement à partir de tissus humains est nécessaire pour leur caractérisation biologique. Ce manuscrit décrit une méthodologie pour l'isolement des CSC de la prostate à partir de tissus humains, tout en offrant des conseils sur le dépannage des mesures difficiles.

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

Les dosages de sphères in vitro sont couramment utilisés pour identifier les cellules souches cancéreuses. Ici, nous comparons les dosages à sphère unique et à plusieurs cellules. Les tests basés sur des cellules uniques plus laborieux ou la supplémentation en méthylcellulose donnent des résultats plus précis, tandis que les tests multicellulaires effectués en milieu liquide peuvent être fortement influencés par la densité cellulaire.

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Les cellules souches du cancer du pancréas (CSC) peuvent être développées in vitro à l’aide de la technique de culture de sphère indépendante de l’ancrage, qui représente un outil puissant pour étudier la biologie des CSC et peut servir de première étape pour développer de nouvelles thérapies ciblant les CSC. La méthodologie d’expansion, d’analyse et de ciblage des CSC pancréatiques est présentée ici.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

La présence de cellules souches cancéreuses (CCF) dans sarcomes osseux a récemment été liée à leur pathogénie. Dans cet article, nous présentons l'isolement des cellules souches cancéreuses à partir de cultures de cellules primaires obtenues à partir de biopsies humaines d'ostéosarcome classique (OS) en utilisant la capacité de CSCs à croître dans des conditions non adhérentes.

Création de souches du cancer de cultures de cellules de Human ostéosarcome conventionnel

Nous décrivons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules tumeur-initiatrices des xénogreffes patient-dérivées humaines par le tri de cellules fluorescence-activé, utilisant l'antigène humain de leucocyte-1 (HLA-1) comme marqueur négatif, et pour la validation plus loin et caractérisation de ces cellules HLA-1-négatives de tumeur-initiateur.

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

Nous présentons ici une méthode reproductible pour le développement d’un modèle murin d’orthotopique du carcinome épidermoïde tête et du cou. Les tumeurs démontrent cliniquement pertinentes caractéristiques histopathologiques de la maladie, y compris nécrose, une différenciation pauvre, métastases nodales et infiltration immunitaire. Souris de tumeur-roulement développent des symptômes cliniquement pertinentes y compris la dysphagie, déplacement de la mâchoire et la perte de poids.

Inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez les souris pour tumeur immunitaire profilage et évaluation de réponse traitement suffit

Utilisant les cellules épithéliales primaires humaines de prostate, nous rapportons une nouvelle méthode biomarqueur-libre de caractérisation fonctionnelle des cellules de tige-comme par un test sphéroïde-basé d'étiquette-rétention. Un protocole étape par étape est décrit pour l'étiquetage des cellules BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formation sphénoïde tridimensionnelle; identification des cellules souches de conservation de l'étiquette par immunocytochimie; et l'isolement par FACS.

Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles

Ce protocole expérimental décrit l’isolement des CSCA à partir d’échantillons de cellules et de tissus cancéreux du sein ainsi que les tests in vitro et in vivo qui peuvent être utilisés pour évaluer le phénotype et la fonction des CSBC.

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Découvrez l'isolement de cellules souches cancéreuses du carcinome épidermoïde de la tête et du cou par cytométrie en flux multiparamétrique. Cette méthode permet d'étudier la résistance aux traitements et la récidive tumorale.

Isolement et caractérisation d'une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

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