Isolement et caractérisation d'une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules souches cancéreuses des lignées cellulaires du carcinome épidermoïde de la tête et du cou ou HNSCC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du traitement du cancer sur la façon d’utiliser la chimiothérapie pour surmonter la radiorésistance tumorale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise une combinaison de marqueurs pour obtenir une spécificité élevée dans les cellules souches cancéreuses des lignées cellulaires HNSCC.

La démonstration de la procédure sera faite par Prescillia Battiston-Montagne, notre technicienne, et Marion Gilormini, une docteure de mon laboratoire. Pour sélectionner une population latérale de cellules souches cancéreuses par test d’efflux de colorant Hoechst, étiquetez d’abord un tube conique Hoechst et un tube Hoechst et Verapamil. Ensuite, laver une culture cellulaire HNSCC avec du PBS stérile suivie de l’ajout d’un millilitre de Tripsyn EDTA.

Après trois minutes à 37 degrés Celsius, arrêtez la réaction avec un milieu de culture cellulaire frais et comptez les cellules. Diluez la culture à une fois 10 à 10 à sept cellules par millilitre et complétez le milieu de la lignée cellulaire parentale. Ajoutez ensuite 100 microlitres dans le tube Hoechst et Verapamil et quatre millilitres de cellules dans le tube Hoechst.

Ensuite, mélangez doucement 10 microlitres de cinq millimolaires de solution de chlorhydrate de Verapamil dans l’échantillon de Hoechst et de Verapamil, suivis de cinq microlitres de Hoechst par un fois 10 dans les sixièmes cellules des deux tubes. Couvrez ensuite les échantillons d’une feuille d’aluminium et placez-les à 37 degrés Celsius. Après 90 minutes avec un mélange doux toutes les 15 minutes, centrifugez les tubes et remettez les granulés en suspension dans deux millilitres de PBS.

Après une centrifugation centrale, remettre en suspension les pastilles Hoechst et Verapamil dans 500 microlitres d’iodure de propidium dans PBS et la pastille Hoechst dans quatre millilitres de même. Filtrez maintenant les échantillons à travers des crépines de cellules de 70 microns dans des tubes FACS pour éliminer tous les agrégats et placez les échantillons sur de la glace à l’abri de la lumière. Ensuite, chargez l’échantillon Hoechst sur le cytomètre en flux et ouvrez la fenêtre Feuille de travail globale dans le logiciel du cytomètre en flux.

Cliquez sur Dot Plot pour créer un graphique sur la feuille de calcul globale et cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner les paramètres de diffusion vers l’avant et sur les côtés. Créez un pointage de la même manière avec une dispersion latérale large par une hauteur de diffusion latérale, puis cliquez sur la porte polygonale pour créer une région P1 dans le deuxième graphique, pour sélectionner les cellules simples et discriminer les doublets. Ensuite, créez une zone de Hoechst rouge à côté d’un graphique à points bleu de la zone de Hoechst et faites un clic droit sur les cellules pour mettre en évidence la population P1.

Créez ensuite une région P2 pour sélectionner la population de cellules du côté du colorant Hoechst négatif qui apparaît comme un bras latéral à gauche de la population principale de cellules et collectez 10 000 événements de l’échantillon Hoechst. Pour confirmer que la porte P2 représentant la population latérale est correctement positionnée, collectez également 10 000 événements d’échantillonnage Hoechst et Verapamil. La population latérale devrait disparaître.

Ensuite, triez la population latérale de cellules négatives au colorant Hoechst dans un tube conique de 15 millilitres contenant un millilitre de milieu cellulaire complet semblable à une tige cancéreuse. À la fin du tri, faites tourner les cellules et remettez en suspension la pastille de population latérale dans un millilitre de milieu cellulaire complet frais de type tige cancéreuse. Comptez ensuite les cellules et ensemencez-les au nombre approprié dans un nouveau flacon de culture cellulaire.

Pour sélectionner le sous-ensemble CD44-high/ALDH-high dans les cellules de population latérales triées, étiquetez d’abord sept tubes coniques stériles de 15 millilitres comme indiqué. Ensuite, diluez les cellules triées à une fois 10 à sept cellules par millilitre dans un milieu de cellules souches et aliquotez 100 microlitres de cellules dans les tubes CD44-APC et IGG1-APC non colorés et quatre millilitres de cellules dans les tubes ALDH et CD44-APC, le tout sur de la glace. Faites tourner les cellules et remettez en suspension les pastilles CD44-APC et IGG1-APC non colorées dans 100 microlitres de tampon dont un du kit ALDEFLUOR.

Ajoutez ensuite cinq microlitres de l’inhibiteur de l’ALDH DEAB dans les tubes ALDH et DEAB et ALDH DEAB et CD44-APC. Remettez en suspension les cellules dans le tube ALDH et CD44-APC dans quatre millilitres de réactif C contenant quatre millilitres de tampon un et 20 microlitres du réactif du kit et transférez immédiatement 100 microlitres de ces cellules dans les tubes ALDH, ALDH et DEAB, et ALDH DEAB et CD44-APC. Ensuite, placez tous les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière, en mélangeant les échantillons après 15 minutes par un léger vortex.

À la fin de l’incubation, centrifugez tous les échantillons et jetez les surnageants. Ensuite, placez tous les tubes sur de la glace et remettez en suspension les pastilles ALDH et CD44-APC dans quatre millilitres de tampon A, un CD44-APC et des pastilles ALDH DEAB et CD44-APC dans 100 microlitres de la même chose. Remettez en suspension la pastille IGG1-APC dans 100 microlitres de tampon B et les tubes ALDH et ALDH et DEAB non colorés dans 100 microlitres de tampon un.

Après 10 minutes, essorez à nouveau tous les échantillons, puis rincez-les dans 1 millilitre de tampon un pour tous les échantillons, à l’exception de l’échantillon ALDH et CD44-APC, qui est lavé dans quatre millilitres de tampon un. Après la deuxième centrifugation, remettre en suspension tous les granulés dans un millilitre de tampon frais un, à l’exception de l’échantillon ALDH et CD44-APC, qui est remis en suspension dans quatre millilitres de tampon un. Chargez maintenant le tube ALDH et CD44-APC sur le cytomètre en flux et créez un diagramme APC par points ajustés pour visualiser la population doublement colorée.

Ensuite, chargez le tube ALDH pour créer une porte pour les cellules à haute ALDH. Les cellules positives devraient disparaître lorsque le tube ALDH et DEAB est chargé. Dans le même graphique, créez une deuxième porte à l’aide des tubes CD44-APC et IGG1-APC pour sélectionner les cellules CD44-high.

Les cellules positives disparaissent lorsque le tube IGG1-APC est chargé. Chargez ensuite les tubes ALDH et CD44-APC et ALDH DEAB et CD44-APC pour créer une troisième porte qui inclut les cellules CD44-high/ALDH-high. Utilisez le tube ALDH-CD44 à double coloration pour positionner la dernière porte sur les cellules doublement positives.

Ensuite, triez les cellules CD44-high/ALDH-high dans un tube conique de 15 millilitres contenant un millilitre de milieu complet de cellules souches cancéreuses collectant les cellules CD44-low/ALDH-low dans un millilitre de milieu de culture cellulaire complet comme vous le souhaitez. Après le deuxième tri, placez les cellules CD44-high/ALDH-high dans un flacon de culture cellulaire approprié avec un milieu complet de cellules souches cancéreuses dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 18 à 24 heures. Lorsque les cellules se sont fixées au fond du ballon, changez de milieu de culture et remettez le ballon dans l’incubateur.

Pour confirmer le potentiel tumoral des cellules CD44-high/ALDH-high, trypsiniser la monocouche cancéreuse de type tige comme démontré pour obtenir une suspension unicellulaire et transférer une fois 10 aux six cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir fait tourner les cellules, remettez en suspension la pastille dans un milieu sérique faible complété par l’héparine et la B27, un facteur de croissance épidermique humain recombinant, et incubez les cellules dans une boîte de Pétri à faible ancrage dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les sphères tumorales soient observées par microscopie optique. Lorsque le tri est effectué pour la première fois sur une nouvelle lignée cellulaire, il est nécessaire de confirmer le potentiel tumoral de la lignée cellulaire comme en témoigne sa capacité à former des sphères tumorales en milieu exempt de sérum in vitro.

De plus, la QPCR devrait démontrer une expression élevée de la bêta-caténine et d’autres marqueurs de cellules souches par les cellules CD44-high/ALDH-high. Les cellules CD44-high/ALDH-high devraient également être capables de former des tumeurs in situ lorsqu’elles sont injectées en faibles quantités par rapport aux cellules CD44-low/ALDH-low. Une fois maîtrisé, chaque tri cellulaire devrait pouvoir être effectué en cinq heures s’il est effectué correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de protéger les échantillons marqués au fluorochrome de l’exposition directe à la lumière. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests de migration d’invasion peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’implication des cellules souches cancéreuses dans le processus métastatique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer pour explorer les mécanismes d’échappement tumoral dans le cancer HNSCC.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules souches cancéreuses des lignées cellulaires HNSCC à l’aide de l’analyse multiparamétrique, de l’analyse cytométrique en flux et du tri cellulaire. N’oubliez pas que travailler avec des cellules tumorales et intercaler des agents d’ADN peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire et de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.