Name: Glycan Analyse Node: une approche bottom-up à Glycomics (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Découvrez une technique de glycomique bottom-up pour analyser les glycanes dans les biofluides par GC-MS. Cette méthode distille les caractéristiques glycaniques en signaux analytiques uniques pour faciliter la détection précoce du cancer.

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Ce travail a été soutenu par le College of Liberal Arts and Sciences de l’Université d’État de l’Arizona sous la forme de fonds de démarrage de laboratoire pour CRB. Il a également été soutenu par une subvention de la Fondation Flinn (subvention n° 1977) et par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous le numéro de bourse R33CA191110. JA a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) dans le cadre du numéro de bourse R25GM071798. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

<ol><li>Li, M., Song, L., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+changes%3A+cancer+metastasis+and+anti-cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines.</a> J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).</li>
<li>Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanley%2C+P+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).</li>
<li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockhausen%2C+I+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).</li>
<li>Rini, J., Esko, J., Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRini%2C+J+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).</li>
<li>Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+aberrant+tumor-reactive+immunoglobulins+in+the+circulation+of+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>An, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+glycans+in+serum+for+the+discovery+of+potential+biomarkers+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer.</a> J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+IgG+oligosaccharide+chains+with+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression.</a> Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+serum+glycome+due+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).</li>
<li>Okuyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+marker+for+pancreatic+cancer%3A+a+detailed+analysis+of+the+oligosaccharide+structure+and+a+possible+mechanism+for+fucosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation.</a> Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+microarrays+with+multi-lectin+detection%3A+unique+lectin+binding+patterns+as+a+tool+for+classifying+normal%2C+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+sera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).</li>
<li>Comunale, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+serum+associated+fucosylated+glycoproteins+in+the+development+of+primary+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma.</a> J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).</li>
<li>Goldman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Hepatocellular+Carcinoma+Using+Glycomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis.</a> Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).</li>
<li>Aurer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+of+Igg+heavy+chain+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma.</a> Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).</li>
<li>Abd Hamid, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+to+reveal+potential+glycan+markers+from+serum+glycoproteins+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression.</a> Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+diagnosis+and+prognosis+through+quantitative+measurements+of+serum+glycan+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles.</a> Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Hongsachart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+WGA-bound+glycoprotein+biomarkers+in+sera+from+patients+with+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma.</a> Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).</li>
<li>Arnold, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+glycan+biomarkers+for+the+detection+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).</li>
<li>Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+Fc+N-glycan+profiling+in+patients+with+gastric+cancer+by+LC-ESI-MS%3A+relation+to+tumor+progression+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival.</a> Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc-glycosylation+profiling+reveals+associations+with+age%2C+sex%2C+female+sex+hormones+and+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer.</a> J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).</li>
<li>Takeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+type+of+cancer+biomarker+linked+to+the+prognosis+after+an+operation+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer.</a> Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).</li>
<li>Parekh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+rheumatoid+arthritis+and+primary+osteoarthritis+with+changes+in+the+glycosylation+pattern+of+total+serum+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.</a> Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).</li>
<li>Mehta, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+galactose-deficient+anti-Gal+immunoglobulin+G+in+the+sera+of+hepatitis+C+virus-infected+individuals+with+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis.</a> J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).</li>
<li>Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutional+and+clinical+implications+of+the+epigenetic+regulation+of+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation.</a> Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).</li>
<li>Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenomics+of+the+human+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenomics of the human glycome.</a> Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Tuccillo, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Glycosylation+as+Biomarker+for+Cancer%3A+Focus+on+CD43%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43.</a> Biomed Res Int. , (2014).</li>
<li>Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).</li>
<li>Brockhausen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+in+human+colon+and+breast+cancer%3A+glycodynamics+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions.</a> EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzi%2C+CR+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).</li>
<li>Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+surrogate+analysis+of+glycotransferase+activity+in+whole+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens.</a> Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).</li>
<li>Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Carbohydrate+Derivatives+by+Gas-Liquid+Partition+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography.</a> J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).</li>
<li>Ciucanu, I., Caprita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Per-O-methylation+of+neutral+carbohydrates+directly+from+aqueous+samples+for+gas+chromatography+and+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis.</a> Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+permethylation+of+glycans+for+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis.</a> Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+solid-phase+permethylation+of+glycans+prior+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).</li>
<li>Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+invasive+and+non-invasive+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells.</a> Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).</li>
<li>Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic%2Fchemical+release+of+O-glycans+allowing+MS+analysis+at+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity.</a> Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silanizing+glassware%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Silanizing glassware.</a> Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).</li>
<li>Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aminosugar+linkages+in+glycolipids+by+methylation.+Aminosugar+linkages+of+ceramide+pentasaccharides+of+rabbit+erythrocytes+and+of+Forssman+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen.</a> Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En général, la production réussie d&#39;acétates d&#39; alditol partiellement méthylés de (PMAAs) à partir des hexoses se heurte à moins de difficultés et est plus robuste que la production réussie de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Le mécanisme exact de ce phénomène car il joue dans toutes les étapes de cette procédure est inconnue, mais doit se rapporter à la chimie unique du groupe acétyl N (plutôt que le groupe hydroxyle) qui est unique à HexNAcs par rapport à hexoses. Le mécanisme de ce phénom...

Glycolipides, des glycoprotéines, des protéoglycanes et glycosaminoglycanes constituent les quatre principales classes d&#39;hydrates de carbone, hétérogènes complexes collectivement appelés glycanes. En tant que composants omniprésents et intégrales de la membrane plasmique, glycocalyx, et de la matrice et des fluides extracellulaires, les glycanes participent à de tels procédés biochimiques divers que l&#39;endocytose, le trafic intracellulaire, la motilité cellulaire, la transduction du signal, la reconnaissance moléculaire, l&#39;activation du récepteur, l&#39;adhésion cellulaire, l&#39;interaction hôte-pathogène , la communication intercellulaire, immunosurveillance et immunitaire initiation de réponse. 1 Présent dans presque tous les domaines de la vie, enzymes appelées glycosyltransférases qui construisent des polymères glycanes agissent en tandem avec glycoside hydrolases (également connu sous le nom glycosidases, qui décomposent les glycanes) pour construire, rénover, et , finalement , produire finalisé polymères glycanes 2. Bien que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur différents glycoconjugués, une glycosyltransféraseforges généralement une liaison glycosidique linkage- et anomère spécifique en transférant le fragment monosaccharide d&#39;un nucléotide activé donneur de sucre particulier (par exemple, GDP-fucose) à une certaine catégorie d&#39;accepteurs nucléophiles (par exemple, un lipide, un polypeptide, un acide nucléique, ou de plus en plus oligosaccharide). Il a été estimé que plus de 50% de protéines ( en particulier membranaires et des protéines sécrétoires) sont post-traductionnelle modifié par glycosylation 3 calculs combinatoires rudimentaires fournissent une appréciation de la variabilité considérable, la polyvalence et la spécificité accordée aux glycoprotéines par glycosylation. Par exemple, si un substrat de polypeptide ne possède que 10 sites de glycosylation et chaque site peut former une liaison glycosidique avec une des extrémités réductrices seulement trois monosaccharides différents, alors, en principe, la glycoprotéine finale peut prendre 10 = 3 59049 identités distinctes. Dans les glycoprotéines, les liaisons glycosidiques forment communément avec la chaîne latérale d&#39;azote of résidus d&#39;asparagine dans la séquence Asn-X-Ser / Thr (X peut être un acide aminé quelconque excepté la proline) pour obtenir le N -glycans 2 et des chaînes latérales hydroxyles des résidus de serine et de threonine pour donner -glycans O 4. La composition du glycome d&#39;une cellule ( par exemple, son complément de produits de glycosylation) est unique et limitée parce que, à quelques exceptions près, les glycosyltransférases présentent des donateurs stricte, accepteur, et la spécificité de liaison. 5 glycoprotéines de plasma sanguin importants et abondants souffrent glycosylation aberrante comme conséquence aval de l&#39; expression de la glycosyltransférase et l&#39; activité anormale due à de nombreux états pathologiques, en particulier le cancer et les maladies inflammatoires. 6-24 Principalement en raison de facteurs épigénétiques, l&#39;glycome est nettement plus diversifiée, dynamique et complexe que le protéome et du transcriptome. 25,26 Alors qu&#39;environ 1% du génome de mammifère code pour la formation, la modification, etEnsemble de glycanes, 27 glycosylation se déroule de manière-un contraste marqué non orientés modèles de polypeptide et de la biosynthèse des acides nucléiques. L&#39;interaction entre la quantité relative et l&#39; activité des enzymes de glycosylation et des facteurs environnementaux tels que la disponibilité des nutriments et d&#39;un précurseur détermine finalement la nature, le taux et l&#39; étendue de la glycosylation. 5,28 embryogenèse (par exemple, la détermination et de la différenciation), l&#39; activation cellulaire et la progression à travers l&#39;expression de l&#39; influence du gène de cycle cellulaire ( par exemple, la transcription et la traduction) et modifier l&#39;identité et la quantité des glycosyltransférases disponibles, dont l&#39; activité est le facteur déterminant en amont immédiat du profil glycane de la cellule. Parce que (certains) le proliférative, adhésif, et les propriétés invasives des cellules cancéreuses ressemblent à celles des cellules embryogènes ordinaires, des changements spécifiques dans les voies de biosynthèse glycane (par exemple, l&#39; accumulation de précurseur, l&#39; expression dérégulée, aberrant modification, troncature structurelle ou formation roman) servent de biomarqueurs du cancer comme universels qui indiquent différentes étapes de la formation de tumeurs, la progression, la migration et l&#39; invasion 29 Bien que la glycosylation est très complexe, évidemment que quelques modifications de glycosylation peuvent permettre à la carcinogenèse et les métastases. apparemment, certains produits de glycosylation &quot;aberrantes&quot; en effet bénéficier des cellules cancéreuses en leur permettant de se soustraire à la reconnaissance immunitaire et de survivre aux exigences de la migration dans des environnements intravasculaires et métastatiques inhospitalières. 28,30,31 Sans surprise, les expériences ont montré que la perturbation ou la prévention des motifs de changé l&#39; expression génique et la formation glycane aberrante peuvent stopper la tumorigenèse. 29 Néanmoins, les glycanes aberrantes détectées dans un échantillon de fluide biologique (par exemple, l&#39; urine, la salive et le plasma ou le sérum sanguin) peuvent ne pas être des indicateurs directs de cancer (ou une autre maladie), mais plutôt en aval résultats de subtile mais significativedes changements dans le système immunitaire ou des ramifications quantifiables d&#39;une condition pernicieuse dans un organe imprévisible. 32 Bien qu&#39;ils fournissent des informations universelles sur le glycome, de nombreux glycomique à base d&#39;interaction-techniques moléculaires (par exemple, lectine / matrices d&#39; anticorps et métabolique / marquage covalent) dépend de la détection de structures glycanniques entières et ne fournissent pas des informations structurelles détaillées sur glycanes individuelles. En contraste marqué, la spectrométrie de masse (MS) peut aider à identifier et quantifier les structures glycanniques individuelles et révéler de telles informations structurelles que les sites de fixation à noyaux polypeptidiques. l&#39;expression ou l&#39;activité d&#39;une seule glycosyltransférase dérégulée peut initier une cascade d&#39;événements moléculaires nuisibles dans de multiples voies de glycosylation. Parce que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur plus d&#39;un substrat de glycoconjugué et à travers différents polymères glycanes croissance, cascades biosynthétiques déréglementés donnent dispropornellement des quantités accrues d&#39;un seul produit glycane mais plusieurs classes hétérogènes de glycanes aberrantes dans les fluides intra- ou extracellulaires. 33 Cependant, ces glycanes aberrants uniques sont parfois considérés comme peu pratique en tant que biomarqueurs pour le cancer ou d&#39; autres pathologies glycanes-affectif parce que, par rapport à la grande piscine des glycanes bien réglementé, ces glycanes aberrantes représentent une très petite fraction qui peut souvent rester indétectable même par des techniques très sensibles comme la spectrométrie de masse. Par exemple, dans des fluides corporels intra- et extracellulaire, le large spectre de protéines de concentration (qui couvre huit ordres de grandeur) peut empêcher la détection de glycoprotéines rares qui sont masquées par les espèces les plus abondantes. 32 En outre, la détermination de l&#39; activité de glycosyltransférase reste un important pratique et défi théorique parce que beaucoup de glycosyltransférases sont absents dans biofluides cliniques ou devenir inactif ex vivo. Malgré la difficulté de consistendétecter tly et la quantification des quantités ultra-minute de glycanes entiers uniques, les praticiens de la spectrométrie de masse ont fait d&#39;énormes progrès vers l&#39;emploi glycanes intactes comme marqueurs cliniques. Nous avons récemment développé une approche complémentaire à l&#39;analyse des glycanes intactes, utilisant GC-MS, facilite la détection de toutes les branches point constituant et monosaccharides spécifiques liaison ( &quot;noeuds glycanes&quot;) qui confèrent ainsi un caractère unique à chaque glycane et dans de nombreux cas servent directement substituts moléculaires qui permettent de quantifier l&#39;activité relative de la glycosyltransférase (s) coupable. Depuis sa première rapporté application directe à l&#39; analyse glycanes en 1958, chromatographie en phase gazeuse (GC) a prouvé une technique puissante pour analyser les mono- et disaccharides per-méthylé, 34 déterminer leur anomericity et la configuration absolue, et de les séparer pour analyse ultérieure par spectrométrie de masse. 35 Entre 1984 et 2007, Ciucanu et ses collèguesintroduit et affiné une technique de perméthylation glycane phase solide qui employait l&#39; hydroxyde de sodium et de l&#39; iodométhane, suivie d&#39; une extraction liquide / liquide de glycanes perméthylés utilisant de l&#39; eau et le chloroforme. 35,36 Entre 2005 et 2008, Kang et ses collègues ont intégré une rotation de gain de temps approche -column dans l&#39;étape de perméthylation. 37,38 En 2008, le groupe de recherche Goetz a conçu une phase solide quantitative perméthylation méthode glycane-profilage par laser désorption-ionisation assistée par matrice (MALDI) spectrométrie de masse pour comparer et potentiellement distinguer invasive et non les cellules cancéreuses du sein -invasive; 39 puis, en 2009, l&#39;équipe Goetz combinée enzymatique et les techniques de libération chimiques clivent O -glycans de glycoprotéines intactes dans un schéma de perméthylation en phase solide fortement alcalin 40 Bien que la procédure Goetz facilitée perméthylation simultanée et la libération de produits chimiques. de -glycans O, il a été appliqué uniquement aux pré-isolé glycoles protéines. Nous avons modifié cette technique en 2013 et adapté pour biofluides non fractionnées entiers et des échantillons de tissus homogénéisés en incorporant l&#39; acide trifluoroacétique (TFA) hydrolyse, réduction et acétylation étapes. 33 Ces étapes supplémentaires libérer également les glycanes de glycolipides et N lié en glycanes de glycoprotéines et convertir les en acétates partiellement méthylés d&#39;alditols (PMAAs, figure 1), dont les modèles de méthylation et acétylation distinctive de faciliter l&#39; analyse par GC-MS et uniquement caractériser les nœuds glycanes constitutifs dans l&#39;original intact polymère glycane 41 (Figure 2). 33 en fin de compte, ce procédure produit un portrait composite de tous les glycanes dans un fluide biologique complexe basé sur la quantification par rapport direct des caractéristiques uniques, telles que des glycanes &quot;fucosylation du noyau&quot;, &quot;6-sialylation&quot;, &quot;GlcNAc bissecteur&quot;, et &quot;bêta 1-6 ramification» - chaque dérivé d&#39;un seul chromatograp GC-MSpic HIC. Cet article présente l&#39;optimisation du perméthylation, acétylation, l&#39;isolement et les étapes de nettoyage ainsi que des améliorations dans le mode de quantification relative.

<table><tbody><tr><td>Perles d’hydroxyde de sodium&nbsp ;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>20-40 mesh, qualité réactif 97 %</td></tr><tr><td>0,9 ml Colonne de centrifugation</td><td>69705</td><td>Division Pierce de ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Comprend des prises et des frittes de polyéthylène</td></tr><tr><td>Flacon d’échantillonneur automatique GC-MS (silanisé)*</td><td>C4000-9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Target DP Flacon à haute récupération, 1,5 ml, 12&nbsp ; mm x 32&nbsp ; mm, comprend des capuchons perçables doublés de téflon</td></tr><tr><td>Tubes à essai en polypropylène de 1,5 ml</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Couvercle à pression</td></tr><tr><td>Tubes à essai en polypropylène de 2 ml</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Couvercle à pression</td></tr><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>BioRéactif pour la biologie moléculaire, qualité réactif >99,0 %</td></tr><tr><td>Iodomethane&nbsp ;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>Contient du cuivre comme stabilisant, ReagentPlus 99 %</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>75002436 : Centrifugeuse Sorvall Legend Micro 17</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>24 rotors 1,5/2,0 avec couvercle de bioconfinement ClickSeal. Numéro de catalogue du rotor : 75003424</td></tr><tr><td>tube à essai en verre 13 x 100 (silanisé)*</td><td>53283-800</td><td>Tubes à essai en</td><td>verre borosilicate VWR 13 mm x 100 mm avec finition à bouchon à vis</td></tr><tr><td>Capuchons pour tubes à essai en verre</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Kimble&trade ; Bouchons à vis phénoliques noirs ; 13&nbsp ; mm-415 filetage GPI ; Revêtement en caoutchouc PTFE.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>>99,5 % pur</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>4440-08</td><td>Macron Fine Chemicals&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique&nbsp ;</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>99 % purifié par redistillation pour le séquençage des protéines&nbsp ;</td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium</td><td>71321</td><td>Fluka Analytical&nbsp ;</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde d’ammonium&nbsp ;</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>Teneur en NH3 : 28,0-30,0 %</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick & </td> Acide acétique <td>de qualité HPLC</td></tr> Jackson<tr><td>&nbsp ;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>99,70 %</td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide en plastique&nbsp ;</td><td>Tout modèle de taille adéquate</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride acétique&nbsp ;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>99,50 %</td></tr><tr><td>Dichlorométhane&nbsp ;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Grade HPLC stabilisé</td></tr><tr><td>Acétone&nbsp ;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker analysé&nbsp ;</td></tr><tr><td>Collecteur d’évaporation chauffé (unité principale)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific* Module de chauffage et d’agitation Reacti-Therm* ; Modèle à trois blocs avec fonction de chauffage et</td></tr><tr><td>d’agitation Collecteur d’évaporation chauffé (évaporateur aérien)</td><td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>ThermoScientific* Évaporateur Reacti-Vap, 27 ports ; À utiliser avec le module de chauffage à trois blocs Reacti-Therm</td></tr><tr><td>Blocs porte-échantillons en aluminium pour collecteur d’évaporation</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>Bloc, aluminium, Reacti-Block S-1, peut contenir 13 mm diamètre, tubes à essai, 13 trous (14&nbsp ; mm dia. x 45&nbsp ; mm de profondeur)</td></tr><tr><td>Chromatographe en phase gazeuse</td><td>Modèle A7890</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td>Équipé d’un passeur d’échantillons CTC PAL</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse&nbsp ;</td><td>GCT Premier (Temps de Vol)</td><td>Eaux&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Doublure en mode split (désactivé / silanisé)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>Contenant un petit bouchon de laine de verre silanisée</td></tr><tr><td>DB-5ms Colonne GC</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 m x 0,25 mm ID x 0,25 micron épaisseur</td></tr><tr><td>du film Chlorotriméthylsilane</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide en verre (pour la silanisation de la verrerie)</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>12 » de large ; 230 mm taille</td></tr><tr> de la plaque<td colspan="4">*La silanisation de la verrerie est effectuée en interne, pendant la nuit, à l’aide de vapeur de chlorotriméthylsilane dans un grand dessiccateur sous vide en verre.</td></tr></tbody></table>

glycan analyse node: une approche bottom-up à glycomics

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Synthétisés dans un processus non piloté par des enzymes appelées glycosyltransférases, les glycanes jouent un rôle clé dans divers événements intra- et extracellulaires significatifs. De nombreuses conditions pathologiques, notamment le cancer, affectent l’expression des gènes, ce qui peut à son tour déréguler l’abondance relative et les niveaux d’activité des enzymes glycoside hydrolase et glycosyltransférase. Des glycanes entiers aberrants uniques résultant de glycosyltransférases dérégulées sont souvent présents à l’état de traces dans des biofluides complexes, ce qui rend leur détection difficile et parfois stochastique. Cependant, avec une bonne préparation des échantillons, l’une des plus anciennes formes de spectrométrie de masse (chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse, GC-MS) peut détecter régulièrement l’ensemble de monosaccharides spécifiques aux points de branchement et de liaison (« nœuds glycanes ») présents dans des biofluides complexes. En complément des techniques traditionnelles de glycomique descendante, l’approche décrite ici implique la collecte et la condensation de chaque nœud glycane constitutif d’un échantillon en un seul signal analytique indépendant, qui fournit des informations structurales et quantitatives détaillées sur les changements du glycome dans son ensemble et révèle des glycosyltransférases potentiellement dérégulées. Les améliorations apportées à la perméthylation et aux étapes ultérieures d’extraction liquide/liquide fournies dans le présent document améliorent la reproductibilité et le rendement global en facilitant l’exposition minimale des glycanes perméthylés à des conditions aqueuses alcalines. Les modifications de l’étape d’acétylation augmentent encore l’étendue de la réaction et le rendement global. Malgré leur reproductibilité, les rendements globaux des acétates d’alditol partiellement perméthylés (PMAA) de N-acétylhexosamine (HexNAc) se sont révélés intrinsèquement inférieurs à leur valeur théorique attendue par rapport aux PMAA hexose. Le calcul du rapport entre l’aire sous le chromatogramme ionique extrait (XIC) pour chaque hexose PMAA (ou HexNAc PMAA) individuel et la somme de ces aires XIC pour tous les hexoses (ou HexNAcs) fournit une nouvelle méthode de normalisation qui facilite la quantification relative des nœuds glycanes individuels dans un échantillon. Bien qu’elle soit actuellement limitée en termes de limites absolues de détection, cette méthode accélère l’analyse des biofluides cliniques et s’avère très prometteuse en tant qu’approche complémentaire à la glycomique descendante traditionnelle.

Chromatogramme de courant ionique total (CIT) présentant perméthylation, de l&#39; hydrolyse, la réduction et l&#39; acétylation des échantillons de plasma sanguin humain par rapport au cas où les deux étapes critiques de la perméthylation ont été exécutées de manière incorrecte sont représentés sur la figure 3. Absolute Rendement HexNAcs relative à hexoses: <p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Cet article présente une forme améliorée d’une nouvelle technique de glycomique ascendante conçue pour analyser le profil de composition groupé des glycanes dans les biofluides non fractionnés par la décomposition chimique des glycanes en leurs monosaccharides spécifiques de liaison constitutive pour la détection par GC-MS. Les applications potentielles comprennent la détection précoce du cancer et d’autres troubles glycanes-affectifs.

Glycan Analyse Node: une approche bottom-up à Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

L'objectif général de cette procédure est de dégrader tous les glycanes présents dans un échantillon biologique tout en conservant l'information relative à la composition en monosaccharides et à leurs liaisons. Cette approche permet de concentrer des caractéristiques intéressantes des glycanes, telles que la sialylation anormale et la N-acétylglucosamine bissectrice, en des signaux analytiques uniques. Cette méthode peut aider à répondre directement à des questions essentielles dans le domaine des glycomiques, comme lesquelles des caractéristiques uniques des glycanes sont modifiées dans des états pathologiques spécifiques.L'avantage principal de cette technique est que les caractéristiques des glycanes qui ont tendance à être modifiées dans les maladies, telles que les ramifications bêta 1-6 et la core-fucosylation, sont condensées en des signaux analytiques uniques plutôt que d'être réparties sur plusieurs glycanes intacts. Généralement, les personnes qui doivent appliquer cette méthode éprouvent des difficultés dues à de faibles rendements en N-acétylcystéines, causés par un traitement inadéquat des glycanes fraîchement perméthylés. Préparez les échantillons en transférant d'abord neuf microlitres de chaque analyte biologique dans des tubes à essai séparés de 1,5 millilitre.À chaque échantillon, ajoutez un microlitre d'eau déionisée et 270 microlitres de DMSO de haute pureté. Mélangez vigoureusement par vortexage. Après la préparation des échantillons, montez les colonnes de centrifugation chargées en hydroxyde de sodium comme décrit dans le protocole écrit.À l’aide d’une seringue analytique, ajouter 105 microlitres d’iodométhane à chaque analyte et boucher immédiatement les tubes. Vortexer soigneusement les échantillons. Débrancher les colonnes de centrifugation préparées précédemment et les centrifuger pendant 15 secondes à 2 400 G. Après avoir jeté les tubes réservoirs et l’affluent, rebrancher les colonnes et les placer dans un nouvel ensemble de tubes, étiquetés pour chaque analyte.Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour transférer chaque solution d'analyte sur la colonne de centrifugation correspondante. Une fois la solution d'analyte ajoutée, froissez environ deux millilitres à partir de l'extrémité d'une pointe de pipette de 200 microlitres et laissez la pointe dans la colonne afin de l'utiliser comme agitateur. Utilisez les pointes de pipette pour agiter doucement les colonnes toutes les deux à trois minutes.Après 11 minutes, débranchez les colonnes et centrifugez-les pendant 15 secondes à 2 400 G. Retirez immédiatement les colonnes de filtration et placez-les dans de nouveaux tubes réservoirs, en conservant la solution de passage mais en éliminant les bouchons. Ajoutez 300 microlitres d'acétonitrile aux colonnes et centrifugez-les pendant 30 secondes à 9 600 G. Transférez maintenant les premières solutions de passage perméthylées dans des tubes à essai en verre silanisés contenant 3,5 millilitres de tampon phosphate de sodium. Assurez-vous que le surnageant transféré est clair et qu'aucun matériau solide n'est transféré.Un petit culot blanc se sera formé au fond des tubes en plastique. Évitez de transférer tout matériau solide visible. Dans le cas contraire, les rendements en glycanes de N-acétylcystéine-glucosamine seront faibles.Vortexez immédiatement chaque échantillon du lot une fois que tous les échantillons ont été transférés. Ensuite, mélangez les solutions de l'acétonitrile issues du passage avec le reste du liquide dans les tubes à essai respectifs. Évitez de nouveau de transférer tout résidu solide blanc lors de cette étape.Fermez, secouez et vortexez les solutions combinées immédiatement avant de passer à l'échantillon suivant. Après la perméthylation, ajoutez 1,2 millilitre de chloroforme dans chaque tube à essai à l'intérieur d'une hotte. Ensuite, fermez les tubes et mélangez vigoureusement le contenu.Pour séparer les couches, centrifuger brièvement les solutions à 3 000 G. Utiliser une pipette Pasteur pour extraire et éliminer la majeure partie de la couche aqueuse supérieure, en laissant environ trois millilitres de cette couche. Ajouter 3,5 millilitres du tampon phosphate de sodium 0,2 M, puis boucher, mélanger et centrifuger le tube à essai. Réaliser cette étape d'extraction liquide/liquide un total de trois fois.Laisser environ un millilitre de la couche aqueuse lors de l'extraction finale. Utiliser maintenant une pipette Pasteur silanisée propre pour transférer soigneusement la couche de chloroforme dans un tube à essai en verre silanisé propre et étiqueté, comme décrit dans le protocole écrit. Dans un système d'évaporation préchauffé à 75 degrés Celsius, sécher les échantillons sous un flux doux de gaz azote.Veillez à ce que le débit de gaz perturbe la surface du liquide sans provoquer d'éclaboussures. Une fois les échantillons secs, ils sont prêts pour l'hydrolyse. Ajoutez 325 micro-litres d'acide trifluoroacétique 2 M, ou TFA, à chaque échantillon et mélangez soigneusement.Fermer hermétiquement chaque tube d'échantillon immédiatement après l'ajout à tous les échantillons afin d'éviter l'évaporation de l'acide trifluoroacétique (TFA) et la perte d'échantillon pendant l'étape de chauffage suivante. Incuber les échantillons à 121 degrés celsius pendant deux heures afin d'hydrolyser les glycanes. Pendant l'incubation des échantillons, préparer à nouveau le système d'évaporation à 75 degrés celsius.Après l'incubation, séchez les échantillons sous un flux constant d'azote dans le collecteur d'évaporation. Vérifiez fréquemment les échantillons afin de vous assurer qu'ils sont complètement secs en utilisant le temps de séchage minimal possible. Ajoutez à chaque échantillon 475 microlitres de borohydrure de sodium à 10 grammes par litre.Ensuite, mélangez soigneusement les échantillons pour dissoudre tout résidu. Boucher les tubes à essai et laisser la réaction de réduction se poursuivre pendant une heure. Ajoutez ensuite 63 micro-litres de méthanol à chaque échantillon.Mélanger, puis sécher les échantillons à 75 degrés celsius sous azote. Ajouter 125 micro-litres de solution de méthanol dans l'acide acétique à chaque échantillon. Mélanger, puis sécher à nouveau les échantillons à 75 degrés celsius sous azote.S'assurer que les échantillons sont complètement secs en les plaçant sous vide pendant 20 minutes. Après séchage, ajouter 18 µL d'eau déionisée à chaque échantillon. Puis centrifuger brièvement les échantillons et les mélanger soigneusement pour dissoudre tout précipité.Ensuite, ajoutez 250 microlitres d'anhydride acétique dans chaque tube. Boucher les tubes, vortexer soigneusement et soniquer les échantillons dans un bain d'eau pendant deux minutes afin de garantir la dissolution complète de tout résidu. Incuber ensuite les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ajoutez maintenant 230 microlitres d'acide trifluoroacétique concentré à chaque échantillon. Après avoir bouché et mélangé les échantillons, incubez-les pendant 10 minutes à une température interne de 50 degrés Celsius. Ajoutez 1,8 millilitre de dichlorométhane à chaque échantillon et mélangez soigneusement.Ensuite, ajoutez deux millilitres d'eau désionisée dans le tube et effectuez une extraction liquide/liquide deux fois. Récupérez la couche de dichlorométhane à l’aide d’une pipette Pasteur silanisée. Transférez dans un flacon d’auto-échantillonneur, puis séchez l’échantillon sous azote à 74 degrés Celsius.Avant la GC-MS, reconstituez chaque échantillon avec 120 microlitres d'acétone, en les bouchant et en les mélangeant soigneusement. En mode partiel, utilisez un auto-échantillonneur pour injecter un microlitre de chaque échantillon dans le liner en mode partiel du chromatographe en phase gazeuse. Pour les spectromètres de masse à temps de vol, un rapport de partage de quarante et de l'hélium en mode débit constant à 0,8 millilitre par minute sont recommandés.Analyser l'échantillon à l'aide d'un gradient en deux étapes atteignant 325 degrés Celsius. Soumettre les composants de l'échantillon élutés à une ionisation électronique. Pour un analyseur de masse par temps de vol, analyser les fragments M sur Z de 40 à 800 avec une fréquence de sommation d'impulsion de 0,1 seconde.Pour démontrer la sensibilité de ce protocole, un échantillon biologique a été traité avec soin. Le chromatogramme obtenu présente une intensité adéquate entre les pics des produits souhaités, facilitant ainsi la comparaison et l'analyse. Le même échantillon biologique de départ a ensuite été traité selon la même procédure.Mais le résidu blanc présent dans la solution de perméthylation qui a été centrifugée à travers la colonne de NaOH a été transféré dans le mélange ultérieur pour l'extraction liquide/liquide. Le chromatogramme présente un rapport différent de l'intensité des pics des mêmes produits clés de l'échantillon. Lorsqu'on les compare directement, la différence est marquée.La dépression nette du pic de N-acétylglucosamine liée à la position 4 dans le second chromatogramme constitue un critère reconnaissable d'une perméthylation et d'une extraction infructueuses. Pour illustrer l'utilité de cette approche dans la détection des différences de composition des glycanes dans les états pathologiques, des chromatogrammes d'ions extraits provenant d'un échantillon de plasma sanguin normal et d'un échantillon de plasma sanguin de patient atteint de cancer sont normalisés par rapport aux mannoses 2-liés puis superposés. Des différences quantitatives dans des caractéristiques uniques des glycanes, telles que le branchement bêta 1-6 ainsi que la sialylation anormale, sont clairement visibles.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une analyse des glycanes selon une approche ascendante en glycomique. Cette méthode permet de faciliter la distillation de caractéristiques glycaniques intéressantes, telles que la corfulcosylation, la sick cyalalation et le glycanite bissant, en signaux analytiques uniques.

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JoVE Journal

Chemistry

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