Glycan Analyse Node: une approche bottom-up à Glycomics

L’objectif global de cette procédure est de décomposer tous les glycanes d’un échantillon biologique tout en conservant la composition en monosaccharides et les informations de liaison. Faciliter la distillation de caractéristiques glycanes intéressantes telles que la cyanalation malade et la bissection de la N-acétylglucosamine en signaux analytiques uniques. Cette méthode peut aider à répondre directement à des questions clés dans le domaine des glycomites, telles que les caractéristiques uniques des glycanes qui sont modifiées dans des états pathologiques particuliers.

Le principal avantage de cette technique est que les caractéristiques des glycanes qui ont tendance à être modifiées dans la maladie, telles que la ramification des bêta-1-6 et la corfulcosulation, sont distillées en signaux analytiques uniques plutôt que d’être réparties sur plusieurs glycanes intacts. En général, les personnes qui ont besoin de cette méthode sont vraiment aux prises avec de mauvaises quantités de N-acétylcystéines en raison d’un traitement inapproprié des glycanes fraîchement perméthylés. Préparez les échantillons en transférant d’abord neuf microlitres de chaque analyte biologique dans des tubes à essai séparés de 1,5 millilitre.

À chaque échantillon, ajoutez un micro-litre d’eau déminéralisée et 270 micro-litres de DMSO de haute pureté. Et mélangez vigoureusement en les vortexant. Après la préparation de l’échantillon, assemblez les colonnes de spin chargées d’hydroxyde de sodium comme décrit dans le protocole de texte.

À l’aide d’une seringue analytique, ajoutez 105 microlitres d’iodométhane à chaque analyte et bouchez immédiatement les tubes. Tourbillonnez soigneusement les échantillons. Débranchez les colonnes de centrifugation préparées précédemment et centrifugez-les pendant 15 secondes à 2 400 G.Après avoir jeté les tubes du réservoir et l’affluent, rebranchez les colonnes et placez-les à l’intérieur d’un nouvel ensemble de tubes, étiquetés pour chaque analyte.

Utilisez une tête de tuyau de 1000 microlitres pour transférer chaque solution d’analyte sur la colonne de centrifugation correspondante. Une fois la solution d’analyte ajoutée, sertir environ deux millilitres à partir de l’extrémité d’une pointe de tête de tuyau de 200 microlitres et laisser la pointe dans la colonne pour l’utiliser comme agitateur. Utilisez les pointes de la tête de tuyau pour remuer doucement les colonnes une fois toutes les deux à trois minutes.

Après 11 minutes, débranchez les colonnes et centrifugez-les pendant 15 secondes à 2 400 G.Retirez immédiatement les colonnes de centrifugation et placez-les dans de nouveaux tubes de réservoir, en économisant la solution à circulation mais en jetant les bouchons. Dans les colonnes, ajoutez 300 microlitres d’acétonenitrile et centrifugez-les 30 secondes à 9 600 G.Transférez maintenant les premières solutions perméthylées dans des tubes à essai en verre silanisé contenant 3,5 millilitres de tampon de phosphate de sodium. Assurez-vous que le surmatelas transféré est clair et qu’aucun matériau solide n’est transféré.

Une petite pastille blanche se sera formée au fond des tubes en plastique. Évitez de transférer tout matériau solide évident. Le non-respect de cette consigne entraînera de faibles rendements en N-acétylcystéine-glucosamine glycane.

Vortex immédiatement chaque échantillon du lot une fois que tous les échantillons ont été transférés. Combinez ensuite les solutions d’acétonenitrile avec le reste du liquide dans les tubes à essai respectifs. Encore une fois, évitez de transférer tout résidu solide et blanc au cours de cette étape.

Boucher, agiter et vortex les solutions combinées immédiatement avant de passer à l’échantillon suivant. Après la perméthylation, ajoutez 1,2 millilitre de chloroforme dans chaque tube à essai à l’intérieur d’une hotte. Ensuite, bouchez les tubes et mélangez vigoureusement le contenu.

Pour séparer les couches, centrifugez brièvement les solutions à 3 000 G.Utilisez une tête de tuyau de pâturage pour extraire et jeter la majeure partie de la couche aqueuse supérieure en laissant environ trois millilitres de la couche derrière. Ajoutez 3,5 millilitres de tampon de phosphate de sodium à 0,2 molaire, puis bouchonnez, mélangez et centrifugez le tube à essai. Exécutez cette étape d’extraction liquide/liquide un total de trois fois.

Laisser environ un millilitre de couche aqueuse dans l’extraction finale. Utilisez maintenant une tête de tuyau de pâturage silanisée propre pour transférer soigneusement la couche de chloroforme dans un tube à essai en verre silanisé propre et étiqueté, comme décrit dans le protocole de texte. Dans un collecteur d’évaporation préchauffé, réglé à 75 degrés Celsius, séchez les échantillons sous un léger courant d’azote gazeux.

Assurez-vous que le flux de gaz perturbe la surface du liquide, mais sans l’éclabousser. Une fois que les échantillons sont secs, ils sont prêts pour l’hydrolyse. Ajoutez 325 microlitres d’acide trifluoroacétique 2 molaires ou TFA à chaque échantillon et mélangez bien.

Fermez hermétiquement chaque tube d’échantillon immédiatement après l’ajout à tous les échantillons pour éviter l’évaporation de TFA et la perte d’échantillon lors de l’étape de chauffage suivante. Incuber les échantillons à 121 degrés Celsius pendant deux heures pour hydrolyser les glycanes. Pendant que les échantillons sont en incubation, préparez à nouveau le collecteur d’évaporation à 75 degrés Celsius.

Après l’incubation, séchez les échantillons sous un flux constant d’azote dans le collecteur d’évaporation. Vérifiez fréquemment les échantillons pour vous assurer qu’ils sont séchés en utilisant le minimum de temps de séchage possible. À chaque échantillon, ajoutez 475 microlitres de 10 grammes par litre de borohydrure de sodium.

Ensuite, mélangez soigneusement les échantillons pour dissoudre tout résidu. Boucher les tubes à essai et laisser la réaction de réduction se poursuivre pendant une heure. Ensuite, ajoutez 63 microlitres de méthanol à chaque échantillon.

Mélangez puis séchez les échantillons à 75 degrés Celsius sous azote. Ajouter 125 microlitres de méthanol à une solution d’acide acétique dans chaque échantillon. Mélangez puis séchez à nouveau les échantillons à 75 degrés Celsius sous azote.

Assurez-vous que les échantillons sont complètement secs en les plaçant sous vide pendant 20 minutes. Après séchage, ajoutez 18 microlitres d’eau déminéralisée à chaque échantillon. Ensuite, centrifugez brièvement les échantillons et mélangez-les bien pour dissoudre un précipité.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres d’anhydride acétique dans chaque tube. Boucher les tubes, bien tourbillonner et soniser les échantillons dans un bain-marie pendant deux minutes pour assurer la dissolution complète de tout résidu. Ensuite, incubez les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ajoutez maintenant 230 microlitres de TFA concentré à chaque échantillon. Après avoir bouché et mélangé les échantillons, incubez-les pendant 10 minutes à une température interne de 50 degrés Celsius. Ajouter 1,8 millilitre de dichlorométhane à chaque échantillon et bien mélanger.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d’eau dionisée dans le tube et effectuez deux fois l’extraction liquide/liquide. Récupérer la couche de dichlorométhane à l’aide d’une tête de tuyau de pâturage silanisée. Transférez-le dans un flacon d’échantillonneur automatique, puis séchez l’échantillon sous azote à 74 degrés Celsius.

Avant la GC-MS, reconstituez les échantillons avec chacun 120 microlitres d’acétone, en les bouchant et en les mélangeant soigneusement. En mode split, utilisez un échantillonneur automatique pour injecter un micro-litre de chaque échantillon dans le liner GC en mode split. Pour les spectromètres de masse à temps de vol, une ration fractionnée de quarante et de l’hélium gazeux en mode débit constant à 0,8 millilitres par minute est recommandée.

Analysez l’échantillon à l’aide d’un gradient en deux étapes qui atteint 325 degrés Celsius. Soumettre les composants de l’échantillon en échappement à l’ionisation électronique. Pour un analyseur de masse en temps de vol, analysez les fragments M sur Z 40 à 800 avec un taux de sommation d’impulsions de 0,1 seconde.

Pour démontrer la sensibilité de ce protocole, un échantillon biologique a été traité avec soin. Le chromatogramme qui en résulte donne une intensité adéquate entre les pics de produit souhaités pour faciliter la comparaison et l’analyse. Le même échantillon biologique de départ a ensuite été traité selon la même procédure.

Mais le résidu blanc dans la solution de perméthylation qui a été filé à travers la colonne NAOH a été transporté dans le mélange ultérieur pour l’extraction liquide/liquide. Le chromatogramme donne un rapport différent de l’intensité de crête des mêmes produits d’échantillon clés. Lorsqu’on les compare directement, la différence est frappante.

La dépression claire du pic de N-acétylglucosamine lié à 4 positions dans le deuxième chromatogramme est un trait reconnaissable d’une perméthylation et d’une extraction infructueuses. Pour apprécier l’utilité de cette approche pour détecter les différences de composition des glycanes dans les états pathologiques, les chromatogrammes ioniques extraits d’un échantillon de plasma sanguin normal et d’un échantillon de plasma sanguin de patient cancéreux sont normalisés pour les manos à 2 liens et superposés. Des différences quantitatives dans les caractéristiques uniques des glycanes telles que la ramification bêta 1-6 ainsi que la cyanalation malade sont facilement apparentes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une anaylsis des ganglions glycanes glycomiques ascendante. Faciliter la distillation de caractéristiques glycanes intéressantes telles que la corfulcosulation, la cyalalation malade et la glycanite coupée en deux en signaux analytiques uniques.