Administration intra-trachéale de Haemophilus influenzae Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

L’objectif global de cette expérience est d’étudier les réponses immunitaires dans les poumons lors d’une infection bactérienne. Cette question peut aider à répondre à certaines questions clés dans le domaine de l’inflammation pulmonaire, telles que quels sont les principaux mécanismes de régulation et les gènes qui inhibent ou favorisent l’inflammation pulmonaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très efficace et hautement reproductible en raison de l’administration directe de l’inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures.

Pour commencer, dressez le NTHi sur une plaque de gélose au chocolat. Incuber l’assiette à l’envers pendant la nuit, à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, cultivez les bactéries dans un bouillon d’infusion cerveau-cœur.

Ensuite, dans un tube de microcentrifugation, ajoutez un millilitre de bouillon. Faites tourner le mélange à 4 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS.

Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Ensuite, diluez 100 microlitres de solution remise en suspension dans 900 microlitres de PBS et mesurez l’absorbance de la culture à 600 nanomètres. Utilisez cette information pour ajuster l’inoculum à 20 millions d’UFC par millilitre.

Ensuite, déterminez la viabilité et les UFC de l’inoculum. Cultivez une à dix dilutions en série du bouillon sur des plaques de gélose au chocolat et incubez les plaques pendant la nuit. Commencez par anesthésier la souris et vérifiez qu’elle est correctement anesthésiée à l’aide d’un pincement des orteils.

Ensuite, positionnez la souris en décubitus dorsal et rasez la zone ventrale du cou. Désinfectez la peau exposée. Maintenant, soulevez la peau de la partie ventrale supérieure du cou avec une pince à dents de rat et, à l’aide d’un scalpel, faites une incision d’un demi-centimètre à un centimètre au-dessus du thymus.

Ensuite, séparez soigneusement le muscle pour exposer la trachée. Dans la trachée, injectez lentement 50 microlitres d’air, suivis de 50 microlitres de NTHi préparés, suivis d’un autre 50 microlitres d’air. Pour une procédure de contrôle négatif, injectez une solution saline au lieu de NTHi.

Après l’injection, maintenez l’animal à la verticale pendant environ une minute. Ensuite, fermez l’incision avec un adhésif tissulaire et gardez la souris allongée latéralement et au chaud pendant environ 10 minutes. 24 heures après l’infection, euthanasier l’animal infecté et ouvrir la cavité abdominale avec des ciseaux anatomiques.

Ensuite, coupez l’aorte ventrale pour saigner l’animal. Ensuite, exposez la partie ventrale du poumon pour accéder à la trachée. Intubez la trachée avec un cathéter de calibre 20.

À l’aide du cathéter, instillez 0,8 millilitre de tampon BALF et collectez le lavage par aspiration dentaire. Répétez cette procédure trois fois de plus, en regroupant les quatre collections de lavage en une seule suspension. Prenez une aliquote de 100 microlitres et tournez-la pendant deux minutes à 2 000 tr/min.

Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans le tampon de lyse des globules rouges. Faites-le tourner et remettez le granulé en suspension avec 1x PBS. Maintenant, comptez le nombre total de cellules dans 100 microlitres de suspension à l’aide d’un hémocytomètre sous un grossissement de 10x avec coloration au bleu de trypan.

Ensuite, préparez des lames pour colorer les cellules. Placez 100 microlitres de suspension BALF dans les puits appropriés des lames de cytospin, et faites tourner les lames à 500 g pendant cinq minutes. Ensuite, séchez les lames pendant 10 minutes à température ambiante et colorez les cellules à l’aide d’un colorant Giemsa modifié selon les protocoles du fabricant.

Utilisez les cellules restantes pour des analyses ultérieures, telles que des faits, la microscopie confocale, etc. Après avoir prélevé le lavage dans le poumon infecté, prélevez un morceau de poumon de 20 à 40 milligrammes et incubez-le dans un réactif stabilisateur d’ARN à quatre degrés Celsius pendant la nuit, suivi d’un stockage à long terme à 80 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt, lavez les échantillons de tissu pulmonaire dans du PBS froid pour éliminer le réactif de stabilisation de l’ARN.

Ensuite, placez le tissu dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre contenant un tampon de lyse avec du bêta-mercaptoéthanol. Ensuite, avec de petits ciseaux, coupez le tissu en morceaux et homogénéisez les morceaux à l’aide d’un pilon motorisé pendant 20 à 40 secondes. Gardez le lysat sur de la glace pendant cinq minutes, puis faites-les tourner à 18 000 g pendant trois minutes.

Retirez délicatement le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube. Ajoutez ensuite un volume d’éthanol à 70 % et triturez le mélange. Laissez reposer le mélange à 25 degrés Celsius pendant deux à quatre minutes.

Ensuite, transférez jusqu’à 700 microlitres dans une colonne de centrifugation sur un tube de collecte de deux millilitres et centrifugez la colonne à 9600 g pendant 15 secondes. Jetez le flux, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage et répétez l’essorage. Ensuite, incubez la membrane avec 80 microlitres de solution DNase I pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage dans la colonne et répétez l’essorage. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage d’ARN. Répétez l’essorage court et jetez le flux.

Faites deux lavages avec un tampon de lavage d’ARN. Enfin, au-dessus d’un nouveau tube de collecte, ajoutez 30 à 50 microlitres d’eau sans RNase directement dans la colonne et faites-la tourner pendant une minute pour recueillir l’échantillon d’ARN dans le flux. La procédure a été réalisée comme décrit avec des souris normales et saines.

L’installation intratrachéale a entraîné une augmentation marquée du nombre de leucocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire des souris inoculées avec NTHi par rapport aux témoins de traitement salin. L’analyse différentielle des leucocytes montre clairement une augmentation de l’infiltration de neutrophiles. L’analyse des faits des cellules du BALF confirme en outre l’augmentation du nombre de neutrophiles.

Les sections du tissu pulmonaire colorées par le HNE montrent une augmentation de l’inflammation des voies respiratoires. Collectivement, ces données suggèrent que l’installation intratrachéale induit une inflammation des voies respiratoires chez la souris. Dans une expérience similaire avec des souris mutantes et témoins, l’ARN du tissu pulmonaire a été analysé par séquençage du transcriptome entier.

Par rapport aux témoins de type sauvage, le déficit en démangeaisons a entraîné l’expression différentielle de plusieurs gènes. On pense que les démangeaisons sont un régulateur des voies de signalisation inflammatoires, de sorte que ce résultat peut être utilisé pour favoriser de nouvelles études. Tout au long de son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des maladies pulmonaires d’explorer la signalisation cellulaire dans les cellules immunitaires lors d’une infection et d’une inflammation pulmonaires.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre des précautions supplémentaires lors des procédures telles que l’exposition de la trachée et l’installation de bactéries dans la trachée. Une fois maîtrisée, l’installation intratrachéale peut être effectuée en dix minutes et le liquide de la fiole peut être recueilli en 10 à 15 minutes. Après cette procédure, des questions supplémentaires telles que le séquençage de l’ARN, la cytométrie en flux et l’immunoblocage peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que quels sont les gènes qui sont régulés à la hausse ou à la baisse.