Name: Administration intra-trachéale de Haemophilus influenzae Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez l'inoculation intra-trachéale de Haemophilus influenzae chez la souris pour étudier l'inflammation des voies aériennes. Cette méthode efficace permet d'analyser les réponses immunitaires pulmonaires et les mécanismes régulateurs impliqués.

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Nous remercions le Dr Carson Harrod pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également M. Minghui Zeng et les Drs Mahesh Kathania et Prashant Khare pour leurs contributions. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Cancer Society (subvention Research Scholar, 122713-RSG-12-260-01-LIB) et du Sammons Cancer Center (subvention du projet pilote) à K. Venuprasad.

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives du Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Institut de recherche Baylor. 1. La culture non-typable Haemophilus influenzae (NTHi) et préparation de l&#39;inoculum <ol><li> Plaque de NTHi sur une plaque de gélose chocolat et maintenir la plaque à l&#39; envers dans un incubateur à CO2 humidifiée pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. Le jour, après culture des bactéries dans un bouillon d&#39;infusion cerveau-coeur. Ensuite, ajoutez 1 ml de bouillon dans un tube de 1,5 ml stérile. </li><li> Centrifuger à 4000 xg pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile 1x. Répétez cette étape une fois. </li><li> Transférer 100 pl de solution de remise en suspension dans 900 ul de PBS 1x et mesurer l&#39;absorbance de la culture diluée à 600 nm de longueur d&#39;onde dans un spectrophotomètre. </li><li> Déterminer l&#39;unité viabilité et formant des coloniess (CFU) de l&#39;inoculum par culture 1:10 dilutions en série sur des plaques de gélose chocolat et incubation pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Sur la base de la viabilité et le nombre de CFU déterminé à partir de l&#39;étape précédente, ajuster l&#39;inoculum à une concentration finale de 20 x 10 6 UFC / ml. </li></ol> 2. intra-trachéale (it) instillation <ol><li> Injecter la souris par voie intrapéritonéale (ip) avec 0,1 ml / 10 g de poids corporel de souris avec une / ml de kétamine + 20 mg / ml d&#39;une solution de 150 mg de xylazine. La procédure doit être fait dans le capot avec une source de lumière pour garder la chaleur animale. </li><li> Pincer l&#39;espace interdigital de la souris pour vérifier que la souris est correctement anesthésiés. </li><li> Placez la souris sur son dos. Rasez la zone ventrale du cou et désinfecter avec de la chlorhexidine et de l&#39;alcool éthylique à 70%. </li><li> Soulever la peau de la partie supérieure ventrale du cou à l&#39;aide de rat pince à dents. Une petite incision (0,5 à 1,0 cm) au-dessus du thymus à l&#39;aide d&#39;un scalpelet de disséquer soigneusement le muscle pour exposer la trachée. <ol><li> En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 G, injecter lentement 0,05 ml d&#39;air, suivi de 0,05 ml NTHi obtenus à partir de la section 1 ou une solution saline comme témoin, suivie d&#39;une autre de 0,05 ml d&#39;air. Gardez l&#39;animal vertical pour environ 1 min. </li></ol></li><li> Fermer l&#39;incision avec de la colle chirurgicale. Gardez la souris latéralement en position couchée et chaud pendant environ 10 min. </li></ol> 3. LLBA Collection <ol><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale 24 heures après l&#39;infection. </li><li> Ouvrez la cavité abdominale de la souris avec des ciseaux anatomiques et couper l&#39;aorte ventrale à saigner. Exposer la partie ventrale du poumon. </li><li> Exposer la trachée et l&#39;intubation avec un cathéter de calibre 20. Instiller 0,8 ml de tampon LLBA (1x PBS, 0,1% de dextrose, 10 U / ml d&#39;héparine) et recueillir le lavage par aspiration douce. Répétez cette procédure trois fois. </li><li> Compter le nombre total de cellules dans 100 ul de suspension à l&#39;aide d&#39;un LLBA hemocytomètre sous un grossissement 10X avec coloration au bleu Trypan. </li><li> Préparer des lames pour la coloration Giemsa modifiée. Aliquote de 100 pi de LLBA dans les puits appropriés de la Cytospin et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Sécher les lames pendant 10 min et tacher les cellules en utilisant Giemsa modifié selon les protocoles du fabricant. </li><li> Utiliser les cellules restantes pour une analyse ultérieure, tels que le tri cellulaire activé florescence (FACS), la microscopie confocale, l&#39; expression génique et Western Blot 13/11. </li></ol> 4. histopathologie Préparation <ol><li> Pour l&#39;analyse histopathologique, infecter des souris avec NTHi comme décrit dans l&#39;étape 2.4. Après 24 heures d&#39;infection, sacrifier les animaux par dislocation cervicale. Couper ouvrir la cavité thoracique anatomiques avec des ciseaux pour exposer les poumons et la trachée, comme mentionné précédemment. Ensuite, insérer le cathéter de calibre 20 dans la trachée. </li><li> Remplissez le poumon avec une solution d&#39;agarose chaud 2% préparé dans 4% de formaline. Une fois lapoumons sont complètement gonflés, le lieu de la glace au-dessus des poumons pour solidifier la solution d&#39;agarose. </li><li> Puis, enlevez délicatement le bouchon thoracique et le mettre dans une solution à 50 ml de formol à 4% dans PBS 1x jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit traité pour (H &amp; E) sections hématoxyline et éosine. </li></ol> 5. FACS coloration des cellules dans le LLBA <ol><li> Mettre à 1 x 10 5 cellules à partir du fluide de LLBA dans une microplaque de titrage à 96 puits à fond en V. </li><li> Laver les cellules avec 300 pi de froid 1x PBS et centrifuger à 4000 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Colorer les cellules avec une solution de coloration de cellules dans 100 ul de PBS 1x (1: 1000 dilution) et conserver à la température ambiante pendant 15 min. </li><li> Laver les cellules avec 300 pi de froid 1x PBS à 4000 xg pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Gardez les cellules dans 100 pi de tampon de lavage FACS [tampon de lavage (PBS 1x, 2% de FBS, 1 mM EDTA, azoture de sodium à 0,1%] contenant 1: 100 dilué Fc-Block pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger les cellules à 4000 g pendant 3 min et jeter supernatant. </li><li> cellules Stain avec 100 pi coloration de surface cocktail (dilution 1: 100) dans un tampon de lavage FACS pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 300 pi de tampon de lavage FACS à 4000 xg pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Fixer les cellules dans 100 pi de paraformaldehyde à 4% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 300 ul de 1 x PBS à 400 g pendant 3 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 300 pi de tampon de lavage FACS. </li><li> Faire des contrôles de coloration unique couleur à l&#39;aide de cytométrie de flux perles. <ol><li> Ajouter une goutte de perles dans la plaque de microlitre 96 puits à fond en V et laver avec 200 ul PBS 1x. </li><li> Ajouter 1 pi d&#39;anticorps de coloration à 100 ul de 1 x PBS et les billes et on incube à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Lavez perles deux fois avec 300 pi de PBS 1x. </li></ol></li><li> Analyser les contrôles et les cellules individuelles tachée par cytométrie en flux 14. </li></ol> 6. Homogénéisation du tissu pulmonaire pour isoler l&#39;ARN <ol><li> Après l&#39;infection, prélever un petit morceau de poumon (20-40 mg) et le maintenir dans l&#39;ARN stabilisant réactif à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, le stocker à -80 ° C jusqu&#39;à ce que la prochaine étape. </li><li> Laver les tissus pulmonaires dans le froid 1x PBS pour se débarrasser du réactif de stabilisation de l&#39;ARN. </li><li> Placer le tissu dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse contenant un tampon de lyse (1 ml de tampon de lyse + 10 ul de β-mercaptoéthanol). </li><li> Hacher le tissu en petits morceaux avec des ciseaux pointus et homogénéiser à l&#39;aide d&#39;un fil moteur pellet pilon pendant 20-40 sec. </li><li> Gardez le lysat sur la glace pendant 5 min et passez à l&#39;étape 7.1. </li></ol> 7. Isolement de l&#39;ARN du poumon <ol><li> Centrifuger le lysat à 18000 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage et transférer soigneusement dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 1 volume d&#39;éthanol à 70% au lysat. Mélanger immédiatement par pipetage et attendre 2-4 min. </li><li> Transférer jusqu&#39;à 700 pi de lysat dans une colonne de centrifugation placédans un tube collecteur de 2 ml. </li><li> Centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec et jeter le flux continu. </li><li> Ajouter 350 pi de tampon de lavage stringent et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Ajouter 80 ul DNase I directement à la membrane de la colonne de spin et de le maintenir à la température ambiante pendant 15 min. </li><li> Ajouter un tampon de lavage stringent 350 pi à la colonne et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lavage d&#39;ARN et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lavage d&#39;ARN et essorage à 9600 xg pendant 2 min. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et centrifuger à 9600 xg pendant 1 min. Jeter l&#39;écoulement. </li><li> Ajouter 30-50 eau libre de RNase-ul directement à la colonne et centrifuger à 9600 xg pendant 1 min. ARN de magasin à -80 ° C. </li><li> Effectuer une analyse 14 RNA-seq. </li></ol>

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<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous décrivons un procédé unique et peu invasive pour inoculer les poumons de souris par un pathogène bactérien du poumon. Nous démontrons que cette procédure peut être utilisée pour étudier la fonction des différents gènes en utilisant des souris qui sont déficientes en gènes des voies de signalisation inflammatoires. Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les réponses inflammatoires à des infections virales et fongiques pulmonaires. Les avantages de cette procédure par rapport aux autres méthod...

L&#39;inflammation est un mécanisme immunitaire fondamental de la défense contre les agents infectieux. Il favorise l&#39;élimination des agents pathogènes et la réparation des tissus endommagés. Il facilite également la récupération à un état ​​de santé normal 1. Cependant, l&#39; inflammation dérégulée conduit souvent à des maladies inflammatoires chroniques 2. Inflammation des voies respiratoires est un facteur déclenchant diverses maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), l&#39; asthme et la fibrose pulmonaire 3. La non typable (non encapsulé) , Haemophilus influenzae (NTHi) est associée à des maladies inflammatoires pulmonaires supérieures et inférieures à 4,5 chroniques. Ce sont les espèces dominantes isolées des voies respiratoires inférieures des enfants et des adultes avec 4,6,7 chronique de la maladie pulmonaire obstructive. La réponse inflammatoire après l&#39;infection NTHi est caractérisée par la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF et l&#39;IL-1β), et il est médié by mitogène protéine kinase activée (MAPK) et le facteur nucléaire-kB (NF-kB) grâce à des récepteurs Toll-like (TLR) 8. Des modèles de souris sont des outils très utiles pour l&#39;analyse de la pathologie sous-jacente de la maladie inflammatoire pulmonaire en raison de la disponibilité des différentes lignes de gènes déficients. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour inoculer des bactéries vivantes atténuées et / produits bactériens, y compris l&#39; instillation intranasale et par inhalation sous forme d&#39; aérosol 9,10. Ici, nous démontrons intra-trachéale instillation. Bien qu&#39;ils soient utilisés moins fréquemment, cette approche est plus efficace et hautement reproductible en raison de la livraison directe de l&#39;inoculum pour les voies respiratoires inférieures.

<table><tbody><tr><td>Plaque de gélose au chocolat</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose Anhydre</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Solution rapide habile</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de seringue 20/26G&nbsp ;</td><td>BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Iml</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>Ciseaux de dissection, droits, 10 cm de long</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Iris Pince à iris dentelée, dentelée, 10cm de long</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler #5 Acier inoxydable, 11cm de long</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10 % Formol</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystyrène tubes à fond rond</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes à centrifuger</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp ; kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Moteur de pestile à granulés (Homoginiseur de tissus)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de microtitration à 96 puits Fond en V</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Dilution de travail 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Dilution de travail 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr> Kit <tr><td>de coloration aqua fixable en direct/mort</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes polystyrène tube à fond rond</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

administration intra-trachéale de<em&gt; haemophilus influenzae</em&gt; dans les modèles de souris pour étudier airway inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour efficacement et livrons directement Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures des souris. Nous démontrons la procédure de préparation H. influenzae inoculum, instillation intra-trachéale de H. influenzae dans le poumon, la collecte du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), l&#39; analyse des cellules immunitaires dans le BALF et l&#39; isolement de l&#39; ARN pour l&#39; analyse différentielle de l&#39; expression génique. Cette procédure peut être utilisée pour étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à une bactérie, un virus ou des champignons. endotrachéale directe instillation est le plus souvent préféré aux procédures d&#39;inhalation par voie nasale ou d&#39;un aérosol, car il fournit plus efficacement l&#39;inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures avec moins d&#39;ambiguïté.

Instillation intra-trachéale a donné lieu à un nombre nettement accru de leucocytes dans le LLBA (figure 1A, panneau de gauche) que l&#39; installation avec une solution saline. L&#39;analyse de comptage différentiel des leucocytes a clairement montré une infiltration accrue de neutrophiles (Figure 1, panneau de droite). L&#39;analyse FACS des cellules dans le BALF a en outre confirmé l&#39;augmentation du nombre de neutrophiles (figure 1B).</str...

Nous démontrons la procédure d’inoculation intra-trachéale d’Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures de souris. Il s’agit d’un outil très utile pour étudier les voies de signalisation qui régulent l’inflammation des voies respiratoires dans des modèles murins.

Administration intra-trachéale de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

L'objectif général de cette expérience est d'étudier les réponses immunitaires dans le poumon lors d'une infection bactérienne. Ce sujet peut aider à répondre à certaines questions clés dans le domaine de l'inflammation pulmonaire, comme quelles sont les mécanismes régulateurs et les gènes clés qui inhibent ou favorisent l'inflammation pulmonaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est très efficace et hautement reproductible en raison de l'administration directe de l'inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures.Pour commencer, ensemencez le NTHi sur une gélose au chocolat. Incubez la gélose retournée pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, cultivez les bactéries dans un bouillon d'infusion cerveau-cœur.Ensuite, dans un tube de microcentrifugeuse, ajoutez un millilitre du bouillon. Faites centrifuger le mélange à 4 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de PBS.Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Ensuite, diluez 100 microlitres de solution resuspendue dans 900 microlitres de PBS, puis mesurez l'absorbance de la culture à 600 nanomètres. Utilisez cette information pour ajuster l'inoculum à 20 millions de UFC par millilitre.Ensuite, déterminez la viabilité et les UFC de l'inoculum. Mettez en culture de un à dix dilutions sérielles du bouillon sur des boîtes de gélose au chocolat, et incubez les boîtes pendant la nuit. Commencez par anesthésier la souris, puis vérifiez qu'elle est correctement anesthésiée à l'aide d'une pincée du orteil.Ensuite, positionnez la souris en décubitus dorsal et rasez la région ventrale du cou. Désinfectez la peau exposée. Soulevez maintenant la peau de la partie ventrale supérieure du cou à l’aide d’une pince à dents de rat, puis, à l’aide d’un scalpel, pratiquez une incision d’un demi à un centimètre au-dessus du thymus.Ensuite, séparez soigneusement le muscle afin d'exposer la trachée. Injectez lentement 50 microlitres d'air dans la trachée, suivis de 50 microlitres de NTHi préparé, puis à nouveau de 50 microlitres d'air. Pour une procédure de contrôle négatif, injectez du sérum physiologique à la place du NTHi.Après l'injection, maintenir l'animal en position verticale pendant environ une minute. Ensuite, fermer l'incision avec un adhésif tissulaire et garder la souris en décubitus latéral au chaud pendant environ 10 minutes. 24 heures après l'infection, euthanasier l'animal infecté et ouvrir la cavité abdominale à l’aide de ciseaux anatomiques.Ensuite, sectionner l'aorte ventrale pour saigner l'animal. Puis, exposer la partie ventrale du poumon afin d'accéder à la trachée. Intuber la trachée à l'aide d'un cathéter de 20 gauge.À l’aide du cathéter, instiller 0,8 millilitre de tampon de LBA et recueillir la lavage par aspiration dentaire. Répéter cette procédure trois fois supplémentaires, en regroupant les quatre prélèvements de lavage en une seule suspension. Prélever un aliquot de 100 microlitres et centrifuger pendant deux minutes à 2 000 tr/min.Éliminer le surnageant et resuspendre dans du tampon de lyse des globules rouges. Centrifuger et resuspendre le culot dans du PBS 1x. Compter ensuite le nombre total de cellules dans 100 microlitres de la suspension à l’aide d’un hématimètre, en utilisant un grossissement de 10x et une coloration au bleu de trypan. Ensuite, préparez des lames pour colorer les cellules. Répartissez 100 microlitres de la suspension de LBA dans les puits appropriés des lames de cytocentrifugation et centrifugez les lames à 500 g pendant cinq minutes. Puis, faites sécher les lames pendant 10 minutes à température ambiante et colorez les cellules à l’aide d’une coloration de Giemsa modifiée, conformément aux protocoles du fabricant.Utilisez les cellules restantes pour des analyses ultérieures, telles que des faits, la microscopie confocale, et ainsi de suite. Après avoir collecté le lavage du poumon infecté, prélevez un morceau de poumon de 20 à 40 milligrammes et incubez-le dans un réactif de stabilisation de l'ARN à quatre degrés Celsius pendant la nuit, suivi d'un stockage à long terme à 80 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt, lavez les échantillons de tissu pulmonaire dans du PBS froid pour éliminer le réactif de stabilisation de l'ARN.Ensuite, placer le tissu dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre contenant du tampon de lyse avec du bêta-mercaptoéthanol. Puis, à l’aide de petites ciseaux, hacher le tissu en morceaux et homogénéiser les morceaux à l’aide d’un pilon motorisé pendant 20 à 40 secondes. Garder le lysat sur de la glace pendant cinq minutes, puis centrifuger à 18 000 g pendant trois minutes.Retirez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube. Ajoutez ensuite un volume d'éthanol à 70 % et triturez le mélange. Laissez reposer le mélange à 25 degrés Celsius pendant deux à quatre minutes.Ensuite, transférez jusqu'à 700 microlitres dans une colonne de centrifugation placée sur un tube de collecte de deux millilitres et centrifugez la colonne à 9600 g pendant 15 secondes. Jetez le flux traversant, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage et répétez la centrifugation. Incubez ensuite la membrane avec 80 microlitres de solution d'ADNase I pendant 15 minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon de lavage sur la colonne et répétez la centrifugation. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon de lavage pour ARN. Répétez une brève centrifugation, puis jetez le flux traversant.Effectuez deux lavages avec le tampon de lavage pour ARN. Enfin, au-dessus d'un nouveau tube de collecte, ajoutez directement 30 à 50 microlitres d'eau sans RNase sur la colonne et faites-la centrifuger pendant une minute afin de recueillir l'échantillon d'ARN dans l'écoulement. La procédure a été réalisée comme décrit avec des souris normales et saines.L'installation intratrach&eacute;ale a entra&icirc;n&eacute; une augmentation marqu&eacute;e du nombre de leucocytes dans le liquide de lavage bronchoalv&eacute;olaire de souris inocul&eacute;es avec NTHi par rapport aux t&eacute;moins trait&eacute;s au s&eacute;rum physiologique. L'analyse du compte diff&eacute;rentiel des leucocytes montre clairement une infiltration accrue de neutrophiles. L'analyse FACTS des cellules du LBA confirme &eacute;galement l'augmentation du nombre de neutrophiles.Les coupes de tissu pulmonaire colorées à l'HNE montrent une inflammation accrue des voies respiratoires. Dans leur ensemble, ces données suggèrent que l'installation intratrachéale induit une inflammation des voies respiratoires chez la souris. Dans une expérience similaire utilisant des souris mutantes et des souris contrôles, l'ARN du tissu pulmonaire a été analysé par séquençage du transcriptome complet.Par rapport aux témoins de type sauvage, la déficience en Itch a entraîné une expression différentielle de plusieurs gènes. On pense qu’Itch régule les voies de signalisation inflammatoire, de sorte que ce résultat peut servir à encourager de nouvelles études. Tout au long de son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies pulmonaires pour explorer la signalisation cellulaire dans les cellules immunitaires durant l’infection et l’inflammation pulmonaires.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de prendre des précautions supplémentaires lors d'étapes telles que l'exposition de la trachée et l'installation de bactéries dans la trachée. Une fois maîtrisée, l'installation intratrachéale peut être effectuée en moins de dix minutes, et le fluide du tube peut être recueilli en 10 à 15 minutes. Après cette procédure, des analyses supplémentaires telles que le séquençage de l'ARN, la cytométrie en flux et le blocage immunologique peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme par exemple quels sont les gènes qui sont surexprimés ou sous-exprimés.

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