Name: A Mont entier In Situ Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode Lymnaea stagnalis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Apprenez une méthode d'hybridation in situ sur montage entier pour visualiser l'expression génique chez Lymnaea stagnalis. Ce protocole permet une décapsulation rapide des embryons et larves pour l'analyse en biologie du développement.

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Ce travail a été soutenu par un financement à DJJ à travers le projet DFG # JA2108 / 2-1.

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent notre méthode pour mener une expérience in situ sur les stades embryonnaires et larvaires de L. stagnalis. Lorsqu&#39;une étape implique l&#39;utilisation d&#39;un produit chimique dangereux ceci est indiqué par le mot «ATTENTION» et toutes les procédures de sécurité appropriées devraient être adoptées. Liens vers les fiches signalétiques représentatifs des produits chimiques dangereux sont fournis dans le dossier supplémentaire 1. Recettes pour tous les réactifs sont fournis dans le dossier complémentaire 2. Assemblée 1. de Decapsulation Appareil <ol><li> Pour ce faire, connectez un 20 ml seringue jetable à un tube de silicium (avec un diamètre interne de 1 mm et un diamètre extérieur de 3 mm) à l&#39; aide d&#39; une pointe de P1,000 coupé à une longueur appropriée comme indiqué sur la Figure 2A. </li><li> Collez une lame de microscope standard pour un plat inversé Petri grande. Tape le tube de silicium immédiatement adjacente à la lame de microscope , comme illustré sur la figure60; 2C et 2D. </li><li> Reposez une aiguille de verre tiré sur la lame de microscope et doucement l&#39; insérer dans le tube de silicium jusqu&#39;à ce que la pointe de l&#39;aiguille dépasse environ 20% de la largeur du diamètre intérieur du tube (voir la figure 2C et 2D). Une fois que l&#39;aiguille est en position du ruban adhésif vers le bas pour la boîte de Pétri. </li><li> Laisser l&#39;extrémité libre du tube de silicium pour se reposer dans une autre boîte de Pétri qui permettra de recueillir le matériau décapsulé. </li></ol> 2. Echantillon Collection, Fixation et Decapsulation Remarque: Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. <ol><li> Recueillir soigneusement les chaînes d&#39;œufs provenant des parois d&#39;un aquarium. Pour ce faire, utilisez un morceau plat de plastique souple comme une spatule pour gratter la chaîne d&#39;œufs hors du substrat, et d&#39;utiliser une passoire à thé en plastique pour pêcher la chaîne d&#39;oeuf flottant sur l&#39;eau. Scène et trier le matériau au microscope en utilisant le guide fourni dans la Figure1. </li><li> Placez la chaîne d&#39;oeuf sur une serviette en papier et de faire une incision longitudinale le long de la masse d&#39;oeufs à l&#39;aide des pinces de poids plume. Rouler les capsules d&#39;oeufs sur la chaîne d&#39;oeuf et enlever le plus de la matière gelée que possible de chaque capsule en les poussant autour de la serviette en papier à l&#39;aide des pinces de poids plume. </li><li> Utilisation de la pince de plume, transférer les capsules d&#39;oeufs dans une boîte de Pétri contenant 5 ml d&#39;eau du robinet. Continuer à recueillir des capsules de-gélifiée œufs des stades de développement souhaités dans ce plat. Recueillir suffisamment de capsules de tous les stades de développement pour l&#39;expérience de WMISH planifiée puis passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Lorsque l&#39;on travaille avec des larves plus développées (5 jours après la première division (DPFC) et plus) anesthésier les avant la fixation. NOTE: Cela permettra d&#39; éviter de contracter les muscles qui rend l&#39;interprétation des motifs de coloration in situ très difficiles. <ol><li> Relax larves (alors qu&#39;ils sont encore dans leur capsules) dans une solution à 2% p / v de MgCl 2 • 6H 2 O pendant 30 min avant la fixation. </li><li> Évaluer le degré de détente après 30 min en submergeant plusieurs larves tout en restant dans leurs capsules d&#39;œufs en solution fixateur et le suivi de leur réponse sous un microscope. Incomplètement larves détendue se rétracte dans leurs coquilles, tandis que les larves complètement détendu ne répondra pas. Une fois que ces larves ont été assouplies passer à l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> Transférer les capsules d&#39;oeufs à l&#39; aide d&#39; une pipette large alésage en matière plastique pouvant être scellé dans un tube qui fournit 10 fois le volume des capsules d&#39;oeufs (par ex., 1 ml de capsules réglées nécessiterait un tube ml 10+). </li><li> Aspirer autant de liquide que possible du tube et de le remplacer par un volume de solution de fixation qui est 10 fois le volume des capsules d&#39;oeufs réglées. Tournez doucement les capsules d&#39;oeufs en fixateur à température ambiante pendant le temps approprié pour chaque stade de développement (voir la figure 1). </li><li> Discontinrotation ue et laisser les capsules de couler et aspirer la solution de fixateur dans un conteneur à déchets approprié. </li><li> Laver les capsules d&#39;oeufs en remplaçant la solution fixative avec une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Tween-20 (PBTw) et tournant à température ambiante pendant 5 min. Aspirer le PBTw et répéter deux fois. </li><li> Retirer les embryons et les larves de leurs capsules en utilisant l&#39;appareil (voir la section 1 pour plus de détails) montre la figure 2. Dessinez les capsules dans la seringue de 20 ml, fixez le tube puis dissiper les capsules à travers le tube et le passé de l&#39;aiguille de verre dehors dans le plat de collection. REMARQUE: Normalement, la majorité (&gt; 90%) de toutes les capsules devrait avoir besoin un seul passage à travers le dispositif. Dans de nombreux cas, la membrane de la capsule est endommagée, mais les embryons et les larves restent à l&#39;intérieur de la capsule rompue. Retraiter ce matériau par simple tirant dans la seringue et de dissiper à nouveau. </li><li> Recueillir les embryons décapsulé et les larves dans un tube de 1,5 ml en utilisant un microropipette (un P20 0 - 3 jours larves, et P200 pour les larves plus âgées avec l&#39;extrémité de la pointe coupée). NOTE: Une pause (jusqu&#39;à plusieurs mois) dans le protocole peut être faite à ce stade. Si cela est nécessaire, le matériau decapsuled doit être recueilli dans un tube de 1,5 ml pour le stockage (passez à l&#39;étape suivante). Sinon continuer immédiatement protocole n ° 3. </li><li> Autoriser les embryons et les larves tombent au fond du tube et aspirer le surnageant. Remplacer avec 33% d&#39;éthanol (EtOH) en PBTw et laisser reposer pendant 5 - 10 min. Répéter l&#39;opération avec 66% EtOH dans PBTw et 100% EtOH. Laver les larves deux fois dans 100% EtOH à température ambiante. Conserver le matériau à -20 ° C dans 100% EtOH. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à continuer, réhydrater les échantillons en supprimant l&#39;EtOH à 100% et le remplacement de 66% EtOH dans PBTw, laissez reposer pendant 5 à 10 min. Répéter l&#39;opération avec 33% EtOH dans PBTw, laisser reposer pendant 5 - 10 min. Enfin laver avec 3x 5 min lavages de PBTw pour assurer que tout EtOH est éliminé. </li></ol> 3. protéinase-K, TEA et Post-fixation NOTE: Nous trouver d&#39;effectuer les étapes suivantes dans des petits paniers avec un plancher de maille la méthode la plus efficace et doux pour échanger rapidement des solutions critiques de temps. Bien que ceux - ci peuvent être faits maison, nous utilisons des paniers (de taille moyenne) qui sont compatibles avec la manipulation du liquide robot de Intavis InSituPro -Vsi (de www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Ces paniers peuvent être rapidement et facilement déplacés entre les puits d&#39;une boîte de 12 culture tissulaire (TCD) pour des solutions d&#39;échange, ou de la solution peuvent être aspirés à partir du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette. Sinon, tous les échanges de solutions peuvent être réalisées sans ces paniers en aspirant simplement le surnageant des larves. Dans ce cas, un mouvement tourbillonnant douce se concentrera tous les embryons et les larves au centre du plat permettant le surnageant à retirer à partir du bord du puits. Ce qui suit suppose que l&#39;utilisateur emploie des paniers pour les échanges de solutions. <ol><li> En utilisant une pipette, Les embryons de transfert et les larves dans un panier assis dans un TCD 12 puits avec 2 ml de PBTw. NOTE:. Le nombre d&#39;embryons et / ou des larves qui peuvent être ajoutés dépend du stade de développement à l&#39;étude, mais une règle générale est de maintenir au moins 25% de l&#39;espace libre au sol d&#39;embryons / de larves (ie, ne pas surchargez le panier). </li><li> Préparer un puits adjacent avec 2 ml de la solution protéinase-K approprié (voir Figure 1), et un autre 2 puits avec 2 ml de 0,2% Glycine chacun. Déplacez chaque panier dans le puits contenant la concentration appropriée de protéinase-K et commencer immédiatement la synchronisation. </li><li> Après 10 min déplacer chaque panier dans un puits contenant 0,2% de glycine et on incube pendant 5 min. Puis déplacez chaque panier dans le second puits avec 0,2% Glycine et incuber pendant 5 min. Laver le Glycine avec 3x 5 échanges min de 3 ml PBTw. </li><li> Retirer la solution PBTw et traiter les échantillons une fois avec fraîchement préparé Triéthanolamine (TEA) solution pendant 5 min ATTENTION! Ne pas agiter. Remplacer avec 3 ml de solution de TEA fraîchement préparé pendant 5 min. Ne pas agiter. Aspirer la majeure partie de la solution de thé à partir des échantillons. Ajoutez le Triéthanolamine fraîchement préparé avec de l&#39;anhydride acétique (TEAAA) solution et incuber pendant 5 min. ATTENTION! Ne pas agiter. </li><li> EN OPTION - Alors que l&#39;étape ci-dessus est en phase d&#39;incubation, préparer un autre nouveau lot de solution de TEAAA et répétez l&#39;étape ci-dessus. NOTE: Ce second traitement avec TEAAA est facultative, mais peut aider à éliminer complètement tous les arrière-plan avec des sondes sujettes à générer fond. </li><li> Retirer la solution de TEAAA par aspiration à partir du puits et le remplacer par 3 ml de PBTw. Ne pas agiter. Retirez le PBTw et appliquer 3 ml de 3,7% de formaldéhyde dans PBTw. Remuer doucement de temps en temps au cours d&#39;une incubation de 30 min. </li><li> Retirer le fixateur en aspirant à partir du puits et le remplacer par 3 ml de PBTw. Transférer le matériau dans un tube de 1,5 ml. REPlacez l&#39;PBTw avec un tampon d&#39;hybridation et incuber pendant 5 min à température ambiante - ATTENTION. </li><li> Placer les tubes dans un bloc chaud à la température ambiante, et régler la température à la température d&#39;hybridation souhaitée. NOTE: La température d&#39;hybridation est sonde spécifique et devra être empiriquement optimisé, cependant, nous trouvons 55 ° C pour être une bonne température initialement procès. Laisser le bloc à venir à la température d&#39;hybridation, et laisser les échantillons de pré-hybrident pendant environ 15 min (soit le temps qu&#39;il faut pour préparer les ribosondes, plus est pas nécessaire). Préparer des volumes adéquats (normalement 100 pi) des ribosondes dilué. Nous concentrations de sonde généralement essai de 100 et 500 ng / ml comme une gamme initiale. Nous préparons ribosondes selon 12. </li><li> Retirer le tampon d&#39;hybridation à partir des échantillons et ajouter la sonde dans un tampon d&#39;hybridation pour les échantillons. Superposition avec 100 ul (ou un volume suffisant pour former une phase au-dessus de la Buffe d&#39;hybridationr) de l&#39;huile minérale. REMARQUE: L&#39;huile minérale empêche une vaste condensation qui formera au cours de l&#39;étape d&#39;hybridation longue. la condensation étendue modifie de manière significative à la fois la chimie de la solution d&#39;hybridation et la concentration de la sonde. </li><li> Dénature la sonde et l&#39;ARN cible en chauffant les échantillons à 75 ° C pendant 10 min, puis réduire la chaleur à la température d&#39;hybridation souhaitée. Laisser l&#39;hybridation se dérouler pendant un minimum de 12 heures (O / N) ou plus (24-48 h). </li><li> Pendant l&#39;hybridation supprimer un seul tube à partir du bloc thermique, faire pivoter rapidement entre le pouce et l&#39;index de suspendre les larves sans perturber la phase huileuse, et de le remplacer dans le bloc thermique. Répétez cette fois tous les 6-12 heures ou plus. </li></ol> 4. Washes Hot et immunodétection NOTE: Bien que nous utilisons un robot de manipulation de liquide pour les étapes suivantes, ceux-ci peuvent facilement être effectuées manuellement. Dans ce cas, les embryons et les larves shoULD être conservés dans les tubes de 1,5 ml ont été hybridées. Tous les échanges de solutions ultérieures sont aspirés et a ajouté avec une pipette P1,000. Quand elle est réalisée manuellement chacune des étapes suivantes devrait employer 1 ml de chaque solution. <ol><li> La chaleur des volumes adéquats (3 ml chacune, pour chaque échantillon) de la 4x, 2x et 1x solutions de lavage à la température d&#39;hybridation. </li><li> Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage 4x pendant 15 minutes chacun à la température d&#39;hybridation. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage 2x pendant 15 min chacun à la température d&#39;hybridation. Laver tous les échantillons trois fois dans du tampon de lavage pendant 15 min 1x chacun à la température d&#39;hybridation. </li><li> Laver tous les échantillons une fois avec 1 x tampon de chlorure de sodium Citrate de sodium + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% Tween) à la température d&#39;hybridation. Laisser les échantillons refroidir à la température ambiante. </li><li> Laver tous les échantillons deux fois dans 1x SSC + 0,1% de Tween pendant 15 min Remplacer cette solution SSC 1x avec le tampon acide maléique (MAB) et laisser reposer pendant 10 min Répétez le MAB wcendre. Remplacer MAB avec une solution de bloc et incuber pendant 1,5 heure. </li><li> Échanger la solution de bloc pour une solution d&#39;anticorps (1: 10000 dilution de l&#39;anticorps dans une solution de blocage) et on incube pendant 12 heures (O / N) à température ambiante sous agitation douce. </li></ol> 5. Développement de couleur et de montage <ol><li> Aspirer la solution d&#39;anticorps et laver 15 fois avec PBTw pendant 10 minutes chacun. Remplacez PBTw avec 1x tampon phosphatase alcaline (AP) et incuber pendant 10 min. </li><li> Bien que le produit de l&#39; étape d&#39;incubation ci - dessus, préparer la solution de coloration AP (voir fichier complémentaire 2) - ATTENTION. Transférer le matériel dans un TCD bien et remplacer la solution 1x AP avec une solution AP de coloration. Notez le temps de sorte que la durée de la réaction colorée a lieu pour peut être enregistré. Surveiller le développement du modèle de marquage jusqu&#39;à ce que le rapport signal d&#39;arrière-plan est optimale. </li><li> Pour arrêter le développement de la couleur, enlever la solution de coloration 1x AP (en disposer dans le wast appropriée conteneur), et appliquer 2 ml de PBTw et notez le temps maintenant. Rincer deux fois avec PBTw pendant 5 minutes chacun. Utilisez l&#39;une de ces rinçages pour transférer le matériau dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Retirez le PBTw et appliquer 1 ml de formaldehyde à 3,7% en PBTw et agiter ou faire pivoter pour moins de 30 min à température ambiante (cela peut aussi être fait O / N). </li><li> Laver le fixateur avec 3 lavages de PBT (éliminer le fixateur des déchets dans un conteneur à déchets approprié). Laver les échantillons 3 fois à 50 ° C dans de l&#39;eau déminéralisée. NOTE: Ces lavages éliminent la précipitation des sels qui peuvent devenir visibles lors de la compensation et les étapes de visualisation. </li><li> Décider si les échantillons doivent être montés dans benzyl benzoate: Alcool benzylique (BB: BA, également connu sous le nom de Murray clair) ou de glycérol. NOTE: Nous préférons l&#39;agent de compensation plus puissant BB: BA en L. embryons stagnalis sont quelque peu opaque. Les échantillons destinés à être montés en BB: BA devra d&#39;abord être déshydraté par une série d&#39;éthanol. Les échantillons destinés à être montés dans 60%le glycérol peut être monté immédiatement. </li><li> Transférer les échantillons dans la solution de montage (BB: BA ou 60% de glycérol) à l&#39;aide d&#39;une pipette. NOTE: Lors du montage en BB: BA cela doit être fait dans un verre bien (BB: BA va fondre le plastique polycarbonate). </li><li> Laisser les échantillons pour effacer pendant 5 - 10 min, puis les monter sur une lame en utilisant un nombre approprié de lamelles empilées comme espaceurs (1 lamelle pour les échantillons &lt;1 DPFC, 2 Lamelles pour les échantillons&gt; 1 DPFC). NOTE: montures entières peuvent maintenant être visualisés à l&#39;aide d&#39;un microscope composé avec optique DIC. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

La méthode décrite ici permet la visualisation efficace des transcrits d&#39;ARN avec vraisemblablement des niveaux variables d&#39;expression au sein de tous les stades de développement de Lymnaea stagnalis. Pour supprimer des embryons et des larves de leurs capsules , nous trialed une variété de traitements chimiques et physiques, un choc osmotique et rapporté pour d&#39; autres encapsulated- le développement des organismes modèles. Cependant, dans nos mains la méthode que nous décrivons ici est la seule tech...

Les mollusques sont un groupe d&#39;animaux qui détiennent l&#39;intérêt d&#39;une grande diversité de disciplines scientifiques. En dépit de leur diversité morphologique 1, la richesse en espèces ( en second lieu seulement aux arthropodes en termes de nombre d&#39;espèces 2) et de la pertinence d&#39;une large gamme de 3 commerciaux, médicaux et scientifiques 4 questions 5-8, il y a relativement peu d&#39; espèces de mollusques qui peuvent prétendre à être à la fois des modèles scientifiques bien équipés et faciles à entretenir dans un environnement de laboratoire. Un mollusque qui est beaucoup utilisé par des disciplines telles que la neurobiologie 9, écotoxicologie 10 et plus récemment la biologie évolutionniste 11,12, est Lymnaea stagnalis, principalement en raison de sa large distribution et de l&#39; extrême facilité d&#39;entretien. En dépit de sa popularité en tant que «modèle» organisme et sa longue histoire d&#39;utilisation par les biologistes du développement 13-19, la portée et la puissance des outils moléculaires disponibles pour le L. StAGNalis communauté scientifique est loin derrière celle des modèles plus traditionnels animaux (drosophile, souris, oursin de mer, nématodes). Notre volonté de développer Lymnaea comme un modèle moléculaire découle d&#39;un intérêt pour les mécanismes moléculaires qui guident la formation de la coquille. Cela nous a motivé pour affiner un ensemble de techniques qui permettraient de la visualisation efficace, cohérente et sensible de l&#39; expression des gènes au cours du développement de l &#39;Lymnaea. Whole mount hybridation in situ (WMISH) est largement utilisé pour une variété d&#39;organismes modèles et a été utilisé pendant plus de 40 ans 20. Dans ses différentes formes, ISH peut être utilisée pour localiser spatialement locus spécifiques sur des chromosomes, un ARNr, un ARNm et des micro-ARN. L&#39; un des défis que nous avons besoin pour faire face avant d&#39; affiner une méthode de WMISH pour L. stagnalis était la question des embryons doucement et efficacement l&#39; extraction et les larves de différents stades de til capsules d&#39;oeufs dans lesquels ils sont déposés. Cette extraction ou «désencapsulation», doit être réalisée de manière efficace afin de collecter un matériel adéquat pour une donnée expérience in situ, tout en conservant l&#39; intégrité morphologique et cellulaire. Alors que d&#39; autres organismes modèles subissent également le développement encapsulées dans nos mains , aucune des méthodes rapportées pour ces espèces peut être employée avec succès dans L. stagnalis. Les objectifs généraux de cette méthode sont donc: pour extraire L. stagnalis embryons et des larves de leurs capsules dans un mode à haut débit, d&#39;appliquer des traitements de pré-hybridation qui optimisent le signal de WMISH, pour préparer des embryons et des larves avec WMISHsignals satisfaisantes pour l&#39; imagerie.

<table><tbody><tr><td>Pince poids plume</td><td>Ehlert & Partenaire</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en silicone</td><td>Glasger&auml ; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 puits Boîtes de culture tissulaire</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>ATTENTION - Peut provoquer le cancer. Toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Toxique : danger d’effets irréversibles très graves par inhalation, par contact avec la peau et en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>ATTENTION - PROVOQUE UNE IRRITATION DES YEUX. PEUT PROVOQUER UNE IRRITATION DES VOIES RESPIRATOIRES ET DE LA PEAU. Évitez de respirer la poussière. Évitez tout contact avec les yeux, la peau et les vêtements. Utiliser uniquement avec une ventilation adéquate</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>ATTENTION - Peut être nocif en cas d’inhalation. Peut provoquer une irritation des voies respiratoires. Peut être nocif s’il est absorbé par la peau. Peut provoquer une irritation de la peau. Peut provoquer une irritation des yeux. Peut être nocif en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>ATTENTION - Peut être nocif en cas d’inhalation. Peut provoquer une irritation des voies respiratoires. Peut être nocif s’il est absorbé par la peau. Peut provoquer une irritation de la peau. Peut provoquer une irritation des yeux. Peut être nocif en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>Sans nucléaseAlbumine sérique bovine</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Sperme de saumon</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>ATTENTION - LES EFFETS INDÉSIRABLES COMPRENNENT L’HÉMORRAGIE, L’IRRITATION LOCALE. RÉACTION ALLERGIQUE POSSIBLE EN CAS D’INHALATION, D’INGESTION/DE CONTACT. IRRITANT POUR LES YEUX, LA PEAU ET LES VOIES RESPIRATOIRES. HYPERSENSIBILISATION POSSIBLE. PENDANT LA GROSSESSE A ÉTÉ SIGNALÉ POUR AUGMENTER LE RISQUE DE MORTINATALITÉ</td></tr><tr><td>Protéinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Formamide désionisé</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>ATTENTION - Irritant pour les yeux et la peau. Peut être nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Peut causer du tort à l’enfant à naître. Hygroscopique.</td></tr><tr><td>Formamide standard</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>ATTENTION - Irritant pour les yeux et la peau. Peut être nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Peut causer du tort à l’enfant à naître. Hygroscopique.</td></tr><tr><td>Triéthanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>ATTENTION - Évitez de respirer de la vapeur ou du brouillard. Évitez tout contact avec les yeux. Évitez tout contact prolongé ou répété avec la peau. Lavez soigneusement après manipulation.</td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>ATTENTION - PROVOQUE DE GRAVES BRÛLURES DE LA PEAU ET DES YEUX. RÉAGIT VIOLEMMENT AVEC L’EAU. NOCIF EN CAS D’INGESTION. VAPEUR IRRITANTE POUR LES YEUX ET LES VOIES RESPIRATOIRES</td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>ATTENTION - Très dangereux en cas de contact oculaire (irritant), d’ingestion, . Dangereux en cas de contact cutané (irritant), d’inhalation (irritant pulmonaire). Légèrement dangereux en cas de contact avec la peau (perméateur). Corrosif pour les yeux et la peau.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>ATTENTION - Peut être nocif en cas d’inhalation. Peut provoquer une irritation des voies respiratoires. Peut être nocif s’il est absorbé par la peau. Peut provoquer une irritation de la peau. Peut provoquer une irritation des yeux. Nocif en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>Alcool benzylique</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>ATTENTION - Nocif en cas d’ingestion. Nocif en cas d’inhalation. Provoque une grave irritation des yeux.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Poudre bloquante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugués Roche</td><td></td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue chlorure de tétrazolium dans le diméthylformamide&nbsp ;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>ATTENTION - Peut causer des dommages à l’enfant à naître. Nocif par inhalation et par contact avec la peau. Irritant pour les yeux.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>ATTENTION - Potentiellement nocif en cas d’ingestion. Ne pas mettre sur la peau, les yeux ou les vêtements. Irritant potentiel pour la peau et les yeux.</td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>ATTENTION - Peut provoquer une irritation des yeux et de la peau. Peut provoquer une irritation des voies respiratoires et digestives. Les propriétés toxicologiques de ce matériau n’ont pas été pleinement étudiées.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>ATTENTION - Peut être nocif en cas d’inhalation. Peut provoquer une irritation des voies respiratoires. Peut être nocif s’il est absorbé par la peau. Peut provoquer une irritation de la peau. Peut provoquer une irritation des yeux. Peut être nocif en cas d’ingestion.</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>ATTENTION - Nocif en cas d’ingestion. Toxique au contact de la peau. Provoque une irritation de la peau. Provoque de graves lésions oculaires. Peut provoquer une irritation respiratoire.</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na2HPO4&#8226 ; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté (C6H5Na3O7&#8226 ; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>ATTENTION - Peut provoquer une irritation des yeux, de la peau et des voies respiratoires. Les propriétés toxicologiques de ce matériau n’ont pas été pleinement étudiées.</td></tr><tr><td>Huile minérale&nbsp ;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&nbsp ;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a mont entier<em&gt; in situ</em&gt; méthode hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; lymnaea stagnalis</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount hybridation in situ (WMISH) est une technique qui permet la résolution spatiale des molécules d&#39;acide nucléique (souvent ARNm) dans une préparation de tissu «tout support», ou le stade de développement (comme un embryon ou larve) d&#39;intérêt. WMISH est extrêmement puissant car il peut contribuer de manière significative à la caractérisation fonctionnelle des génomes de métazoaires complexes, un défi qui devient de plus d&#39;un goulot d&#39;étranglement avec le déluge de données de séquence de la prochaine génération. En dépit de la simplicité conceptuelle de la technique de temps est souvent nécessaire d&#39;optimiser les différents paramètres inhérents aux expériences WMISH pour les nouveaux systèmes de modèles; de subtiles différences dans les propriétés cellulaires et biochimiques entre les types de tissus et des stades de développement signifient qu&#39;une méthode de WMISH unique peut ne pas convenir à toutes les situations. Nous avons mis au point un ensemble de méthodes WMISH pour les ré-émergentes modèle gastéropode Lymnaea stagnalis qui génèrent cohérente etsignaux WMISH clairs pour une gamme de gènes, et dans tous les stades de développement. Ces méthodes comprennent l&#39;affectation des larves de l&#39; âge chronologique inconnue à une fenêtre ontogénétique, l&#39;élimination efficace des embryons et des larves de leurs capsules d&#39;oeufs, l&#39;application d&#39;un traitement à la protéinase-K approprié pour chaque fenêtre ontogénétique, et l&#39; hybridation, post-hybridation et immunodétection des pas. Ces méthodes fournissent une base à partir de laquelle le signal résultant d&#39;une transcription d&#39;ARN donné peut être encore affiné avec des ajustements spécifiques de la sonde (principalement sonder la concentration et la température d&#39;hybridation).

Les motifs de coloration de WMISH représentatifs représentés sur la figure 3 ont été produites en utilisant la technique décrite ci - dessus, correspondent à une variété de schémas d&#39;expression spatiale pour les gènes impliqués dans une variété de processus moléculaires allant de la formation de la coquille (gène Novel 1, 2, 3 et 4), à la signalisation cellule-cellule (Dpp) à la régulation de la transcription (Brachyury) à travers ...

L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs un ensemble de méthodes pour la décapsulation à haut débit des embryons et des larves de Lymnaea stagnalis en préparation de l’hybridation in situ sur l’ensemble du mont, et pour les traitements ultérieurs de pré et post-hybridation.

A Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

L'objectif général de ce protocole est de visualiser efficacement les profils d'expression spatiale des gènes individuels dans des montages entiers d'embryons et de larves du gastéropode d'eau douce Lymnaea stagnalis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'Évo-Dévo et de la biologie du développement, telles que l'endroit et le moment où les gènes sont exprimés, comment ils interagissent entre eux et quelles pourraient être leurs fonctions prédéterminées. Le principal avantage de cette technique est que le retrait du matériel embryonnaire et larvaire de leurs capsules œuf est rapide, simple et efficace.Ce matériel est ensuite classé selon une feuille de route du développement que nous fournissons dans les matériaux supplémentaires, puis traité selon des étapes pré-hybridation spécifiques à chaque stade. Pour commencer cette procédure, reliez une seringue jetable de 20 millilitres à un tube en silicone. Ensuite, fixez au ruban adhésif une lame de microscope standard sur une grande boîte de Petri inversée.Ensuite, fixez au ruban le tube en silicone immédiatement à côté de la lame de microscope. Puis, placez une aiguille en verre étirée sur la lame de microscope. Insérez-la délicatement dans le tube en silicone jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille dépasse d'environ 20 % du diamètre intérieur du tube.Une fois que l'aiguille est en position, fixez-la avec du ruban adhésif sur la boîte de Pétri. Laissez l'extrémité libre du tube en silicone reposer dans une autre boîte de Pétri qui recueillera le matériel décapsulé. Pour recueillir les souches d'œufs sur les parois d'un aquarium, utilisez un morceau de plastique plat et souple comme spatule afin de gratter la souche d'œufs du substrat.Et utilisez une passoire à thé en plastique pour récupérer la souche d'œufs flottant dans l'eau. Ensuite, mettez en scène et trie le matériel au microscope selon ce guide. Placez la souche d'œufs sur une serviette en papier et effectuez une incision longitudinale le long de la masse d'œufs à l’aide de la pince ultra-légère.Ensuite, faites rouler les capsules œuf hors de la gaine œuf et retirez autant que possible le matériau gélatineux de chaque capsule en le déplaçant sur la serviette en papier. Puis, à l’aide de la pince très légère, transférez les capsules œuf dans une boîte de Pétri contenant 5 millilitres d’eau du robinet. Continuez à recueillir dans ce récipient les capsules œuf débarrassées de leur gelée aux stades de développement souhaités.Collectez suffisamment de capsules à tous les stades de développement prévus pour l'expérience de WMISH avant de passer à l'étape suivante. Détendez maintenant les larves âgées de plus de cinq jours après le premier clivage dans une solution à 2 % poids sur volume de chlorure de magnésium hexahydraté pendant 30 minutes avant la fixation. Après 30 minutes, évaluez le degré de détente en immergeant plusieurs larves encore dans leurs capsules d'œufs et dans la solution fixative, puis surveillez leur réponse au microscope.Les larves partiellement détendues se rétracteront dans leurs coquilles. En revanche, les larves complètement détendues ne réagiront pas. Une fois que ces larves ont été détendues, transférez les capsules œuf à l’aide d’une pipette en plastique à large orifice dans un tube scellable offrant un volume dix fois supérieur à celui des capsules œuf.Ensuite, aspirez autant de liquide que possible du tube et remplacez-le par la solution de fixatif, dont le volume est 10 fois supérieur à celui des capsules œufs sédimentées. Faites tourner doucement les capsules œufs dans le fixatif à température ambiante pendant la durée appropriée pour chaque stade de développement. Puis, arrêtez la rotation et laissez les capsules sédimenter.Aspirez la solution de fixateur dans un contenant à déchets approprié. Lavez les capsules œuf en remplaçant la solution de fixateur par du PBTw, puis en les faisant tourner à température ambiante pendant cinq minutes.Aspirez le PBTw et lavez deux fois supplémentaires. Ensuite, retirez les embryons et les larves de leurs capsules à l’aide de l’appareil. Introduisez les capsules dans une seringue de 20 millilitres.Ensuite, fixez la seringue au tube. Expulser les capsules à travers le tube et l'aiguille en verre vers le plat de collecte. Par la suite, recueillir les embryons et les larves décapsulés dans un tube de 1,5 millilitre à l’aide d’une micropipette.Ensuite, soit déshydrater et conserver le matériel fixé, soit effectuer les étapes de protéinase K, de TEA et de post-fixation. Une fois ces étapes terminées, pré-hybridater brièvement le matériel et ajouter les riboprobes. L'importance d'un traitement adéquat par la protéinase K pour les résultats finaux d'une expérience d'hybridation in situ est primordiale chez Lymnaea stagnalis.Cela se traduit par une large gamme de concentrations de Pro K requises selon les stades de développement, allant de 0 à 500 microgrammes par millilitre. Pendant l'hybridation, retirez un seul tube du bloc chauffant. Faites-le tourner rapidement entre le pouce et l'index pour mettre en suspension les larves sans perturber la phase huileuse, puis remettez-le dans le bloc chauffant.Répétez cette procédure toutes les six à douze heures. Les profils d'expression génique présentés ici ont été obtenus à l'aide de larves provenant de divers stades de développement. Tous les échantillons ont été montés et observés dans le milieu de Murray.Les âges approximatifs sont indiqués en haut à droite de chaque image. L'orientation de la vue est indiquée en bas à droite, et l'orthologie des gènes est indiquée en bas à gauche. Ces résultats illustrent les profils d'expression de gènes impliqués dans divers processus moléculaires, allant de la formation de la coquille à la transcription et à la signalisation cellule à cellule.Dans tous les cas, un motif de coloration cellulaire unique et net est visible, et les résultats sont très cohérents entre les larves individuelles au sein d'une même expérience, ainsi que très reproductibles d'une expérience à l'autre. Une fois maîtrisée, la durée totale de manipulation de cette technique nécessite moins de deux jours. La majeure partie du temps est consacrée à la collecte et à la préparation du matériel embryonnaire et larvaire pour l'hybridation, ainsi qu'à l'acquisition des images des résultats.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que chaque riboprobe nécessitera probablement des ajustements subtils de paramètres importants tels que la température d'hybridation, la concentration de la sonde et la durée d'hybridation. Après son développement, cette technique nous a permis de caractériser de manière assez précise un ensemble de gènes impliqués dans la formation de la coquille, identifiés lors d'écrans transcriptomiques et protéomiques antérieurs.

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