Étude de la fonction de Coronin A dans la réponse Starvation précoce de

Le but global de cette procédure expérimentale est d'étudier la réponse précoce à la privation de nutriments dépendante de la Coronine-A chez Dictyostelium discoideum. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que l'identification des voies de signalisation et des facteurs impliqués dans le développement précoce de Dictyostelium discoideum. Le principal avantage de cette technique réside dans son potentiel à fournir un outil pour le criblage automatisé et à haut débit de facteurs inducteurs du développement et de protéines impliquées dans la signalisation du développement précoce.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison des multiples variables inhérentes au test, telles que les densités cellulaires, le temps d'adhérence et le temps de développement. Pour commencer cette procédure, cultiver les cellules DH1.10 ou les cellules déficientes en corA dans un flacon Erlenmeyer contenant du milieu HL-5, à 22 degrés Celsius, dans un incubateur agité à 160 tr/min. Maintenir les cellules à une densité comprise entre 1 × 10⁴ et 2 × 10⁶ cellules par millilitre.

Pour examiner l'agrégation cellulaire, récolter 10 à 50 millilitres de cellules DH1.10 en phase logarithmique de croissance ou de cellules déficientes en corA générées sur fond DH1.10. Centrifuger les cellules pendant trois minutes à 400 ×g. Puis laver les cellules deux fois dans du BSS.

Ensuite, comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Ensuite, semez les cellules dans une plaque de 24 puits. Laissez-les adhérer pendant une heure à 22 degrés Celsius dans du BSS.

Ensuite, visualisez l'agrégation cellulaire par microscopie en temps réel et prenez des images toutes les 135 secondes. Pour examiner l'effet des impulsions de cyclique AMP appliquées extérieurement sur le développement des cellules DH1.10 ou des cellules déficientes en corA de DH1.10, récoltez 10 à 50 millilitres de cellules et centrifugez-les pendant trois minutes à 400 ×g. Par la suite, lavez-les deux fois dans du BSS.

Compter les cellules à l'aide d'un hématimètre. Ensuite, resuspendre les cellules à une densité de 1 × 10⁷ cellules par millilitre dans du BSS. Puis, agiter les cultures à 22 °C pendant deux heures à 160 tr/min avant d'appliquer les impulsions.

Ensuite, appliquez des impulsions d'AMP cyclique à l'aide d'une pompe péristaltique contrôlée par un minuteur. Programmez la pompe pour délivrer une impulsion de cinq secondes d'AMP cyclique toutes les six minutes et demie, pendant une période de cinq heures. Une étape cruciale consiste à s'assurer que l'extrémité de l'injection d'AMP cyclique ne soit pas continuellement immergée dans la solution, mais seulement immergée périodiquement dans les ondes générées par l'agitateuse.

Après l'application de l'AMP cyclique, recompter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Ensuite, ensemencer les cellules dans une plaque de 24 puits et les laisser adhérer pendant une heure dans du BSS. Après 16 heures, visualiser l'agrégation cellulaire à 22 degrés Celsius, en microscopie à contraste de phase avec un objectif 5 x.

Dans cette procédure, préparez un milieu conditionné frais en collectant les cellules en phase logarithmique DH1.10 ou les cellules déficientes en corA DH1.10 à partir de cultures agitées dans du milieu HL5, à 22 degrés Celsius. Centrifugez les cellules pendant trois minutes à 400 × g. Ensuite, lavez-les trois fois dans du PBM.

Ensuite, comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre, puis resuspendez-les dans du milieu PBM à une densité de 1 × 10⁷ cellules par millilitre et agitez-les pendant 20 heures à 22 °C à 110 tr/min. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 × g pendant trois minutes, puis récupérez le milieu conditionné. Par la suite, clarifiez le milieu par centrifugation à 8 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.

Ensuite, filtrez le milieu conditionné à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre et diluez-le au tiers dans du PBM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémosytomètre, ensemencez-les dans une plaque de 24 puits et laissez-les adhérer pendant une heure à 22 degrés Celsius. Ensuite, remplacez le surnageant des cellules par un milieu conditionné préalablement préparé.

Après 16 heures, visualisez l'agrégation cellulaire en microscopie à contraste de phase en utilisant un objectif de cinq x. Ici, les cellules déficientes en Coronin-A présentent un défaut au stade précoce du développement et sont incapables de former des agrégats pluricellulaires, qui constituent la première étape du cycle développemental de Dictyostelium discoideum. Sur cette image, les cellules de type sauvage végétatives et les cellules déficientes en corA ont été lavées et privées de nutriments pendant deux heures avant d'être pulsed, ou non, avec 15 animal ou de l'AMP cyclique toutes les six minutes et demie pendant cinq heures en suspension.

L'application de pulses exogènes d'AMP cyclique a entièrement restauré le phénotype de type sauvage. Dans cette figure, des cellules de type sauvage et des cellules déficientes en corA, en croissance exponentielle, ont été lavées dans du PBM, semées dans des plaques multi-puits et incubées dans un milieu conditionné obtenu à partir de cellules de type sauvage ou de cellules déficientes en corA en état de privation. Les images ont été prises 16 heures après le semis des cellules.

Dictyostelium discoideum déficient en corA étaient capables de produire tous les facteurs nécessaires à l'induction du développement, mais incapables d'y répondre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 heures, temps d'incubation inclus, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que, pour différentes souches, un ajustement de plusieurs variables du test, telles que les densités cellulaires, le temps d'adhérence et le temps de développement, sera nécessaire.

Après avoir suivi cette procédure, une fractionnement biochimique et une analyse protéomique ultérieure peuvent être réalisés afin d'identifier les facteurs impliqués dans la réponse précoce à la privation de nutriments chez Dictyostelium discoideum. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la manière d'induire le développement précoce de Dictyostelium discoideum en conditions submergées, en utilisant soit des milieux conditionnés, soit des impulsions d'AMP cyclique.