Étude de la fonction de Coronin A dans la réponse Starvation précoce de Dictyostelium discoideum Par agrégation Assays

L’objectif global de cette procédure expérimentale est d’étudier la réponse de famine précoce de Dictyostelium discoideum dépendante de Coronin-A. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que l’identification des voies de signalisation et des facteurs impliqués dans le développement précoce de Dictyostelium discoideum. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a le potentiel de fournir un outil de criblage automatisé et à haut débit des facteurs inducteurs de développement et des protéines impliquées dans la signalisation précoce du développement.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de multiples variables inhérentes au test, telles que les densités cellulaires, le temps d’adhésion et le temps de développement. Pour commencer cette procédure, cultivez des cellules DH1.10 ou des cellules déficientes en corA dans un erlenmeyer contenant du milieu HL-5, à 22 degrés Celsius, dans un incubateur à agitation à 160 tr/min. Gardez les cellules à une densité comprise entre 1 fois 10 pour quatre et deux fois 10 pour six cellules par millilitre.

Pour examiner l’agrégation cellulaire, récoltez 10 à 50 millilitres de cellules DH1.10 en croissance en phase logarithmique ou de cellules déficientes en corA générées dans le fond DH1.10. Centrifugez-les pendant trois minutes à 400 fois g. Ensuite, les cellules ont été placées deux fois dans le BSS.

Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Par la suite, plaquez les cellules dans une plaque à 24 puits. Laissez-les adhérer pendant une heure à 22 degrés Celsius en BSS.

Ensuite, visualisez l’agrégation de cellules avec la microscopie time-lapse et prenez des images toutes les 135 secondes. Pour examiner l’effet des impulsions cycliques AMP appliquées à l’extérieur sur le développement des cellules DH1.10 ou des cellules DH1.10 déficientes en corA, prélevez 10 à 50 millilitres de cellules et centrifugez-les pendant trois minutes à 400 fois g. Après cela, lavez-les deux fois dans BSS.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Par la suite, remettre les cellules en suspension à une densité de un fois 10 à sept cellules par millilitre dans le BSS. Ensuite, secouez les cultures à 22 degrés Celsius pendant deux heures à 160 tr/min avant d’appliquer des impulsions.

Ensuite, appliquez des impulsions cycliques AMP à l’aide d’une pompe péristaltique contrôlée par minuterie. Programmez la pompe pour qu’elle délivre une impulsion de cinq secondes d’AMP cyclique toutes les six minutes et demie sur une période de cinq heures. Une étape critique consiste à s’assurer que l’extrémité de l’injection cyclique de l’AMP n’est pas continuellement immergée dans la solution, mais seulement submergée périodiquement dans les ondes générées par l’agitateur.

Après l’application de l’AMP cyclique, comptez à nouveau les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, plaquez les cellules dans une plaque à 24 puits et laissez-les adhérer pendant une heure dans BSS. Après 16 heures, visualisez l’agrégation cellulaire à 22 degrés Celsius, avec une microscopie à fond clair utilisant un subjectif cinq x.

Dans cette procédure, préparez un milieu fraîchement conditionné, en prélevant des cellules DH1.10 en phase logarithmique ou des cellules déficientes en corA DH1.10 à partir des cultures agitées avec un milieu HL5, à 22 degrés Celsius. Centrifugez les cellules pendant trois minutes à 400 fois g. Après cela, lavez-les trois fois avec du PBM.

Par la suite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis mettez-les en suspension dans du PBM à une densité de un fois 10 à sept cellules par millilitre et secouez-les pendant 20 heures à 22 degrés Celsius à 110 tr/min. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 fois g pendant trois minutes, puis collectez le milieu conditionné. Ensuite, clarifiez le milieu par centrifugation à 8 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, filtrez le milieu conditionné à travers un filtre de 0,45 micromètre et diluez-le trois fois dans du PBM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, placez-les dans une plaque à 24 puits et laissez-les adhérer pendant une heure à 22 degrés Celsius. Ensuite, remplacez le surnageant des cellules par un milieu conditionné préalablement préparé.

Après 16 heures, visualisez l’agrégation cellulaire avec la microscopie à champ clair en utilisant une analyse subjective cinq x. Ici, les cellules déficientes en Coronin-A présentent un défaut de développement précoce et ont été incapables de former des agrégats multicellulaires, ce qui est la première étape du cycle de développement de Dictyostelium discoideum. Dans cette figure, les cellules végétatives de type Wild et déficientes en corA ont été lavées et affamées pendant deux heures avant d’être pulsées avec, ou sans, 15 AMP animales ou cycliques, toutes les six minutes et demie pendant cinq heures en suspension.

L’application d’impulsions cycliques exogènes AMP a entièrement restauré le phénotype de type Wild. Dans cette figure, des cellules de type Wild à croissance exponentielle et déficientes en corA ont été lavées dans du PBM, ensemencées dans des plaques multi-puits et incubées dans un milieu conditionné obtenu à partir de cellules de type Wild ou de cellules affamées déficientes en corA. Les images ont été prises 16 heures après l’ensemencement des cellules.

Dictyostelium discoideum, déficient en corA, ont été capables de produire tous les facteurs nécessaires à l’induction du développement, mais n’ont pas été en mesure d’y répondre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 heures, temps d’incubation compris, si elle est bien réalisée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que pour différentes souches, un ajustement de plusieurs variables du test, telles que les densités cellulaires, le temps d’adhésion, le temps de développement, sera nécessaire.

À la suite de cette procédure, un fractionnement biochimique et une analyse protéomique ultérieure peuvent être effectués afin d’identifier les facteurs impliqués dans la réponse précoce de famine de Dictyostelium discoideum. Après avoir regardé cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la façon d’induire un développement précoce chez Dictyostelium discoideum dans des conditions submergées, en utilisant soit des milieux conditionnés, soit des impulsions cycliques AMP.