Combinant Double Fluorescence In Situ Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l'expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

L’objectif global de cette expérience est de détecter simultanément l’expression de trois gènes différents dans des coupes de cerveau, en utilisant une hybridation in situ à double fluorescence suivie d’une immunomarquage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que quel type de cellule exprime mon gène d’intérêt ? Le principal avantage de cette technique est que vous n’avez pas besoin d’un bon anticorps pour que votre gène d’intérêt puisse localiser son expression dans un type de cellule spécifique.

Pour résumer cette procédure, le premier jour, des coupes de tissu fixe sont coupées et hybridées avec deux sondes d’ARN étiquetées différemment pendant la nuit. Le deuxième jour, les sections sont incubées pendant la nuit avec un anticorps ciblant la sonde marquée FITC. Cet anticorps est conjugué à la peroxydase de raifort, qui catalyse l’ajout d’un tyramide fluorescent le troisième jour.

Ensuite, un anticorps conjugué à la phosphatase alcaline est utilisé pour cibler la sonde marquée au DIG. Le quatrième jour, cette enzyme catalyse la formation de précipités fluorescents lorsqu’elle est incubée avec la solution Fast Red. Ensuite, les sections sont incubées pendant la nuit avec un anticorps primaire ciblant une protéine d’intérêt.

Enfin, le cinquième jour, cette protéine est visualisée avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore. Pour commencer cette procédure, choisissez un clone d’ADN qui contient la séquence d’ADNc du gène d’intérêt dans un plasmide avec des promoteurs de l’ARN polymérase. Ensuite, cultivez le clone d’ADN, extrayez le plasmide avec un kit de purification de plasmide à petite échelle et séquencez-le avec des amorces universelles T7 et SP6.

Digérez 10 à 20 microgrammes d’ADN plasmidique avec une enzyme de restriction qui coupe à l’extrémité cinq premières du brin sens de l’ADNc. Incuber pendant 1,5 heure à 37 degrés Celsius. Exécutez ensuite une petite aliquote sur un gel d’agarose pour vérifier que le plasmide est bien linéarisé.

Pour purifier le plasmide linéarisé, ajoutez 1/10 du volume de trois molaires d’acétate de sodium, un volume de 10 millimolaires de phénol équilibré Tris-HCl et un volume d’alcool isoamylique de chloroforme. Centrifuger à 16 000 Gs pendant une minute à température ambiante, et extraire la phase aqueuse supérieure. Ajoutez ensuite un volume de chloroforme IAA.

Centrifugez-le à 16 000 Gs pendant une minute, et extrayez la phase aqueuse supérieure. Répétez cette étape une fois de plus. Ensuite, ajoutez deux volumes d’éthanol et maintenez-le à moins 20 degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit.

Après cela, centrifugez à 16 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec de l’éthanol froid à 70 %. Ensuite, mettez-le en suspension dans TE à une concentration d’un microgramme d’ADNc par 2,5 microlitres.

Pour synthétiser les deux sondes, il faut d’abord sélectionner l’ARN polymérase appropriée. Ensuite, préparez la réaction de transcription in vitro et portez le volume final à 20 microlitres avec de l’eau traitée au DEPC. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.

Par la suite, exécutez un microlitre de la réaction de transcription sur un gel d’agarose à 1 % pour vérifier si la réaction a fonctionné. Le gel doit montrer le modèle linéaire et une bande brillante de la sonde. Dans cette procédure, coupez des sections de tissu congelé de 15 micromètres d’épaisseur dans un cryostat.

Rassemblez les sections sur les lames de microscope et laissez sécher les lames pendant une heure pour vous assurer que les tissus adhèrent aux lames. Le facteur le plus important pour que cette procédure fonctionne bien est la qualité des sections. Cela dépend en partie d’un tissu bien irrigué et fixé, et en partie de la technique de sectionnage pour obtenir des sections plates exemptes de contamination par la RNase.

Ensuite, diluez les deux sondes dans un tampon d’hybridation préchauffé à 65 degrés Celsius, et mélangez bien. Appliquez 300 microlitres de mélange d’hybridation sur chaque lame et recouvrez d’une lamelle cuite au four. Par la suite, incubez les lames pendant la nuit à 65 degrés Celsius dans une chambre humidifiée.

Le lendemain, transférez les lames dans un bocal Coplin contenant un tampon de lavage préchauffé et lavez les lames pendant 30 minutes, deux fois, à 65 degrés Celsius. Après cela, lavez les lames pendant 10 minutes trois fois avec la solution de lavage MABT à température ambiante. Dans cette étape, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des sections de tissus.

Ensuite, incubez les lames pendant une heure à température ambiante avec un tampon de blocage ISH dans une chambre humidifiée. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps anti-fitc conjugué au raifort peroxydé. Ensuite, placez les lames dans un bocal coplin contenant du PBST.

Lavez-les trois fois au PBST pendant 10 minutes à chaque fois, et remplacez-les par du PBST frais à chaque fois. Ensuite, ajoutez du tiromide fluorescent aux lames et laissez-les pendant 10 minutes à température ambiante. Placez les lames dans un bocal coplin et lavez-les au PBST pendant 10 minutes trois fois.

Par la suite, incubez les lames avec un tampon de blocage ISH pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps anti-dig conjugué à la phosphatase alcaline. Après cela, lavez-les avec MABT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec 0,1 molaire de tris HCL à pH 8,2 pendant cinq minutes à température ambiante. Filtrez la solution rouge rapide et incubez les lames à 37 degrés Celsius avec une solution rouge rapide dans une chambre humidifiée. Comme le temps de développement optimal varie, vérifiez régulièrement les lames avec un microscope fluorescent pour surveiller la formation de précipité.

Ensuite, lavez-les trois fois avec du PBST pendant 10 minutes à chaque fois. Pour effectuer une immunohistochimie, incubez les lames avec un tampon bloquant l’IHC pendant une heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. Ensuite, incubez les lames dans la solution d’anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, lavez les lames avec du PBST pendant 10 minutes trois fois. Incuber-les dans la solution d’anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure. Ensuite, lavez-les avec du PBST trois fois pendant 10 minutes à chaque fois.

Ensuite, séchez partiellement les lames à température ambiante et montez-les avec un milieu de montage à fluorescence. Laissez sécher les lames avant de les imager au microscope confocal. Voici les images représentatives de l’ISH pour Aspa et Mbp, suivies d’une immuno-coloration pour OLIG2 combinée à une coloration en crochet.

Aspa a été exprimé dans certaines cellules OLIG2 positives MBP dans le cortex et dans le corps calleux. Certaines cellules positives à l’OLIG2 positives pour Mbp n’expriment pas Aspa. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les tranches et toutes les solutions exemptes de contamination par la RNase.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les modèles d’expression génique par l’inhibition de la N-citrine et l’immunohistochimie. Cette technique peut être adaptée à une variété de tissus d’origines et de stades de développement différents.