Évaluation simultanée de cardiomyocytes synthèse de l'ADN et Ploïdie: Une méthode pour aider Quantification de cardiomyocytes Régénération et Chiffre d'affaires

L’objectif global de ce protocole est de quantifier le renouvellement des cardiomyocytes à l’aide du marquage nucléoside à long terme et de la cytométrie en flux pour quantifier les noyaux des néo-cardiomyocytes tout en tenant compte de la polyploïdisation des noyaux. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération des cardiomyocytes et elle peut être utilisée comme outil de dépistage pour quantifier les changements dans la dynamique de la génération des cardiomyocytes. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet une quantification sensible et précise de la génération de néo-cardiomyocytes, quelle que soit la source cellulaire et en contrôlant la polyploïdation.

24 heures après la sixième injection d’EdU, placez l’animal traité en position couchée et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision cutanée du milieu de l’abdomen au diaphragme. Ensuite, en tenant le sternum loin de la cavité corporelle, coupez bilatéralement le diaphragme pour exposer le cœur. Ensuite, soulevez légèrement le cœur et coupez les principaux vaisseaux sanguins de la voie d’éjection pour disséquer le cœur de la cavité thoracique.

Immédiatement après la récolte, placez les cœurs dans des tubes à centrifuger individuels de 15 ml contenant 10 ml de PBS refroidis à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez les échantillons dans des boîtes de Pétri individuelles de 10 cm et utilisez un scalpel pour couper chaque cœur en deux morceaux dans une orientation sagittale. Ensuite, pressez doucement les morceaux de cœur avec une paire de pinces.

Retirez les deux morceaux de cœur et placez-les dans une boîte de Pétri contenant 20 ml de PBS frais. Répétez l’opération avec une nouvelle boîte de Pétri et 20 ml de PBS frais. Placez les deux parties des cœurs dans le même tube de microcentrifugation de 1,5 ml et utilisez une aiguille de calibre 25 pour faire un petit trou dans le couvercle de chaque tube afin d’empêcher le couvercle de s’ouvrir lorsque le cœur a été traité.

Ensuite, étiquetez chaque tube et congelez les tissus cardiaques dans un récipient d’azote liquide. Pour chaque cœur à analyser, incubez 36 ml de 1 % de BSA et de PBS dans un tube ultra-centrifuge. Jetez la solution après 30 minutes.

Lorsque les tubes ont séché à l’air, ajoutez 10 ml de solution de gradient de saccharose dans chaque tube. Après avoir haché individuellement les échantillons de cœur congelés à l’azote liquide avec le scalpel, transférez les fragments de tissu de chaque cœur dans des tubes coniques individuels de 50 ml contenant 15 ml de tampon de lyse cellulaire. Homogénéisez les échantillons pendant 15 secondes à 25 000 tr/min à l’aide d’un homogénéisateur à sonde à température ambiante.

Ajoutez ensuite 15 ml de tampon de lyse dans chaque tube et transférez les échantillons un à la fois dans une dose de 40 ml avec un grand pilon de dégagement. Effectuez 10 coups avec le pilon et filtrez les boues cellulaires à travers une passoire de 100 microns suivie d’une crépine de 40 microns dans des tubes à centrifuger individuels de 50 ml. Ensuite, recueillir les culots cardiaques nucléaires par centrifugation et remettre les cellules en suspension dans 25 mL de solution de gradient de saccharose chacune.

Superposez les cellules sur le gradient de saccharose libre des noyaux dans les tubes ultra-centrifugeux préparés et centrifugez les couches à l’aide d’un rotor tubulaire pivotant. Après la centrifugation, remettre les granules de noyaux en suspension dans 1 300 microlitres de tampon de stockage de noyaux et transférer les noyaux dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL étiqueté PCM1. Transférez 300 microlitres de chaque suspension des tubes PCM1 dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajoutez 700 microlitres de tampon de stockage de noyaux frais et étiquetez le contrôle ISO.

Ensuite, étiquetez les noyaux PCM1 avec un anticorps anti-PCM1 et les noyaux de contrôle ISO avec un anticorps de contrôle rapide de l’isotype IGG pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, faites tourner les échantillons et remettez les pastilles en suspension dans un mL de tampon de stockage de noyaux frais pour une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions. Après le deuxième essai, remettre les pastilles en suspension dans un mL de tampon de stockage de noyaux frais et incuber les noyaux avec un microlitre d’un fragment F(ab'2 conjugué d’un anticorps IGG anti-rage de chèvre pendant une heure à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.

Pour évaluer le degré d’incorporation d’EdU, centrifuger les suspensions de noyaux marqués par le PCM1 et l’ISO et remettre les pastilles en suspension dans un mL de PBS à 1 % deux fois pendant deux lavages consécutifs. Après le deuxième lavage, remplacez le surnageant par 100 microlitres de fixateur EdU et incubez les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. À la fin de la fixation, laver les noyaux deux fois de plus dans un mL de PBS BSA, puis incuber les échantillons avec 100 microlitres de solution de perméablation à base de saponine à température ambiante.

Après 15 minutes, ajoutez 500 microlitres de cocktail d’étiquetage EdU fraîchement préparé dans chaque tube pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, faites tourner les échantillons trois fois en lavant les noyaux dans un mL de PBS BSA lors des deux secondes centrifugations. Enfin, étiquetez les échantillons avec 400 microlitres de solution de coloration de l’ADN.

L’analyse immunohistologique des cœurs pulsés met en évidence la présence de cardiomyocytes exprimant PCM1 qui ont incorporé EdU. Cependant, les données obtenues à l’aide de méthodes immunohistologiques peuvent être mal interprétées, car d’autres types de cellules qui ont incorporé EdU peuvent être identifiés à tort comme des cardiomyocytes. Dans une étude portant sur des souris mdx et témoins, l’analyse par cytométrie en flux détaillée dans ce protocole permet une quantification rapide de la génération nucléaire de néo-cardiomyocytes tout en excluant les cellules qui ont incorporé EdU à la dépolyploïdisation.

À l’instar des données publiées précédemment, dans cette expérience représentative, une augmentation des taux de génération de noyaux de néo-cardiomyocytes dans les cœurs de souris mdx par rapport aux témoins appariés selon l’âge a été observée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures sur l’espace de deux jours. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler à la fois les commandes négatives EdU et PCM1 afin que les portes puissent être réglées avec précision pendant l’analyse.

Cette technique est également compatible avec un certain nombre de techniques immunohistologiques supplémentaires en aval permettant de quantifier l’incorporation de nucléocytes dans un certain nombre de types de cellules cardiaques différents. Cette technique a été utilisée dans le domaine de la recherche cardiovasculaire pour étudier les changements dans la régénération des cardiomyocytes dans le modèle mdx de la cardiomyopathie non ischémique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier rapidement les noyaux de néo-cardiomyocytes, regardez le décompte de la polyploïdation pour dépister les changements dans la régénération et le renouvellement des cardiomyocytes.