Foraging Protocole Chemin de longueur pour Drosophila melanogaster larves

L’objectif global de ce test est de quantifier la composante locomotrice du comportement larvaire de la drosophile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique du comportement sur les contributions génétiques et environnementales aux différences individuelles dans le comportement larvaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, reproductible et qu’elle permet de collecter des échantillons de grande taille.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés parce que le succès du test dépend du moment du développement et de la manipulation cohérente et prudente des animaux de test. Ina Anreiter et Oscar Vasquez, étudiants diplômés dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Préparez la bouteille de maintien en découpant des trous dans un côté d’une bouteille de culture de mouches en plastique de six onces.

Ensuite, utilisez une seringue pour remplir les couvercles de la boîte de Pétri avec du jus de raisin préalablement préparé jusqu’à ce que la surface du jus de raisin forme un dôme au-dessus du rebord du couvercle. Conservez les assiettes de raisin dans un récipient humide et hermétique à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Versez 40 millilitres de nourriture pour mouches préalablement préparée dans des boîtes de Pétri de 100 x 15 millimètres.

Procurez-vous trois plaques de plexiglas noir avec dix puits circulaires de dix centimètres de diamètre et disposés en deux par cinq pour tester les larves, et un épandeur de plexiglas noir utilisé pour étaler la pâte de levure sur les plaques de plexiglas. Ensuite, séparez les couvercles du fond des boîtes de Pétri. Prélever 100 à 150 femelles et 50 à 75 mâles.

Laissez les femelles et les mâles s’accoupler pendant la nuit dans une bouteille de culture de mouches de six onces avec de la nourriture standard pour mouches. Transférez les mouches dans une bouteille de maintien et utilisez du ruban adhésif pour fixer une plaque de raisin avec une petite quantité de pâte de levure fraîche sur le dessus de la bouteille. Laissez la bouteille à l’envers avec l’assiette à raisin au fond pour permettre aux adultes de pondre des œufs sur l’assiette à raisin.

Jetez la première assiette de raisin après 24 heures et placez une nouvelle assiette de raisin dans la bouteille de maintien. Après 22 heures, retirez les assiettes de raisin des bouteilles et placez-les dans une boîte de Pétri de 60 x 15 millimètres. Ensuite, placez une nouvelle assiette de raisin avec de la pâte de levure fraîche sur la bouteille de maintien.

Dégagez et jetez toutes les larves de la plaque de raisin épépinée à l’aide d’une sonde de dissection. Incuber les assiettes de raisin nettoyées pendant quatre heures dans des conditions standard. Après quatre heures, prélevez 100 larves de L1, ou premier stade, par souche dans les assiettes de raisin et placez-les sur les assiettes de nourriture.

Placez les larves sur la nourriture doucement, sans perforer la nourriture et sans enterrer les larves. Des groupes de dix larves peuvent être cueillis et placés à la fois. Évitez l’encombrement en répartissant les larves dans l’assiette de nourriture.

Incuber les assiettes de nourriture jusqu’à ce que les animaux d’essai soient dix heures avant le début de l’errance, lorsque les larves quittent la nourriture à la recherche d’un site de nymphose. Si les larves ont commencé à errer et qu’elles se déplacent sur le couvercle de la boîte de Pétri, comme vous pouvez le voir ici, les animaux sont trop vieux pour être testés et leur temps de développement doit être réévalué. Dissoudre la levure dans l’eau dans un rapport de un à deux.

Assurez-vous que la pâte finie s’égoutte et laisse des rubans à la surface de la pâte qui fondent rapidement. Il est plus important d’évaluer la bonne consistance de la pâte de levure que d’utiliser le rapport exact en raison de la variabilité entre les marques, les lots de levure et l’environnement. À l’aide d’un pinceau, retirez délicatement les larves de l’assiette de nourriture de la première souche.

Recueillez les larves dans une boîte de Pétri et lavez-les doucement avec de l’eau pour enlever toute la nourriture. Lavez rapidement les larves avec deux millilitres d’eau et séchez-les doucement avec une lingette de laboratoire. Gardez les larves dans un environnement humide, mais pas immergées dans l’eau pour éviter le stress.

Disposez trois plaques d’essai côte à côte et réglez une minuterie de cinq minutes pour chaque plaque d’essai. Appliquez de la pâte de levure sur le dessus des plaques de test et utilisez l’écarteur pour répartir une fine couche de pâte de levure sur chaque plaque de test afin que tous les puits aient une couche uniforme de levure. Placez délicatement une larve au centre de chaque puits.

Démarrez le minuteur de cinq minutes immédiatement après avoir placé les premières larves sur chaque plaque. Placez ensuite le reste des larves dans les puits restants. Placez un couvercle de boîte de Pétri sur chaque puits.

Lorsque le temps est écoulé, commencez à tracer les longueurs de chemin laissées dans la levure à l’aide d’un marqueur permanent sans retirer les larves de la plaque. Des traces de longueurs de chemin dans le même ordre et à la même vitesse que les larves ont été placées sur les plaques. Enfin, répétez les étapes du test de longueur du trajet larvaire pour chaque souche.

Les données recueillies au cours de trois jours consécutifs de tests ont révélé un effet de tension significatif, les rovers se déplaçant plus loin que les personnes assises. En plus de l’effet de tension, les larves qui ont été privées de nourriture pendant quatre heures avant l’essai avaient des longueurs de trajet significativement plus courtes que les larves nourries. Dans l’ensemble, les trajets étaient plus longs lorsque les deux souches étaient élevées avec des aliments riches en nutriments par rapport à des aliments pauvres en nutriments.

S’il est effectué correctement, ce test permet à une seule personne de tester facilement jusqu’à 500 larves en quatre heures, ce qui le rend précieux pour le phénotypage à grande échelle. En suivant la procédure que nous venons de montrer, d’autres variables telles que le sexe, la privation de nourriture ou la qualité des aliments peuvent être testées pour montrer l’effet de ces variables sur les mouvements liés aux aliments. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la locomotion liée à la nourriture des larves de drosophile pour l’évaluation des contributions génétiques et environnementales aux différences individuelles de comportement.