Name: Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Apprenez à isoler des cellules endothéliales coronaires de souris pour la recherche cardiovasculaire. Cette méthode utilise un tampon CD31 et des billes IGG pour obtenir une grande quantité de cellules purifiées de haute qualité.

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Ce travail a été soutenu par la subvention du National Institutes of Health (HL115578 à A. Makino).

La recherche sur des souris a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de l&#39;Arizona et a été réalisée selon l&#39;Institut national de la santé (NIH) des lignes directrices. NOTE: Les articles 1, 2 et 3 doivent être effectuées la veille de l&#39;expérience que l&#39;installation. 1. Solutions Préparation <ol><li> un tampon de CD31 (50 ml) <ol><li> Ajouter 50 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS) à un tube de 50 ml. Peser 0,05 g de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,037 g d&#39;acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et les ajouter au tube de 50 ml et mettre le tube en rotation pendant environ 1 h jusqu&#39;à dissolution de la poudre. Ajuster le pH à 7,4, filtrer à travers un filtre de 0,2 um dans un nouveau tube de 50 ml, et stocker à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du HEPES (500 ml) <ol><li> Ajouter 1.1915 g de HEPES faire 10 HEPES mM dans une solution HBSS et bien mélanger. Mesurer le pH et ajuster à 7,4. Filtrer et conserver à 4˚C. </li></ol></li><li> 1x solution de Kreb (1 L) <ol><li> Ajouter 100 ml de solution de 10 × Kreb [Table 1] pour doubler l&#39; eau distillée dans un ballon de 1 litre. Peser 2,1 g de bicarbonate de sodium et 2 g de D-glucose et ajouter au flacon. Mélanger et ajuster le volume total à 1 L. </li><li> Solution à bulles avec 95% O 2/5% CO 2 gazeux pendant 30 min et une solution de filtre à l&#39; intérieur du capot. Conserver à 4 ° C et garder sur la glace au cours de l&#39;expérience. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des billes magnétiques <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon de CD31 dans chaque tube de 1,5 ml (un tube par échantillon). Mélanger les moutons anti-rat perles de IgG et ajouter la quantité appropriée à chaque échantillon [Tableau 1]. Agiter les tubes vigoureusement 30 fois et les placer dans la plaque magnétique pendant 1 min d&#39;agitation. Ouvrez les tubes tandis que sur la plaque et vider les solutions dans un seau. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de CD31 dans chaque tube. Ajouter 2 ul Rat anti-souris CD31 anti-corps à chaque tube et tourner les tubes O / N à 4 ° C. </li></ol> 3. autoclavage <ol><li> Autoclave tous les outils de chirurgie et des embouts de pipette. Couper les extrémités des embouts de pipette de telle sorte que il y a des conseils avec 4 diamètres différents, de la plus large à la plus étroite. diamètres approximatifs pour les conseils sont de 3 mm, 2,5 mm, 2 mm et 1,5 mm respectivement. Couper les pointes et l&#39;autoclave la veille avec 30 min de la stérilisation à une température de 121 ° C. NOTE: Les articles 4-11 doivent être effectuées le jour de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Solutions Préparation <ol><li> Préparer un tampon de lavage contenant 2% Fer-Fortified sérum de veau (IFCS) dans M199. Pour l&#39;imagerie, préparer 30 ml / souris. </li><li> Préparer la solution enzymatique (10 ml / échantillon). Peser 0,6 unité / ml de dispase et 1 mg / ml de collagénase de type II dans un tube de 50 ml. Ajouter M199 et faire tourner le tube à 4 ° C pendant 15 min. Filtrer à travers filtre de 0,2 um dans un nouveau tube de 50 ml inside le capot et garder à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer HBSS / HEPES avec Héparine. Ajouter 10 ml de HBSS avec 10 mM de HEPES dans 15 ml tube. Ajouter 100 pi de Heparin au tube et maintenir à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 5. laver les perles <ol><li> Sortez les tubes avec des perles du rotateur à 4 ºC et porter à la hotte. Placer les tubes dans la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Dump de la solution et ajouter un tampon de CD31 1 ml dans chaque tube. </li><li> Prenez les tubes de la plaque magnétique et agiter vigoureusement 30 fois. Mettre les tubes de retour dans la plaque magnétique et répéter pour un total de 3 lavages. Après avoir terminé, mettre les tubes de retour à 4c et de garder la rotation jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 6. Dissection <ol><li> Injecter les souris par voie intrapéritonéale avec 0,1 ml d&#39;héparine pour empêcher la coagulation du sang. Attendre 10 minutes, puis anesthésier les souris en utilisant une injection intrapéritonéale de 0,01 ml de pentobarbital. Vérifiez si la souris se sentla douleur en pinçant le pied. </li><li> Placez la souris sur un panneau de polystyrène avec la tête et tenir les bras avec des épingles. Utilisez des pinces et difficiles-coupe-ciseaux pour couper la peau à la région thoracique supérieure jusqu&#39;à la gorge. </li><li> Faire une coupe dans le centre de la cage thoracique juste au-dessus du diaphragme. Couper l&#39;os sur le côté et vers le haut vers la gorge pour former un triangle d&#39;exposer le cœur et les poumons. Couper l&#39;aorte juste au-dessus du diaphragme. </li><li> Tenez le thymus avec une pince sans tirer et utiliser des ciseaux pour couper tout tissu conjonctif soigneusement pour éliminer les poumons et le cœur ensemble. Placer les tissus dans un bécher avec 1 × Kreb de, secouer avec une pince et transfert à boîte de 6 cm avec 1 x Kreb de. </li><li> Retirer les lobes du poumon à l&#39;aide de ciseaux et des pinces. Insérer un cathéter stérile 20 G dans l&#39;aorte. Rincer le sang dans le système circulatoire coronarien avec du HBSS / Héparine. Faire une petite incision dans le ventricule, secouer le cœur et transférer dans un tube de M199 de l&#39;échantillon. Garder les tubes sur la glace. </li></ol><p<html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. La digestion du tissu <ol><li> Transférer le coeur dans une boîte de 6 cm, rempli avec 10 ml de solution d&#39;enzyme et de hacher en petits morceaux avec des ciseaux. Placez les plats dans l&#39;incubateur à 37 ° C pendant 15 min. Agiter matériaux digérés par pipetage de haut en bas 30 fois à travers une pointe avec une extrémité coupée pour permettre au tissu de passer à travers plus facile. </li><li> Remettez-le dans le 37 ºC incubateur pendant 15 min. Répétez l&#39;agitation trois fois, chaque fois à l&#39;aide des embouts de pipette de plus grandes ouvertures les plus étroites et 15 minutes d&#39;incubation entre chaque. </li><li> Après la dernière 15 minutes d&#39;incubation, prélever des échantillons sur et dans la hotte. solution Pipet haut et en bas 30 fois en utilisant la pointe de la pipette avec l&#39;ouverture la plus étroite et passer à travers un tamis de 40 um de la cellule dans un nouveau tube de 50 ml. </li><li> Laver le plat avec un tampon de lavage de 10 ml en utilisant une pipette de 10 ml et transfert sur tamis cellulaire. Mettre les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et un essorage à 400 g pendant 10 min à température ambiante. </li></ol>itre &quot;&gt; 8. Lavage et Conjugaison avec des perles <ol><li> Retirer le surnageant sans perturber le culot. Laver deux fois les cellules avec du tampon de lavage 5 ml. </li><li> Obtenir un des préalablement préparé tubes de 1,5 ml avec des perles et des travaux sur un tube à la fois. Mettez un tube de 1,5 ml dans la plaque magnétique, secouez 3 fois et l&#39;ouvrir. </li><li> Après la dernière centrifugation, éliminer autant que possible surnageant sans perturber le culot. Dissocier les amas de cellules en tapotant vigoureusement. </li><li> Ajouter un tampon de lavage de 1 ml dans le tube de 50 ml et mélanger les cellules avec une pipette de 1 ml. Vider la solution provenant du tube de 1,5 ml et ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans le tube de 50 ml à billes. Feuilletez les tubes 30 fois puis tourner à 4 ° C pendant 30 min. </li></ol> 9. Préparation pour la culture cellulaire / Imagerie <ol><li> Préparer des chambres pour le placage des cellules. Ajouter une solution de gélatine (5% p / v, 300 ul) à la chambre pour enrober la surface et laisser incuber pendant 30 min à 37 ° C. Après incubation, remla gélatine ove et sécher la surface. </li><li> Sortez les tubes avec billes / cellules après 30 min de rotation et de mettre dans la plaque magnétique à l&#39;intérieur du capot. Agiter pendant 2 min, vidage et ajouter un tampon de lavage de 1 ml. </li><li> Prenez des tubes de la plaque, agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Remettez-les dans la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Répétez 4 fois pour un total de 5 lavages, mais avec 1 min en secouant sur la plaque. </li><li> Après le dernier lavage, prendre un tube et travailler sur chacun des tubes à la fois. Agiter 30 fois puis feuilletez 30 fois. Mettez-le sur la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Dump et ajouter 1 ml 20% des médias IFCS CE (préchauffé à 37 ° C). </li><li> Agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Régler la pipette 500 pi et pipeter de haut en bas 10 fois. Transférer 500 ul à chaque chambre. </li><li> Mettez à 37 ºC incubateur et laisser O / N. Le lendemain, laver les cellules avec 10% des médias FBS CE. </li></ol> 10. Préparation de blot (WB) Les échantillons occidentaux <ol><li> Take les tubes avec billes / cellules après 1 h de rotation. Mettez-les dans la plaque magnétique et agiter pendant 2 min. Dump surnageant et ajouter 1 ml de HBSS froid. Agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Répéter deux fois pour 3 lavages, mais avec 1 min en secouant sur la plaque. </li><li> Après le dernier lavage, mettre des tubes sur la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Retirer le tampon en utilisant la pipette et lyser les cellules pour WB en utilisant une méthode décrite précédemment 11,12. lysat Collected contient habituellement environ 30 ug de protéine. </li></ol> 11. Imaging <ol><li> Laver les cellules 3 fois avec des milieux, avec un volume final de 250 pl pour une chambre. Ajouter 1,5 ul de Dil acLDL aux cellules. De ce point, maintenir les cellules dans l&#39;obscurité. </li><li> Incuber pendant 3,5 heures à 37 ° C. Ajouter 1,5 pi de Hoechst, bien mélanger et laisser incuber pendant 30 min à 37 cellules ˚C.Wash avec PBS et fixer avec 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver deux fois avec du PBS et bloquer avec 5% de BSA-PBS pendant 30 min à la température ambiante. Laver deux fois avec 1% de BSA-PBS. Diluer BS-lectine-FITC en utilisant 1% de BSA-PBS à une concentration de 2 pg / ml et ajouter 300 pi à chaque chambre. </li><li> Mettez la chambre sur l&#39;agitateur orbital à température ambiante pendant 30 min. Laver avec du PBS 3 fois. </li><li> Visualiser les cellules sous le microscope à fluorescence avec des temps d&#39;exposition de 200 ms pour FITC (de coloration à la lectine, un marqueur CE excitation / émission à 488 nm / 519 nm), 30 ms pour le DAPI (Hoechst, une coloration, une excitation / émission nucléaire à 358 nm / 461 nm), et 300 msec pour TRITC (acLDL coloration, un marqueur CE, excitation / émission à 557 nm / 576 nm). Acquérir des images en utilisant un objectif 20X. </li></ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les cellules endothéliales les plus largement utilisés dans la recherche sont des cellules humaines de la veine ombilicale endothéliales (HUVEC) en raison de leur commodité et la facilité de culture. Cependant, beaucoup de recherches , il faut disposer d&#39;un modèle physiologique atteint par l&#39;isolement des cellules endothéliales provenant d&#39; autres organes spécifiques 10. Les cellules endotheliales forment une population mineure de cellules dans le tissu cardiaque; leur isolement et leur culture pe...

Des modèles de souris de diverses maladies cardio-vasculaires et des troubles métaboliques portent des changements physiologiques et moléculaires qui sont similaires à celles observées chez les patients. En outre, la modification génétique de la souris est un outil puissant qui nous permet d&#39;étudier le rôle pathogène de gènes spécifiques dans le développement et la progression des maladies. De nos jours, le gène knock-in type de cellule spécifique ou souris -out sont facilement générés dans de nombreux laboratoires et la mesure de l&#39;ARNm et les niveaux de protéines dans des types cellulaires spécifiques est la première étape pour déterminer si les souris ont été vraiment génétiquement modifiées. Endothélium est une mince couche unique de cellules endothéliales (EC) qui lignées la paroi vasculaire intérieure. Les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la régulation de la tension vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire 1,2. La dysfonction endothéliale est une caractéristique de nombreuses conditions pathologiques et des changements dans la fonction endothéliale peut conduire à diverses voituremaladies cardio- 3,4. Il est donc important d&#39;étudier la fonction des cellules endothéliales, dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Il y a plusieurs façons d&#39;isoler CEs 5-8 et la méthode d&#39;isolement doit être optimisée en fonction de quels tissus et les espèces seront utilisées. En effet , CEs provenant de différents tissus présentent un degré élevé d&#39;hétérogénéité par rapport à leurs marqueurs de surface et l&#39; expression des protéines 9. l&#39;isolement réussie des cellules endothéliales peut souvent être difficile et nécessite un certain degré de formation et de pratique. Une fois atteint, le procédé d&#39;isolement proposé dans ce protocole se révèle être stable et efficace. L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;obtenir la souris CEs coronaire (MCECs) de haute qualité et la quantité. Même si la quantité de cellules recueillies à partir d&#39;un coeur est inférieure à cellules collectées à partir d&#39;autres tissus en utilisant d&#39;autres techniques, cette technique fournit encore pariqualité ter. La pureté des cellules endothéliales dans la population résultante est supérieure à 90%. Ainsi, cette technique serait idéal pour les applications qui reposent sur les cellules endothéliales purement isolées telles que l&#39;imagerie cellulaire.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads pan souris Perles IgG&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD31 pour rat</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (protéase neutre)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II&nbsp ;</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de la phosphatase</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Héparine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp ;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

cellules endothéliales tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins et jouent un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire. le dysfonctionnement des cellules endothéliales est impliquée dans le développement et la progression de nombreuses maladies cardiovasculaires, y compris une maladie cardiaque ischémique. Pour examiner la fonction et la caractérisation des cellules endothéliales coronaires, l&#39;isolement des cellules est la première étape et elle nécessite une grande pureté et en quantité pour effectuer des expériences ultérieures. Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les cellules endothéliales coronaires de souris adulte. Le cœur de la souris est disséquée et hachée en petits morceaux. Après la digestion du coeur en utilisant la dispase II et de la collagénase, les cellules sont lavées et incubées avec des billes magnétiques qui sont conjuguées avec un anticorps anti-CD31. Les billes avec les cellules endothéliales sont lavées plusieurs fois et sont prêts à utiliser dans diverses applications, y compris l&#39;imagerie et de biologie moléculaire experiments. L&#39; isolement efficace donne environ 10 4 cellules par un seul cœur avec plus de 90% de pureté.

L&#39;isolement réussie des cellules endothéliales coronaires d&#39;un coeur de la souris donne généralement autour de 10 4 cellules avec plus de 90% de pureté avec une forme de pavés. Pour une population pure de cellules endothéliales, des précautions doivent être prises tout au long du protocole afin d&#39;assurer un environnement stérile exempt de toute contamination. L&#39;apparition de cellules allongées ou des cellules agrandies dans la population indique une contaminati...

Ce protocole est préparé pour partager notre méthode d’isolement des cellules endothéliales coronaires de souris à des fins d’imagerie ou pour mener des expériences de biologie moléculaire.

Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

L'objectif général de cette expérience est d'obtenir un grand nombre de cellules endothéliales coronariennes murines hautement purifiées et de haute qualité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche cardiovasculaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle facilite l'obtention d'un rendement élevé de cellules endothéliales de bonne qualité.Shizhen Luo, spécialiste de recherche, et le Dr Ayako Makino, notre investigatrice principale, démontreront cette procédure. Jusqu'à une semaine avant la procédure, ajoutez un millilitre de tampon CD31 dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre par échantillon. Ensuite, mélangez délicatement les billes d'anticorps IgG de mouton par pipetage, puis ajoutez le volume approprié de billes dans chaque tube.Une fois toutes les billes ajoutées, agiter vigoureusement les tubes 30 fois et les placer sur une plaque magnétique pendant une minute d'agitation. Ensuite, avec les tubes toujours fixés sur la plaque, éliminer le tampon et ajouter un millilitre de tampon CD31 frais dans chaque tube. Ajouter deux microlitres d'anticorps rad anti-CD31 de souris et placer les tubes sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, transférez les tubes sous une hotte à flux laminaire et replacez-les sur la plaque magnétique avec agitation pendant une minute. Remplacez ensuite le surnageant par un millilitre de tampon CD31 frais et agitez vigoureusement les tubes à la main 30 fois. Après le troisième lavage, remettez les tubes sur le rotateur à quatre degrés Celsius.Le jour de l'intervention, commencez par injecter à l'animal expérimental 0,1 millilitre d'héparine par voie intrapéritonéale afin de prévenir la coagulation sanguine. Après dix minutes, anesthésiez la souris par une injection de 0,01 millilitre de pentobarbital. Ensuite, confirmez l'absence de réponse à une pincée des orteils.Après avoir retiré ensemble le cœur et le tissu pulmonaire, placez-les dans un bécher contenant du tampon de Krebs et rincez les tissus par agitation douce. Transférez ensuite les tissus dans une boîte de six centimètres contenant du Krebs frais, puis utilisez des ciseaux et une pince pour enlever les lobes pulmonaires. Insérez maintenant un cathéter de 20 gauge dans l'aorte et rincez le système circulatoire coronaire avec du HBSS supplémenté en héparine.Lorsque tout le sang a été éliminé, effectuez une petite incision dans le ventricule, rincez le cœur en agitant doucement, puis placez le tissu cardiaque dans un tube d'échantillon sur de la glace. Après avoir digéré le tissu afin de libérer les cellules endothéliales coronariennes, centrifugez et lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de tampon de lavage. Ensuite, placez un tube contenant les billes préalablement préparées sur la plaque magnétique et agitez le tube trois fois pour répartir uniformément les billes.Après le deuxième lavage, retirez autant de surnageant que possible sans perturber le culot, puis associez les cellules par de légers chocs vigoureux. Ensuite, resuspendez les cellules dans un millilitre de tampon de lavage en mélangeant doucement, et éliminez le tampon CD31 des billes. Mélangez les cellules avec les billes, puis secouez le tube 30 fois en le frappant légèrement.Ensuite, placer la solution de cellules et de billes sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant l'incubation des cellules, recouvrir la surface d'un puits de chambre de culture par échantillon avec une solution de gélatine, puis placer les chambres à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois la gélatine solidifiée, éliminer tout excès de solution de gel et sécher la surface du puits de la chambre.Ensuite, transférez les cellules conjuguées aux billes sur la plaque magnétique sous la hotte et agitez pendant deux minutes, puis jetez le tampon de lavage. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage frais aux cellules et retirez le tube de la plaque pour effectuer 30 agitations vigoureuses, suivies de 30 chocs bruscs. Replacez le tube sur la plaque pour une minute supplémentaire d'agitation.Après la dernière agitation, remettez le tube sur la plaque magnétique pendant une minute supplémentaire, puis remplacez le tampon de lavage par un millilitre de milieu pour cellules endothéliales à 37 degrés Celsius, supplémenté avec 20 pour cent de sérum de veau enrichi en fer. Agitez et secouez les tubes 30 fois au total. Ensuite, utilisez une pipette de un millilitre réglée à 500 microlitres pour agiter les cellules conjuguées dix fois, puis transférez des aliquotes de 500 microlitres de cellules endothéliales coronariennes dans chaque puits de la chambre de culture pour une incubation nocturne à 37 degrés Celsius.Le lendemain, lavez les cellules dans un milieu pour cellules endothéliales, complété avec dix pour cent de FBS. La pureté des cellules endothéliales coronariennes isolées par cette méthode peut être confirmée par une coloration immunohistochimique dirigée contre les marqueurs de surface des cellules endothéliales, la BS lectine et l'AC LDL, plus de 90 pour cent des cellules présentant une expression double positive pour les deux marqueurs dans une culture typique de cellules endothéliales coronariennes de souris. Après cette procédure, divers examens sanguins, d'immunoréception et d'imagerie fluorescente peuvent être réalisés afin de répondre à d'autres questions, telles que la modification d'une protéine durant différents états pathologiques.Après son développement, cette technique fournit aux chercheurs les outils nécessaires pour étendre leurs recherches dans le domaine des cellules endothéliales coronariennes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement de cellules endothéliales coronariennes murines en grande quantité et de haute qualité. Plusieurs points clés doivent être respectés au cours de cette procédure.La chose la plus importante est de maintenir un environnement stérile tout au long de l'isolement. La deuxième étape consiste à éliminer complètement le sang le plus rapidement possible afin d'éviter la coagulation sanguine dans le réseau capillaire. La troisième consiste à mesurer le pH de tous les tampons, en particulier du tampon CD31.

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JoVE Journal

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Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

La capacité d’isoler les cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC) est essentielle pour comprendre les mécanismes de développement, de maintenance et de maladie des valves.  Nous décrivons ici l’isolement des VEC à partir de souris Tie2-GFP embryonnaires et adultes à l’aide de FACS qui permettra de réaliser des études déterminant la contribution des VEC dans les processus de développement et de maladie.

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Les cellules endothéliales vasculaires jouent un rôle important dans de nombreux troubles cardiovasculaires importants. Cet article décrit une méthode simple pour isoler et étendre les cellules endothéliales de l’aorte de souris sans utiliser d’équipement spécial. Notre protocole fournit un moyen efficace d’identifier les mécanismes de la physiopathologie des cellules endothéliales.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

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Nous présentons un protocole pour l’isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales endothéliales des coeurs de rat par la digestion séquentielle de tissu dans un tampon de digestion, la collection de cellules des cycles récurrents de centrifugeuses, et la purification de cellules utilisant des microbilles de CD31 anti-rat.

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Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

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Nous présentons une méthode pour isoler les cellules endothéliales et les noyaux de la lumière des artères carotides de souris exposées à des conditions d’écoulement stables ou perturbées pour effectuer des expériences omiques unicellulaires.

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