Un guide pour structuré Illumination FRBR Microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs

L’objectif global de ce protocole est de construire et d’aligner un microscope à illumination structurée adapté à l’imagerie à haute vitesse de cellules vivantes, capable de fonctionner en mode TIRF et en mode de coupe optique avec plusieurs couleurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire qui ne peuvent actuellement pas être résolues à l’aide de la microscopie TIRF standard à diffraction limitée. Le principal avantage de cette technique est sa résolution temporelle rapide par rapport aux autres techniques de microscopie à super résolution, ce qui la rend bien adaptée à l’imagerie des processus dynamiques dans les cellules vivantes.

Bien que ce protocole décrit les étapes de construction d’un microscope TIRF-SIM, la configuration est flexible et facilement modifiable pour mettre en œuvre des modalités d’imagerie telles que 3D-SIM, SIM multifocale et SIM non linéaire. Pour disposer et aligner le chemin d’excitation d’un microscope à éclairage structuré, commencez par marquer les positions des composants sur la table optique comme indiqué ici. Après avoir inséré le premier miroir dichroïque, DM4, dans la tourelle cubique du filtre du cadre du microscope, insérez le deuxième miroir dichroïque, DM3, dans une monture de miroir cinématique carré d’un pouce et positionnez-la à une distance focale de l’objectif du condenseur, L5. Ensuite, pour définir avec précision l’accès optique du système, retirez la lentille de l’objectif, OB, de la tourelle et vissez plutôt un outil d’alignement.

Ensuite, utilisez le miroir dichroïque DM3 et un miroir d’alignement temporaire positionné à l’emplacement ultime approximatif du SLM pour diriger un faisceau de référence collimaté du laser un à travers le centre des trous dans les deux disques d’alignement. À l’aide de trois miroirs et du miroir dichroïque DM2 comme illustré ici, dirigez le faisceau du laser un vers le miroir temporaire. Une fois que l’axe optique grossier a été déterminé, retirez l’outil d’alignement.

Insérez ensuite un iris dans le trajet du faisceau avant qu’il n’entre dans le corps du microscope et centrez-le sur le faisceau. Fixez un morceau de carton blanc avec un petit trou centré sur l’iris, puis réinsérez l’objectif. Ensuite, effectuez des ajustements angulaires itératifs sur les miroirs DM3 et sur la position SLM pour centrer la réflexion arrière sur la carte avec le faisceau entrant.

Retirez ensuite temporairement la lentille de l’objectif et marquez le point laser au plafond pour créer une position de référence. Insérez la lentille du tube, L5, à environ une distance focale de l’objectif, en la montant sur une platine de translation linéaire réglée pour se déplacer dans la direction du faisceau de référence. Ajustez la position et l’angle de la lentille du tube de sorte que le faisceau sortant de l’objectif soit collimaté et atteigne le point de référence au plafond.

Vérifiez que la lentille est perpendiculaire au faisceau en vérifiant à nouveau la réflexion arrière avec l’iris et la carte blanche. Retirez ensuite la lentille de l’objectif et insérez la deuxième lentille du télescope à relais d’image, L4. Utilisez la platine de translation linéaire pour ajuster la position et l’angle de cette lentille afin de maintenir la collimation et de vous assurer que le faisceau de référence frappe toujours le point marqué au plafond. Remplacez la lentille de l’objectif et insérez la première lentille du télescope, L3. Ajustez la position et l’angle de cet objectif pour assurer la collimation et la non-déviation comme décrit précédemment.

Après avoir monté la puce SLM conformément au protocole texte, avec les lentilles alignées, insérez le SLM à la place du miroir. Ajustez la position du SLM de sorte que le faisceau de référence soit situé au centre de la puce SLM et ajustez l’angle de sorte que le faisceau passe à travers les deux lentilles de relais. Vérifiez ensuite que le faisceau de référence est toujours centré sur l’endroit marqué.

Montez le ralentisseur variable à cristaux liquides, ou LCVR, avec son axe rapide à 45 degrés par rapport à la polarisation incidente. Ensuite, après avoir terminé l’alignement du rotateur de polarisation selon le protocole de texte, en utilisant la lumière transmise à travers les oculaires, faites la mise au point sur un réticule et fixez la lentille de l’objectif à cette position. Préparez ensuite une monocouche de perles fluorescentes en étalant une goutte de perles multicolores de 100 nanomètres sur un verre de couverture numéro 1,5.

Laissez les billes sécher pour les adsorber sur le verre avant de les immerger à nouveau dans l’eau. À l’aide d’huile d’immersion, placez l’échantillon de billes sur l’objectif. Ajustez finement la position de l’appareil photo afin que la couche de billes fluorescentes soit nette.

Après avoir généré des motifs de réseau binaire SIM sous forme de fichiers bitmap et les avoir téléchargés dans le SLM conformément au protocole texte, chargez le logiciel de contrôle SLM et cliquez sur Connecter. Dans l’onglet Répertoire, cliquez sur Charger pour ouvrir le fichier de répertoire et vérifier le nombre d’ordres d’exécution contenus dans le fichier. Cliquez sur Envoyer au tableau" pour télécharger le fichier de répertoire sur le SLM.

Ensuite, sélectionnez l’onglet « Statut » et entrez le numéro de l’ordre courant. Cliquez sur Sélectionner" pour modifier l’ordre de passage du réseau d’alignement. Insérez un masque spatial, ou SM, monté sur une platine XY dans le trajet du faisceau à la position focale de L3, et transmettez sa position par rapport à l’axe optique de sorte que seuls les premiers ordres souhaités soient passés.

Directement après le filtre spatial, seuls deux faisceaux circulaires seront visibles. Vérifiez l’image de la couche de perle fluorescente sur l’appareil photo. Si les deux faisceaux circulaires ne se chevauchent pas comme illustré ici, repositionnez le plan d’échantillonnage, en ajustant de manière itérative l’objectif et la position de la caméra.

Après avoir affiné la mise au point et réglé le plan d’échantillonnage selon le protocole de texte, confirmez l’éclairage TIRF en immatriçant, par exemple, une solution de 10 micromolaires de colorant rhodamine 6G en mettant le colorant au point. Si les deux faisceaux sont incidents à l’angle TIRF correct, les molécules uniques seront visibles sans bruit de fond élevé, et les bords de l’ouverture circulaire seront nets. Des ajustements fins de la position des faisceaux peuvent être effectués en ajustant le miroir dichroïque DM3.

Pour synchroniser et calibrer le système, placez l’échantillon monocouche de billes sur l’objectif et faites la mise au point. Utilisez le logiciel de contrôle SLM pour programmer le SLM afin qu’il affiche chacune des trois images de déphasage à tour de rôle pour l’orientation du premier motif. Passez ensuite à l’ordre quatre du répertoire d’exemples.

Dans le logiciel d’acquisition, configurez l’appareil photo pour la période d’exposition globale en choisissant Propriétés avancées de l’appareil photo et en réglant le type de déclenchement de sortie 1 sur positif et le type de déclencheur de sortie 2 sur négatif. Dans le volet de séquence, sous Type de balayage, sélectionnez Enregistrement sur disque dur et définissez le nombre d’images sur trois. Cliquez ensuite sur Démarrer" pour acquérir trois cadres.

Le modèle SLM changera à chaque exposition. Après avoir étalonné le système selon le protocole texte, dans le logiciel de contrôle SLM, basculez l’ordre de fonctionnement SLM sur la série complète de neuf images de réseau binaire requises pour TIRF-SIM. Il s’agit de l’ordre courant zéro dans le répertoire d’exemples.

Après avoir acquis neuf images de l’échantillon de billes, dans le volet de séquence du logiciel de l’appareil photo, sélectionnez Enregistrement sur disque dur" comme type de balayage et définissez le nombre d’images sur neuf. Cliquez ensuite sur Démarrer"pour acquérir des images. Enfin, sous Enregistrer les images mises en mémoire tampon, choisissez TIFF comme type d’image, puis cliquez sur OK. Reconstruisez une image en super résolution selon le protocole texte.

Sur la photo, des billes fluorescentes multicolores de 100 nanomètres de diamètre ont été imagées pour comparer le TIRF standard au TIRF-SIM. Il est clair que la carte SIM TIRF-SIM avait une résolution latérale nettement supérieure à celle de TIRF. La résolution estimée du microscope est de 90 nanomètres et de 120 nanomètres pour les TIRF-SIM de 488 et 640 nanomètres, respectivement.

Cela correspond à une amélioration de deux fois la résolution latérale pour les deux longueurs d’onde par rapport au cas théorique limité par diffraction. Comme on le voit ici, des fibrilles amyloïdes marquées par fluorescence ont été formées in vitro et ont également été utilisées comme échantillon de test pour démontrer une résolution doublée. Les structures subcellulaires à contraste élevé, telles que les microtubules marqués emGFP ou LifeAct-GFP, sont idéales pour l’imagerie TIRF-SIM et produisent des images à contraste élevé et à super résolution.

L’imagerie TIRF-SIM à l’aide de la configuration démontrée permet d’observer une sous-population de microtubules située à proximité du cortex basocellulaire, et la polymérisation et la dépolymérisation des microtubules peuvent être observées au fil du temps. Les échantillons à faible contraste sans structures discrètes manquent d’informations à haute résolution, sauf sur les bords de la membrane plasmique, et sont donc sous-optimaux pour l’imagerie TIRF-SIM. Enfin, un contraste de modulation élevé est essentiel pour une imagerie SIM réussie.

Comme le démontre ici, la transformée de Fourier de l’image reconstruite permet de visualiser la fonction de transfert optique SIM. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine environ, si toutes les pièces nécessaires ont été acquises. Lorsque vous tentez cette procédure, vous devez être conscient des problèmes les plus critiques pour une mise en œuvre réussie de TIRF-SIM.

Tout d’abord, un alignement précis des poutres est essentiel. Cela peut être difficile, car ils doivent être situés sur les bords de l’ouverture de l’objectif. Deuxièmement, il est essentiel que l’état de polarisation de la lumière soit co-tourné avec le motif.

Sans cela, le contraste du motif de l’échantillon sera faible et la construction ultérieure de l’image sera impossible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes les plus importantes de la construction et de l’alignement d’un microscope TIRF-SIM basé sur SLM. N’oubliez pas que travailler avec des lasers de classe 3B peut être extrêmement dangereux.

La puissance laser doit être maintenue à des niveaux sans danger pour les yeux pendant le processus d’alignement avec l’objectif TIRF en place.