Name: Un guide pour structuré Illumination FRBR Microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Apprenez à construire et aligner un microscope TIRF-SIM pour l'imagerie super-résolution à haute vitesse en plusieurs couleurs. Cette méthode permet d'étudier les processus dynamiques cellulaires avec une résolution temporelle rapide.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Leverhulme Trust, le génie et Conseil de recherches en sciences physiques [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] et Medical Research Council [MR / K015850 / 1 MR / K02292X / 1]. Nous vous remercions de E. Avezov et M. Lu pour la transfection de la LifeAct-GFP et les cellules cytosolique-GFP respectivement, et W. Chen pour la préparation de la culture HEK293. Nous remercions également K. O&#39;Holleran pour l&#39;assistance à la conception du microscope, et L. Shao et R. Heintzmann pour des discussions et des suggestions utiles.

<ol><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22BiOS+Eur%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
<li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
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<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).</li>
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<li>Ströhl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).</li>
<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> systèmes FRBR-SIM construits sur mesure tels que la configuration détaillée dans ce protocole sont capables de multicolor super-résolution d&#39;imagerie à grande vitesse par rapport aux microscopes disponibles dans le commerce. L&#39;avantage inhérent à la carte SIM en tant que technique de super-résolution que la résolution temporelle ne soit pas limitée par la photophysique du fluorophore, par rapport à d&#39;autres méthodes telles que la microscopie de molécule unique de localisation (SMLM) ou des méthodes de balayage de points, tels que la microscopie à déplétion d&#39;émission stimulée ( STED). Contrairement à ces autres techniques, SIM ne nécessite pas fluorophores photoswitchable ou épuisables donc imagerie multicolore est simple. Les systèmes non TIRF-SIM, comme optique de sectionnement SIM et multifocale SIM peut généralement obtenir des améliorations de la résolution de 1,7 fois ou moins, dans la pratique, par opposition au facteur de 2 amélioration rapportée ici, et les systèmes commerciaux sont souvent plus lent et moins souple que le système présenté dans ce protocole. &quot;&gt; Les deux principales difficultés dans la mise en œuvre de cette technique sont d&#39;une part la nécessité d&#39;un positionnement précis des six faisceaux SIM dans la zone de TIR de l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif, ce qui nécessite un temps laborieux et consommer la procédure d&#39;alignement optique. En second lieu, pour produire un contraste élevé de motif à l&#39;échantillon, la rotation de polarisation est essentielle. pour les systèmes à faible NA 2D SIM, la rotation de polarisation peut être évitée par un choix judicieux de l&#39;orientation de polarisation linéaire, mais cela devient impossible TIRF-SIM 25. pour multicolore imagerie à haute vitesse, électro - le contrôle de la polarisation optique est nécessaire, ce qui augmente la complexité et le coût du système. Limites de la technique FRBR-SIM, comme FRBR classique, est naturellement limitée à l&#39;observation des structures et processus situés à la membrane cellulaire basale qui peut être éclairé par le 150-200 nm profondeur de pénétration du champ évanescent biologiques. Tandis queSIM est souvent cité comme étant moins photodamaging aux cellules que soit STED ou SMLM, latéral résolution doublement n&#39;augmente encore le nombre de photons par au moins 4 fois 5 par rapport à la microscopie TIRF conventionnelle. Pour l&#39;imagerie à des cadences élevées avec des expositions courtes durées, cette augmentation de photons nécessite l&#39;utilisation d&#39;une augmentation des intensités d&#39;éclairage. Bien que tout fluorophore peut être utilisé pour l&#39;imagerie SIM d&#39;échantillons mobiles fixes ou lents, des protéines fluorescentes de haute luminosité ou la prochaine génération de colorants synthétiques avec photostabilité améliorée sont recommandés pour l&#39;imagerie des cellules vivantes. Bien que ce mode de réalisation est capable d&#39;imager une seule couleur à la carte SIM des taux de trame supérieur à 20 Hz, l&#39;imagerie multicolore dans le système présenté est limité par le temps de commutation de la roue de filtre d&#39;émission motorisé. En raison de la grande taille de la puce de la caméra sCMOS, l&#39;utilisation d&#39;un filtre multibande d&#39;émission et de dédoublement d&#39;image optique serait possible et permettre i simultanéeforgemagie avec de multiples longueurs d&#39;onde à aucune pénalité de vitesse. Une autre possibilité serait d&#39;alterner les différents lasers d&#39;excitation et d&#39;utiliser un filtre coupe-bande multibande pour rejeter la lumière d&#39;excitation. L&#39;utilisation d&#39;un SLM ferroélectrique binaire dans cette mise en oeuvre est pas optimale. L&#39;efficacité de diffraction d&#39;un tel SLM est très faible, de sorte que la plupart de la lumière incidente est dans la réflexion d&#39;ordre zéro, qui est filtré par le masque spatial. Pour les applications nécessitant des taux de trame très élevées, la vitesse de formation d&#39;image est donc limitée par la puissance de sortie des diodes laser. Le SLM introduit également un certain aplatissement dans la polarisation des longueurs d&#39;onde loin de la conception longueur d&#39;onde de 550 nm où les pixels ne fonctionnent pas de plaques demi-onde comme idéales. Bien que ceci puisse être compensé en utilisant une LCVR supplémentaire, la solution idéale peut être l&#39;utilisation d&#39;un dispositif de micro-miroir numérique (DMD) en tant que générateur de motif. Les modifications possibles Le prese de configurationnted ici est souple et plus facile à modifier que les instruments commerciaux pour que d&#39; autres modalités d&#39;imagerie telles que 3D-SIM, rapide 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) et SIM non-linéaire (NL-SIM) peuvent être mises en œuvre 21,34,35. 2D-SIM peut être bien adapté pour l&#39;imagerie relativement plat, se déplaçant rapidement des structures telles que le réticulum endoplasmique périphérique. L&#39;ER périphérique est plus profond au sein de la cellule que peut être éclairé à l&#39;aide d&#39;un champ évanescent FRBR mais en raison de sa structure plate peut être imagée en utilisant la norme 2D-SIM avec fond négligeable out-of-focus. En outre, l&#39;utilisation de l&#39; amélioration des algorithmes de reconstruction de tronçonnage optiques pour supprimer hors-focus lumière étendre l&#39;utilisation de la 2D-SIM optiquement des échantillons épais, mais où la résolution axiale doublement ne sont pas nécessaires 21. Dans MSIM, l&#39;échantillon est éclairé par un réseau clairsemé d&#39;excitation 36 foyers. Cette modalité peut être mise en œuvre simplement en enlevant le masque spatial (SM) Et de le remplacer par un polariseur. Le SLM fonctionne maintenant comme un modulateur d&#39;amplitude. Les réseaux SIM binaires affichés sur le SLM peuvent être remplacés par un réseau 2D de points, la taille des points choisis pour être égale à la taille d&#39;une diffraction de focalisation limitée dans le plan de l&#39;image. Sur la figure 7A, un réseau de 4 x 4 carrés de pixels est affiché sur le SLM (encadré) qui , lorsque demagnified sur l&#39;échantillon génère diffraction des foyers limités de 150 x 150 nm, étant donné la taille de pixel SLM physique de 13,62 um. Les domaines d&#39;excitation peut alors être traduite en décalant le motif en treillis sur le SLM et cela est répété plusieurs fois afin d&#39;illuminer le champ de vision. Les images sont acquises pour chaque position de motif traduit et la pile est post-traitement pour donner une image reconstruite avec une résolution améliorée jusqu&#39;à un facteur de <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> et réduit out-of-focus de lumière par rapport à l&#39;image de grand champ équivalent30. Cette modalité peut être utile pour l&#39; imagerie épais, des échantillons denses pour lesquels SIM standard est inadaptée, par exemple de faibles structures de contraste tels que les globules rouges colorés (Figure 7C), bien que le temps d&#39;acquisition est augmentée en raison du grand nombre d&#39;images brutes nécessaire par champ de vision (dans ce cas N = 168). Enfin, la configuration peut être modifiée pour permettre soit de haute-NA linéaire FRBR-SIM ou d&#39; activation à motif non linéaire SIM (PA NL-SIM), tel que présenté récemment par Li et al., Par l&#39; utilisation d&#39;un 1,7 objectif ou addition NA ultravide d&#39;un laser de photoactivation 405 nm et une optimisation minutieuse des motifs de réseau SLM 35. Les futures applications SIM est encore une technique en évolution rapide et de nombreuses applications dans les sciences de la vie sera activé à l&#39;avenir. La vitesse, la résolution, et des améliorations de contraste de la technique et la capacité d&#39;utiliser des fluorophores standards mean que, pour bio-imagerie, la carte SIM doit remplacer de nombreux systèmes de microscopie classiques, tels que des plates-formes de terrain confocale et larges. systèmes SIM commerciaux sont déjà disponibles aujourd&#39;hui avec les spécifications techniques en suspens, cependant, ils sont hors de la portée financière de nombreux laboratoires de recherche, et, surtout, ils sont rigides pour être modifié et mis au point pour mettre en œuvre les derniers développements de la recherche dans le domaine. Ils manquent également de la capacité essentielle pour &#39;être adapté pour l&#39;expérience à portée de main », souvent un goulot d&#39;étranglement critique dans des recherches de sciences de la vie de bord. Le système décrit ici sera particulièrement bien adapté pour étudier les processus dynamiques à proximité de la surface de la cellule, pour des études in vitro de systèmes bicouches reconstitués, pour étudier la chimie de surface dans les matériaux et les sciences physiques, par exemple. des matériaux 2D, et beaucoup d&#39;autres applications.

Au cours de la dernière moitié d&#39;une décennie, nanoscope a mûri et déplacé des laboratoires d&#39;optique spécialisés dans les mains du biologiste. Solutions de microscope commerciales existent pour les trois principales variantes pour la réalisation optique super-résolution: seule la microscopie molécule de localisation (SMLM), stimulée microscopie émission d&#39;épuisement (STED), et la microscopie illumination structurée (SIM) 1,2. SMLM telles que la microscopie photoactive de localisation (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) ont été les techniques les plus populaires, en grande partie en raison de la simplicité de la configuration optique et la promesse d&#39;une résolution spatiale élevée, facilement jusqu&#39;à 20 nm. Cependant nanoscope par localisation unique molécule est livré avec un compromis intrinsèque: la résolution spatiale atteignable dépend d&#39; accumuler un nombre suffisant de localisations fluorophores individuels, ce qui limite donc la résolution temporelle. processus dynamique d&#39;imageriees dans des cellules vivantes devient alors problématique car il faut échantillonner de façon adéquate le mouvement de la structure d&#39;intérêt afin d&#39;éviter des artéfacts de mouvement, tout en acquérant suffisamment d&#39;événements de localisation en ce que le temps de reconstituer une image. Afin de répondre à ces exigences, en direct des démonstrations de SMLM cellulaire ont obtenu l&#39;augmentation nécessaire des taux fluorophore de photocommutation en augmentant considérablement la puissance d&#39;excitation, ce qui conduit à son tour à phototoxicité et le stress oxydatif, ce qui limite le temps de survie de l&#39; échantillon et de la pertinence biologique 3. Un avantage évident de STED à la fois sur la carte SIM et SMLM est qu&#39;il peut image avec super-résolution dans des échantillons d&#39; épaisseur, par exemple la résolution latérale de l&#39; ordre de 60 nm a été obtenue dans des tranches de cerveau organotypiques à des profondeurs allant jusqu&#39;à 120 um 4. Imagerie à de telles profondeurs avec des implémentations objectifs uniques de SMLM ou SIM est irréalisable, mais devient possible avec soit la feuille de lumière seule molécule ou un treillis feuille de lumière microroscopie 5. Video taux STED a également été démontrée et utilisée pour cartographier la mobilité synaptique vésiculaire, bien que jusqu&#39;à présent cela a été limité à l&#39; imagerie de petits champs de vision 6. Pour les applications en biologie cellulaire et moléculaire des réactions auto-assemblage 7 - 12 qui nécessitent l&#39; imagerie avec une résolution temporelle élevée sur de nombreux points de temps, la microscopie d&#39;éclairage structuré (SIM) peut être bien adapté car il ne dépend pas des propriétés photophysiques d&#39;un fluorescent particulier sonde. Malgré cet avantage inhérent de SIM, jusqu&#39;à présent, son utilisation a été principalement confinée à l&#39;imagerie des cellules fixes ou des processus lents. Ceci est dû aux limitations des systèmes SIM disponibles dans le commerce: le taux de trame d&#39;acquisition de ces instruments est limitée par la vitesse de rotation des réseaux utilisés pour générer les modèles d&#39;éclairage sinusoïdales requises ainsi que le maintien de la polarisation optique. La nouvelle génération de SIM commercialeinstruments sont capables d&#39;imagerie rapide, mais ils sont trop coûteux à tous, mais les installations d&#39;imagerie centrales. Ce protocole présente un guide pour la construction d&#39;un système SIM souple pour imager des processus rapides dans des échantillons minces et à proximité de la surface de base des cellules vivantes. Elle emploie au total fluorescence à réflexion interne (FRBR) pour générer un modèle d&#39;éclairage qui pénètre pas plus profond que d&#39; environ 150 nm dans l&#39;échantillon 13 qui réduit considérablement le signal hors focus fond. L&#39;idée de combiner SIM avec FRBR est presque aussi ancienne que la carte SIM se 14 mais n&#39;a pas été réalisé expérimentalement avant 2006 15. La premières images in vivo obtenus avec la FRBR-SIM ont été signalés en 2009 16 atteignant des taux de trame de 11 Hz pour visualiser tubuline et kinésine dynamique, et deux systèmes FRBR-SIM couleur ont été présentées 17,18. Plus récemment, un guide pour la construction et l&#39;utilisation d&#39;une seule couleur à deux faisceaux SIM système a été présenté avec cadre-débits allant jusqu&#39;à 18 Hz 19,20. Le set-up présenté ici est capable de SIM super-résolution imagerie à 20 Hz en trois couleurs, dont deux peuvent être exploitées dans les FRBR-SIM. L&#39; ensemble du système est construit autour d&#39; un cadre de microscope inversé et utilise une table de translation xy z motorisé avec un étage piézo-actionné. Pour générer les modèles d&#39;excitation sinusoïdale requis pour TIRF-SIM, le système proposé utilise un modulateur spatial de lumière ferroélectrique (SLM). motifs de réseau binaires sont affichés sur le SLM et les ± 1 ordres de diffraction résultant sont filtrés, relayées et concentrées dans l&#39;anneau de TIR de l&#39;objectif. Les déphasages et les rotations des grilles nécessaires sont appliqués en changeant l&#39;image affichée SLM. Ce protocole décrit la façon de construire et d&#39;aligner un tel trajet d&#39;excitation, les détails de l&#39;alignement du trajet d&#39;émission, et présente des échantillons de test pour garantir un alignement optimal. Il a également dé<html> scribes les enjeux et les défis particuliers à haute vitesse FRBR-SIM en matière de contrôle de polarisation et la synchronisation des composants. Considérations de conception et contraintes Avant de monter le système FRBR-SIM présenté dans ce protocole, il y a plusieurs contraintes de conception à considérer qui déterminent le choix des composants optiques. Toutes les abréviations des composants optiques se réfèrent à la figure 1. Lumière Modulator spatiale (SLM) Un ferroélectrique SLM binaire est utilisé dans cette configuration car il est capable de commutation de motif sous-milliseconde. MSL nématiques Grayscale peuvent être utilisées, mais elles offrent considérablement réduit les temps de commutation. Chaque sous ou hors tension pixel dans une phase binaire SLM va conférer soit une phase π ou 0 décalage au plan de front d&#39;onde incident, donc si un motif de réseau périodique est affiché sur le SLM, il fonctionnera comme une diffraction de réseau de phase. ent &quot;&gt; réflexion interne totale (TIR) Pour y parvenir TIR et produire un champ évanescent, l&#39;angle d&#39;incidence des faisceaux d&#39;excitation à l&#39;interface verre-échantillon doit être supérieur à l&#39;angle critique, <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Ceci définit l&#39;angle minimum incident nécessaire, et donc aussi l&#39;espacement maximal, ou de la période, du motif d&#39;éclairage évanescent. L&#39;angle d&#39;incidence maximale <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (L&#39;angle d&#39;acceptation) est limitée par l&#39;ouverture numérique (NA) de l&#39;objectif qui peut être calculé à partir de la définition <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Ceci permet de déterminer le motif d&#39;espacement minimal réalisable d&#39;après la formule d&#39;Abbe <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> qui relie NA et longueur d&#39;onde <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> à l&#39;espacement de motif minimal <imgalt = src &quot;Equation&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / de 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. En pratique, un objectif TIRF 1,49 NA immersion dans l&#39;huile donne un angle maximal d&#39;incidence d&#39;environ 79 ° C et une durée minimale de motif sur un échantillon de 164 nm en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm. Ces deux angles définissent une bague dans l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif au cours de laquelle l&#39;instrument permet d&#39; obtenir TIR éclairage (ie. L&#39;anneau TIR) et dans lequel les foyers deux d&#39;excitation doit être positionné de façon exacte et précise en rotation pour générer chaque configuration d&#39;éclairage. Reconstruction d&#39;images FRBR-SIM nécessite l&#39;acquisition d&#39;un minimum de trois décalages de phase par rotation de motif donc la période de motif SLM doit être divisible par 3 (voir la figure 1). Par exemple, une période de 9 pixels pour l&#39;éclairage 488 nm et 12 640 nm pixels pour l&#39;éclairage. Pour une discussion complète de conception de modèle de SLM, y compris l&#39;optimisation sous-pixel de motif d&#39;espacement en utilisant des réseaux cisaillées, Voir les travaux précédents de Kner et al. 16 et Lu-Walther et al. 20 La position des deux foyers d&#39;excitation doit être à l&#39; intérieur de l&#39;anneau TIR pour toutes les longueurs d&#39; onde, mais l&#39;angle de diffraction des ± 1 ordres du SLM est la longueur d&#39; onde dépendant. SIM standard pour l&#39;imagerie multicolore peut être obtenue en optimisant la période de réseau la plus longue longueur d&#39;onde, et de tolérer une perte de rendement pour les canaux plus courts. Pour FRBR-SIM cependant, l&#39;optimisation pour une longueur d&#39;onde signifie que les autres foyers de longueur d&#39;onde plus dans l&#39;anneau TIR sont. Par exemple, en utilisant une période de réseau de 9 pixels est suffisante pour fournir TIRF à 488 nm, comme les foyers sont à 95% du diamètre de l&#39;ouverture arrière et à l&#39;intérieur de l&#39;anneau TIR, mais à 640 nm, cette période se positionner les foyers dehors l&#39;ouverture. Pour cette raison, différents espacements de motif de pixels doivent être utilisées pour chaque longueur d&#39;onde d&#39;excitation. L&#39;alignement du trajet d&#39;excitation TIRF SIMest extrêmement sensible à de petits changements dans la position du miroir dichroïque (DM4 de la figure 1) dans le corps de microscope, beaucoup plus que dans la carte SIM classique. Utilisation d&#39;un filtre rotatif cube tourelle est pas recommandé, au lieu d&#39;utiliser un seul, multi-bande miroir dichroïque, qui est maintenu dans une position fixe et conçu spécifiquement pour les longueurs d&#39;ondes d&#39;excitation utilisées. Il est essentiel que seuls les miroirs dichroïques plus élevés de qualité sont utilisés. Ceux-ci exigent des substrats épais d&#39;au moins 3 mm, et sont souvent désignés comme «plat d&#39;imagerie&quot; par les fabricants. Tous les autres substrats conduisent à l&#39;aberration intolérable et la dégradation de l&#39;image dans la FRBR-SIM. Contrôle de Polarisation Pour y parvenir TIRF-SIM , il est essentiel de faire tourner l&#39;état de la lumière d&#39;excitation de polarisation en synchronisme avec le motif d&#39;illumination de telle sorte qu&#39;il reste azimutal polarisé dans le plan de pupille de l&#39; objectif par rapport à l&#39;axe optique (c. -à-. s-polarisée). L&#39; alignement de l&#39;optique de commande de polarisation dépend de l&#39;élément optique spécifique utilisé, par exemple une cellule de Pockels 21, ou d&#39; une plaque demi-onde dans un étage motorisé de rotation 22. Dans ce protocole, une variable à cristaux liquides personnalisé ralentisseur (LCVR) est utilisé, conçu pour fournir pleine onde (2π) retardance sur la plage de longueur d&#39;onde 640 nm à 488 car il permet rapidement (~ msec) commutation. Si l&#39;on utilise un cristal Ralentisseur liquide, il est essentiel d&#39;utiliser un composant de haute qualité: Les composants standards ne sont généralement pas suffisamment stables pour donner une retardance constante sur toute la longueur de la durée d&#39;exposition de caméra qui conduit à un flou sur le motif d&#39;éclairement lumineux et un faible contraste de modulation . retardateurs de cristaux liquides sont également fortement dépendante de la température et nécessitent construit dans le contrôle de la température. Synchronisation Les lasers doivent être synchronisés avec le SLM. MSL ferroélectriques binaires sont équilibrés en interne par switching entre un état et l&#39;état bloqué. Les pixels agissent uniquement des plaques d&#39;onde que la moitié soit dans leur état allumé ou éteint, mais pas pendant le temps de commutation inter. Par conséquent, les lasers ne doivent être allumés pendant on / off états via la LED Activer signal du SLM pour éviter une diminution du contraste du motif en raison de l&#39;état intermédiaire des pixels. Un modulateur acousto-optique (AOM) pourrait aussi être utilisé comme un obturateur rapide si les lasers ne peuvent pas être modulés numériquement. Choix de lentilles Sur la base de ces contraintes, le démagnification requis du plan SLM sur le plan d&#39;échantillon pour produire les modèles d&#39;éclairage désirées peuvent être déterminées. Cela permet de calculer les longueurs focales des deux lentilles L3 et L4 dans le télescope de relais d&#39;image et la lentille d&#39;excitation du condenseur L5. Dans ce système a / 1.49NA immersion dans l&#39;huile objectif 100X est utilisé avec 488 nm et 640 nm d&#39;excitation, donc utilise des longueurs focales de 300 et 140 mmpour L4 et L3, et 300 mm pour L5, ce qui donne un total de démagnification 357x, ce qui équivaut à une taille de pixel de SLM 38 nm au niveau du plan de l&#39;échantillon. Grâce à cette combinaison de lentilles SLM 9 périodes de réseau de diffraction à 488 nm éclairement et 12 pixels pour 640 nm donne des espacements de motif de 172 et 229 nm à l&#39;échantillon, correspondant à des angles d&#39;incidence de 70 ° et 67 °, respectivement. Pour une interface verre-eau, l&#39;angle critique est de 61 °, et est indépendante de la longueur d&#39;onde, par conséquent, ces deux espacements de motif permettent FRBR excitation pour les deux longueurs d&#39;onde. Un objectif muni d&#39;une bague de correction est utile pour la correction des aberrations sphériques introduites par les variations de l&#39;épaisseur de la lamelle couvre-objet ou en cas de fonctionnement à 37 ° C. Reconstruction d&#39;image Une fois que les données brutes SIM a été acquise est une question d&#39;effort de calcul pour générer des images de super-résolue dans un processus en deux étapes. Tout d&#39;abord, le modèle d&#39;éclairage doit être déterminé pourchaque image et d&#39; autre part, les composantes du spectre SIM doivent être séparés et recombinés de façon appropriée à doubler le soutien de la FTO efficace (voir Figure 6, empiècements). La connaissance précise des modèles d&#39;éclairage projetés est primordiale, car les composantes de fréquence de super-résolus doivent être unmixed aussi précisément que possible pour éviter les artefacts causés par les parties résiduelles des composants qui se chevauchent. Nous déterminons le modèle d&#39;éclairage paramètres a posteriori à partir des données d&#39;image brute suivant la procédure introduite par Gustafsson et al. 23 En bref, un ensemble de paramètres d&#39;éclairage qui décrit une sinusoïde à deux dimensions normalisées doit être trouvé pour chacun des <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> des motifs d&#39;excitation <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> Par la présente <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> et <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> décrire le contraste des franges et le motif phase de démarrage de chaque image individuelle m respectivement. Les composantes du vecteur d&#39;onde, <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> et <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Seulement changer avec des orientations différentes <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> du motif et peut être supposée par ailleurs constante. Pour déterminer grossièrement les composantes du vecteur d&#39;onde d&#39;une corrélation croisée des spectres d&#39;image brute est réalisée, qui est raffiné en appliquant des changements de sous-pixels à l&#39;une des images en coupe corrélées à optimiser le chevauchement. Cela se fait via la multiplication de l&#39;espace réel gradients de phase <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> qui induisent un changement de sous-pixel dans frefré--espace. On notera qu&#39;il est utile d&#39;avoir une bonne estimation des vecteurs d&#39;onde avant l&#39;estimation de la configuration actuelle et ce qui peut être trouvé par l&#39;imagerie d&#39;une couche de billes fluorescentes. Comme l&#39;étape de phase entre les modèles décalés est <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , C. <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> La séparation des composants de fréquence peut être réalisée par une transformée de Fourier le long de l&#39;axe &quot;de phase&quot;. La phase globale <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> et le contraste des franges <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> peut ensuite être déterminée en utilisant une régression linéaire complexe de composants différents. Les différents composants séparés sont ensuite combinés à l&#39;aide d&#39;un filtre de Wiener généralisé. Pour une description détaillée des deux extraction de paramètres et de mise en œuvre du filtre de Wiener généralisé, nous renvoyons le lecteur à Gustafssonet al. , 23 où le même algorithme est utilisé.

<table><tbody><tr><td>Laser 488 nm</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>avec modulation numérique</td></tr><tr><td>Laser 561 nm</td><td>OBIS</td><td>cohérent LS</td><td>avec modulation numérique</td></tr><tr><td>Laser 640 nm</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>avec modulation numérique</td></tr><tr><td>Miroirs dichroïques passe-long&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td> pour combiner des <td></td><td>faisceaux d’excitation</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque à quatre bandes</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>3 mm d’épaisseur, imagerie TIRF plate, monté dans un cube de filtre Olympus BX</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque à quatre bandes</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>Du même lot que ci-dessus, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1" monture cinématique carrée</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Glan-Taylor calcite polariseurs</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>Pour l’alignement de la</td></tr><tr><td>monture LCVR Glan-Taylor Thorlabs</td><td></td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Plaque achromatique demi-onde</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Monture de cage de rotation</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>Pour HWP</td></tr><tr><td>Liquid Crystal Variable</td><td>Retarder Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Construit sur mesure pour fournir une résistance complète aux vagues sur la plage de 488 à 640 nm.</td></tr><tr><td>Contrôleur LCVR</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Contrôleur haute tension à deux canaux pour retardateurs à cristaux liquides</td></tr><tr><td>Plaque quart d’onde achromatique</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Support de cage de rotation</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>Pour doublet</td></tr><tr><td>achromatique QWP 10 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>Pour expanseur de faisceau</td></tr><tr><td>200 mm achromatique doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>Pour expanseur de faisceau</td></tr><tr><td>Cage XY Traducteurs Thorlabs</td><td></td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Modulateur de lumière spatiale ferroélectrique</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-00249&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Micro-écran SXGA-3DM (IFF) de type M249, 1 280 x 1 024 pixels, avec carte pilote</td></tr><tr><td>Cadre de montage SLM</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Fixé sur support en aluminium sur mesure</td></tr><tr><td>&Oslash ; Monture miroir à cardan 50,8 mm</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>Pour montage SLM</td></tr><tr><td>Platine de translation linéaire à deux axes avec plate-forme rotative</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>Pour montage SLM</td></tr><tr><td>Porte-rail</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>Pour montage SLM</td></tr><tr><td>Rail optique de précision</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>Pour montage SLM</td></tr><tr><td>Lentille doublet achromatique 300 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322</td><td>f = 300 mm, 31,5 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Objectif doublet achromatique 140 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, 31,5 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Montures de translation XY de précision Montures de translation</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateurs de montage</td><td>d’objectif Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>Pour le montage d’objectifs 31,5 mm dans des montures 2"</td></tr><tr><td>Platines de translation</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Queue d’aronde, entraînement latéral</td></tr><tr><td>XY Translator avec entraînements différentiels</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>pour filtre spatial</td></tr><tr><td>Monture de cage de rotation</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>pour filtre spatial</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 300 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Lentille à tube d’excitation</td></tr><tr><td>Platine XY automatisée avec plaque supérieure Z-piezo</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp ;</td><td>avec contrôleur MS-2000</td></tr><tr><td>Cadre de microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Objectif Olympus</td><td></td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>Roue à filtres haute vitesse</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>avec contrôleur Prior ProScan III</td></tr><tr><td>Filtres d’émission passe-bande</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>Caméra sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de scène</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Pour l’imagerie de cellules vivantes, avec contrôleurs de température Bold Line et CO2</td></tr><tr><td>Poteaux optiques en acier inoxydable</td><td>Thorlabs</td><td>TR Series</td><td>pour le montage de composants optiques</td></tr><tr><td>Supports de poteaux</td><td>Thorlabs</td><td>PH</td><td>pour le montage de composants optiques</td></tr><tr><td>Supports de miroir cinématiques</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>pour le montage de miroirs 1"</td></tr><tr><td>Interféromètre de cisaillement</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>Microsphères fluorescentes 100 nm Life</td><td>Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre 8 puits</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>avec verre de couverture #1.5</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Verre de protection chambré</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td> avec lame de réticule de microscope <td>#1.5</td></tr> de <tr><td>0,01 mm</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

un guide pour structuré illumination frbr microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optique imagerie super-résolution en microscopie d&#39;éclairage structuré (SIM) est une technologie clé pour la visualisation des processus au niveau moléculaire dans le domaine des sciences biomédicales et chimiques. Bien que les systèmes SIM commerciaux sont disponibles, les systèmes qui sont conçus sur mesure dans le laboratoire peut surpasser les systèmes commerciaux, ce dernier généralement conçus pour une facilité d&#39;utilisation et les applications générales, tant en termes d&#39;imagerie fidélité et de la vitesse. Cet article présente un guide en profondeur à la construction d&#39;un système qui utilise la carte SIM totale illumination réflexion interne (TIR) ​​et est capable de l&#39;imagerie jusqu&#39;à 10 Hz en trois couleurs à une résolution atteignant 100 nm. En raison de la combinaison de la carte SIM et la FRBR, le système offre un meilleur contraste de l&#39;image que les technologies rivales. Pour atteindre ces spécifications, plusieurs éléments optiques sont utilisés pour permettre le contrôle automatisé sur la structure de l&#39;état de polarisation et spatiale de la lumière d&#39;éclairage pour toute excitation wav disponibleelengths. Tous les détails sur la mise en œuvre et le contrôle du matériel sont donnés pour réaliser la synchronisation entre la production de lumière d&#39;excitation de motif, longueur d&#39;onde, l&#39;état de polarisation, et le contrôle de la caméra en mettant l&#39;accent sur la réalisation de taux de trame maximale d&#39;acquisition. Un protocole étape par étape pour l&#39;alignement et l&#39;étalonnage du système est présenté et l&#39;amélioration de la résolution obtenue est validée sur des échantillons d&#39;essai idéal. La capacité pour la vidéo à taux super-résolution imagerie est démontrée avec des cellules vivantes.

Cet article fournit un guide détaillé pour l’assemblage et le fonctionnement d’un microscope à éclairage structuré fonctionnant avec un éclairage par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF-SIM) pour imager des processus biologiques dynamiques avec une super-résolution optique en plusieurs couleurs.

Un guide pour structuré Illumination FRBR Microscopie à haute vitesse avec plusieurs couleurs

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

L’objectif global de ce protocole est de construire et d’aligner un microscope à illumination structurée adapté à l’imagerie à haute vitesse de cellules vivantes, capable de fonctionner en mode TIRF et en mode de coupe optique avec plusieurs couleurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire qui ne peuvent actuellement pas être résolues à l’aide de la microscopie TIRF standard à diffraction limitée. Le principal avantage de cette technique est sa résolution temporelle rapide par rapport aux autres techniques de microscopie à super résolution, ce qui la rend bien adaptée à l’imagerie des processus dynamiques dans les cellules vivantes.Bien que ce protocole décrit les étapes de construction d’un microscope TIRF-SIM, la configuration est flexible et facilement modifiable pour mettre en œuvre des modalités d’imagerie telles que 3D-SIM, SIM multifocale et SIM non linéaire. Pour disposer et aligner le chemin d’excitation d’un microscope à éclairage structuré, commencez par marquer les positions des composants sur la table optique comme indiqué ici. Après avoir inséré le premier miroir dichroïque, DM4, dans la tourelle cubique du filtre du cadre du microscope, insérez le deuxième miroir dichroïque, DM3, dans une monture de miroir cinématique carré d’un pouce et positionnez-la à une distance focale de l’objectif du condenseur, L5. Ensuite, pour définir avec précision l’accès optique du système, retirez la lentille de l’objectif, OB, de la tourelle et vissez plutôt un outil d’alignement.Ensuite, utilisez le miroir dichroïque DM3 et un miroir d’alignement temporaire positionné à l’emplacement ultime approximatif du SLM pour diriger un faisceau de référence collimaté du laser un à travers le centre des trous dans les deux disques d’alignement. À l’aide de trois miroirs et du miroir dichroïque DM2 comme illustré ici, dirigez le faisceau du laser un vers le miroir temporaire. Une fois que l’axe optique grossier a été déterminé, retirez l’outil d’alignement.Insérez ensuite un iris dans le trajet du faisceau avant qu’il n’entre dans le corps du microscope et centrez-le sur le faisceau. Fixez un morceau de carton blanc avec un petit trou centré sur l’iris, puis réinsérez l’objectif. Ensuite, effectuez des ajustements angulaires itératifs sur les miroirs DM3 et sur la position SLM pour centrer la réflexion arrière sur la carte avec le faisceau entrant.Retirez ensuite temporairement la lentille de l’objectif et marquez le point laser au plafond pour créer une position de référence. Insérez la lentille du tube, L5, à environ une distance focale de l’objectif, en la montant sur une platine de translation linéaire réglée pour se déplacer dans la direction du faisceau de référence. Ajustez la position et l’angle de la lentille du tube de sorte que le faisceau sortant de l’objectif soit collimaté et atteigne le point de référence au plafond.Vérifiez que la lentille est perpendiculaire au faisceau en vérifiant à nouveau la réflexion arrière avec l’iris et la carte blanche. Retirez ensuite la lentille de l’objectif et insérez la deuxième lentille du télescope à relais d’image, L4. Utilisez la platine de translation linéaire pour ajuster la position et l’angle de cette lentille afin de maintenir la collimation et de vous assurer que le faisceau de référence frappe toujours le point marqué au plafond. Remplacez la lentille de l’objectif et insérez la première lentille du télescope, L3. Ajustez la position et l’angle de cet objectif pour assurer la collimation et la non-déviation comme décrit précédemment.Après avoir monté la puce SLM conformément au protocole texte, avec les lentilles alignées, insérez le SLM à la place du miroir. Ajustez la position du SLM de sorte que le faisceau de référence soit situé au centre de la puce SLM et ajustez l’angle de sorte que le faisceau passe à travers les deux lentilles de relais. Vérifiez ensuite que le faisceau de référence est toujours centré sur l’endroit marqué.Montez le ralentisseur variable à cristaux liquides, ou LCVR, avec son axe rapide à 45 degrés par rapport à la polarisation incidente. Ensuite, après avoir terminé l’alignement du rotateur de polarisation selon le protocole de texte, en utilisant la lumière transmise à travers les oculaires, faites la mise au point sur un réticule et fixez la lentille de l’objectif à cette position. Préparez ensuite une monocouche de perles fluorescentes en étalant une goutte de perles multicolores de 100 nanomètres sur un verre de couverture numéro 1,5.Laissez les billes sécher pour les adsorber sur le verre avant de les immerger à nouveau dans l’eau. À l’aide d’huile d’immersion, placez l’échantillon de billes sur l’objectif. Ajustez finement la position de l’appareil photo afin que la couche de billes fluorescentes soit nette.Après avoir généré des motifs de réseau binaire SIM sous forme de fichiers bitmap et les avoir téléchargés dans le SLM conformément au protocole texte, chargez le logiciel de contrôle SLM et cliquez sur Connecter. Dans l’onglet Répertoire, cliquez sur Charger pour ouvrir le fichier de répertoire et vérifier le nombre d’ordres d’exécution contenus dans le fichier. Cliquez sur Envoyer au tableau" pour télécharger le fichier de répertoire sur le SLM.Ensuite, sélectionnez l’onglet « Statut » et entrez le numéro de l’ordre courant. Cliquez sur Sélectionner" pour modifier l’ordre de passage du réseau d’alignement. Insérez un masque spatial, ou SM, monté sur une platine XY dans le trajet du faisceau à la position focale de L3, et transmettez sa position par rapport à l’axe optique de sorte que seuls les premiers ordres souhaités soient passés.Directement après le filtre spatial, seuls deux faisceaux circulaires seront visibles. Vérifiez l’image de la couche de perle fluorescente sur l’appareil photo. Si les deux faisceaux circulaires ne se chevauchent pas comme illustré ici, repositionnez le plan d’échantillonnage, en ajustant de manière itérative l’objectif et la position de la caméra.Après avoir affiné la mise au point et réglé le plan d’échantillonnage selon le protocole de texte, confirmez l’éclairage TIRF en immatriçant, par exemple, une solution de 10 micromolaires de colorant rhodamine 6G en mettant le colorant au point. Si les deux faisceaux sont incidents à l’angle TIRF correct, les molécules uniques seront visibles sans bruit de fond élevé, et les bords de l’ouverture circulaire seront nets. Des ajustements fins de la position des faisceaux peuvent être effectués en ajustant le miroir dichroïque DM3.Pour synchroniser et calibrer le système, placez l’échantillon monocouche de billes sur l’objectif et faites la mise au point. Utilisez le logiciel de contrôle SLM pour programmer le SLM afin qu’il affiche chacune des trois images de déphasage à tour de rôle pour l’orientation du premier motif. Passez ensuite à l’ordre quatre du répertoire d’exemples.Dans le logiciel d’acquisition, configurez l’appareil photo pour la période d’exposition globale en choisissant Propriétés avancées de l’appareil photo et en réglant le type de déclenchement de sortie 1 sur positif et le type de déclencheur de sortie 2 sur négatif. Dans le volet de séquence, sous Type de balayage, sélectionnez Enregistrement sur disque dur et définissez le nombre d’images sur trois. Cliquez ensuite sur Démarrer" pour acquérir trois cadres.Le modèle SLM changera à chaque exposition. Après avoir étalonné le système selon le protocole texte, dans le logiciel de contrôle SLM, basculez l’ordre de fonctionnement SLM sur la série complète de neuf images de réseau binaire requises pour TIRF-SIM. Il s’agit de l’ordre courant zéro dans le répertoire d’exemples.Après avoir acquis neuf images de l’échantillon de billes, dans le volet de séquence du logiciel de l’appareil photo, sélectionnez Enregistrement sur disque dur" comme type de balayage et définissez le nombre d’images sur neuf. Cliquez ensuite sur Démarrer"pour acquérir des images. Enfin, sous Enregistrer les images mises en mémoire tampon, choisissez TIFF comme type d’image, puis cliquez sur OK. Reconstruisez une image en super résolution selon le protocole texte.Sur la photo, des billes fluorescentes multicolores de 100 nanomètres de diamètre ont été imagées pour comparer le TIRF standard au TIRF-SIM. Il est clair que la carte SIM TIRF-SIM avait une résolution latérale nettement supérieure à celle de TIRF. La résolution estimée du microscope est de 90 nanomètres et de 120 nanomètres pour les TIRF-SIM de 488 et 640 nanomètres, respectivement.Cela correspond à une amélioration de deux fois la résolution latérale pour les deux longueurs d’onde par rapport au cas théorique limité par diffraction. Comme on le voit ici, des fibrilles amyloïdes marquées par fluorescence ont été formées in vitro et ont également été utilisées comme échantillon de test pour démontrer une résolution doublée. Les structures subcellulaires à contraste élevé, telles que les microtubules marqués emGFP ou LifeAct-GFP, sont idéales pour l’imagerie TIRF-SIM et produisent des images à contraste élevé et à super résolution.L’imagerie TIRF-SIM à l’aide de la configuration démontrée permet d’observer une sous-population de microtubules située à proximité du cortex basocellulaire, et la polymérisation et la dépolymérisation des microtubules peuvent être observées au fil du temps. Les échantillons à faible contraste sans structures discrètes manquent d’informations à haute résolution, sauf sur les bords de la membrane plasmique, et sont donc sous-optimaux pour l’imagerie TIRF-SIM. Enfin, un contraste de modulation élevé est essentiel pour une imagerie SIM réussie.Comme le démontre ici, la transformée de Fourier de l’image reconstruite permet de visualiser la fonction de transfert optique SIM. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine environ, si toutes les pièces nécessaires ont été acquises. Lorsque vous tentez cette procédure, vous devez être conscient des problèmes les plus critiques pour une mise en œuvre réussie de TIRF-SIM.Tout d’abord, un alignement précis des poutres est essentiel. Cela peut être difficile, car ils doivent être situés sur les bords de l’ouverture de l’objectif. Deuxièmement, il est essentiel que l’état de polarisation de la lumière soit co-tourné avec le motif.Sans cela, le contraste du motif de l’échantillon sera faible et la construction ultérieure de l’image sera impossible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes les plus importantes de la construction et de l’alignement d’un microscope TIRF-SIM basé sur SLM. N’oubliez pas que travailler avec des lasers de classe 3B peut être extrêmement dangereux.La puissance laser doit être maintenue à des niveaux sans danger pour les yeux pendant le processus d’alignement avec l’objectif TIRF en place.

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