Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l'étude des interactions 3D In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de générer des matrices de collagène 3D alignées et aléatoires, dans le but d’observer la migration cellulaire ou d’autres processus cellulaires dans le contexte d’un environnement 3D. Cette méthode est conçue pour capturer les caractéristiques du collagène que nous trouvons dans les tissus réels, ce qui peut aider à répondre aux questions clés telles que les mécanismes que les cellules utilisent pour reconnaître une matrice extracellulaire alignée ou aléatoire. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez manipuler l’organisation de l’environnement 3D, imager les cellules à l’intérieur et vous pouvez le faire de manière rentable avec l’équipement couramment disponible.

En général, les personnes qui découvrent cette méthode auront du mal parce qu’elles ne mélangent pas assez bien la solution de collagène et le tampon de neutralisation et qu’elles aspirent le collagène à travers les canaux de manière incohérente. Brian Burkel, qui est un scientifique principal dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer, mélangez soigneusement le collagène et le tampon HEPES avant d’ajouter des cellules et des milieux pour assurer une bonne neutralisation du collagène.

Ensuite, ajoutez les cellules et les milieux au mélange de collagène neutralisé et placez-le sur de la glace comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Pipetez le mélange glacé dans une surface stérile non traitée pour la culture tissulaire afin de minimiser l’attachement et la croissance des cellules à l’extérieur du gel de collagène. Utilisez une pipette pour répartir uniformément la solution.

Laisser le gel polymériser à température ambiante pendant environ 10 à 15 minutes. Ensuite, couvrez les gels et déplacez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes supplémentaires pour terminer la polymérisation. Lors de la polymérisation, le gel deviendra opaque.

Une fois polymérisé, ajoutez deux à trois millilitres de support. Ensuite, libérez les gels des côtés du puits en passant une pipette de 200 autour du périmètre du puits. Agitez doucement le plat pour libérer le gel de la surface inférieure.

Afin de créer des microcanaux PDMS pour aligner les matrices de collagène. Préparez d’abord un master en silicium SuA, en utilisant les techniques standard de lithographie douce décrites ailleurs. Ensuite, à l’aide d’un bâtonnet d’artisanat, mélangez soigneusement 20 grammes de base en élastomère avec 2 grammes d’agent de durcissement dans un gobelet jetable.

Une fois bien mélangé, dégazez le mélange PDMS en plaçant le gobelet jetable dans une chambre à vide sous une pression de vide de 550 millimètres de mercure. Dégazez le mélange pendant environ une heure à une heure et demie. Lors du dégazage du PDMS, préparez le master en silicone en plaçant une feuille propre de film transparent sur une plaque chauffante, puis en passant par le master en silicium.

Assurez-vous que le moule à micro-canaux est orienté vers le haut. Après une à une heure et demie, retirez le PDMS dégazé de la chambre à vide. Versez lentement le PDMS au centre du maître et laissez la gravité le répartir uniformément.

Ensuite, enroulez soigneusement une deuxième feuille de film transparent sur le maître en silicone et le PDMS pour éviter les bulles d’air. Placez délicatement une feuille de caoutchouc sur le transparent, suivie d’une feuille d’acrylique de 1/8 de pouce, puis ajoutez le premier des trois poids de dix livres sur la feuille d’acrylique. Dans un premier temps, le premier poids flottera, lui permettra de se stabiliser et de se stabiliser avant de procéder avec les deux plaques de poids restantes.

Lorsque vous êtes prêt à continuer, réglez une plaque chauffante à 70 degrés Celsius et durcissez le PDMS pendant quatre heures. Une fois durci, laissez le PDMS refroidir pendant au moins une heure supplémentaire, puis décollez soigneusement le film transparent supérieur de la gaufrette. Enfin, retirez les canaux avec la pince.

Placez les canaux à l’envers sur un nouveau film transparent propre et nettoyez tous les ports à l’aide d’un mouvement circulaire avec des pinces tranchantes. Retirez tous les fragments de PDMS qui se détachent. Ensuite, placez un morceau de ruban adhésif sur le banc, côté collant vers le haut et placez le canal PDMS côté vers le bas sur le ruban adhésif.

Appuyez sur les canaux avec l’extrémité ronde d’une paire de pinces pour assurer un bon contact. Retirez les canaux et répétez ce processus des deux côtés jusqu’à ce que tous les débris visibles aient été éliminés. Ensuite, transférez les canaux PDMS propres et préparés dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 70 % d’éthanol.

Vortex les canaux à vitesse maximale pendant 30 secondes, puis remplacez la solution par de l’éthanol frais à 70 %. À l’aide de techniques aseptiques, transférez le canal PDMS vers le haut, dans une boîte propre et stérile. Ensuite, traitez les canaux par UV jusqu’à ce que l’éthanol se soit évaporé.

Une fois secs, retournez les canaux sur une lamelle ou un plat à fond en verre et appuyez dessus sur le verre pour bien les étancher. Ajoutez un patch de PDMS stérile pour couvrir et fermer la partie centrale des canaux et laissez l’installation sécher complètement avant de continuer. Ensuite, placez une gouttelette de 100 microlitres d’une solution de collagène de 10 microgrammes par millilitre sur le dessus d’un canal et aspirez-la à travers le canal à l’aide d’un vide.

Incuber les canaux à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis transférez les canaux, toujours remplis de solution d’enrobage de collagène, dans un réfrigérateur. Réfrigérez l’appareil pendant environ 15 à 30 minutes, puis utilisez un aspirateur ou une pipette pour retirer la solution d’enrobage de collagène des canaux. Commencez par neutraliser la solution de collagène, diluez-la avec des milieux cellulaires et faites-la incuber sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, placez 120 à 150 microlitres de la solution de collagène dans l’orifice A d’un canal pré-refroidi. Ensuite, fixez une pipette de 25 millilitres à une conduite de vide et placez-la sur le port C. Utilisez-le pour aspirer le mélange par un seul mouvement uniforme, en s’arrêtant une fois que le collagène atteint la fin. L’étape la plus importante pour générer des matrices aléatoires est d’aspirer lentement le collagène à travers le canal.

S’il est aspiré trop rapidement, il entraînera un alignement accru dans la partie du canal ou dans l’ensemble du canal. Retirez soigneusement tout excès de solution des zones de l’orifice, puis placez des patchs PDMS stériles sur les deux ports, A et C.Après deux à trois minutes, retirez le patch PDMS central couvrant l’orifice B et ajoutez deux à trois micro-litières de cellules à une concentration d’un à trois millions de cellules par millilitre dans l’orifice central. Laissez le temps au gel de polymériser partiellement à température ambiante pendant encore 10 à 15 minutes, puis transférez le contrat dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes supplémentaires.

Une fois polymérisé, retirez les couvercles du port PDMS et ajoutez un support pour couvrir complètement le canal. Ici, 50 000 cellules quatre cellules T ont été intégrées dans un gel de collagène de 2 mg / ml ou de 3,5 mg / ml pendant 5 jours. La lignée à quatre cellules T est une lignée de cancer Med Aesthetic hautement contractile, mais elle n’est capable de contracter le gel haute densité que d’environ 10 % Les gels basse densité compatibles sont contractés à 57 % au cours de la même période.

Le degré d’alignement du collagène est modulé par le taux de flux de collagène, de sorte qu’un débit de collagène plus élevé donne un meilleur alignement. L’utilisation de canaux plus étroits couplés à des pressions de vide plus élevées améliore l’alignement du réseau de collagène, tandis qu’un canal plus large utilisé en conjonction avec de faibles pressions de vide génère des matrices aléatoires. Une fois maîtrisé, le versement de gels ou de canaux de collagène peut se faire en deux heures et demie s’il est effectué correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de n’oubliez pas de configurer les composants avant de commencer. Une fois que vous commencez à travailler avec le collagène, vous devez travailler rapidement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire 3D, pour explorer l’adhésion, la migration et l’invasion cellulaires dans des environnements extracellulaires tridimensionnels.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de verser des gels de collagène de différentes densités et de générer des matrices de collagène aléatoires et alignées.