Name: Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour létude des interactions 3D In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Apprenez à préparer des matrices de collagène 3D alignées et aléatoires pour étudier la migration cellulaire et les interactions cellule-ECM. Cette méthode reproduit les caractéristiques tissulaires réelles avec un équipement simple et économique.

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Les auteurs tiennent à remercier les numéros de subvention UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 et T32-GM008692-18 pour le financement de ce travail. Nous reconnaissons également Jeremy Bredfelt et Yuming Liu de LOCI pour le développement et l&#39;assistance à l&#39;analyse CT-FIRE.

1. Neutralisation, Dilution et Polymérisation de collagène Solutions pour la 3D Investigation et cellulaires Contraction Assays <ol><li> Sur la glace dans stérile culture de tissus capuche, neutraliser le collagène (1: 1) avec stérile glacée 100 mM HEPES dans 2x PBS, pH 7,4, dans un tube de 15 ml conique. Bien mélanger avec une pipette en plastique jusqu&#39;à ce que la solution est homogène et des tourbillons de mélange ne sont plus visibles. Veillez à ne pas introduire de bulles d&#39;air pendant le processus de mélange. Stockez brièvement sur la glace. </li><li> Diluer le collagène neutralisé à la concentration appropriée avec des milieux cellulaires (tels que le milieu RPMI, DMEM, etc.). <ol><li> Pour calculer la quantité de collagène neutralisé nécessaire pour compenser la concentration de collagène désirée, utiliser l&#39;équation N = (D * V) / (S / 2), où N est quantité de collagène neutralisé nécessaire, D est la concentration de collagène souhaitée, V est le volume final de la concentration désirée de collagène, et S est un groupe til concentration de départ stock collagène. </li><li> Afficher la quantité de collagène neutralisée au volume par addition d&#39;une solution de cellules et des milieux cellulaires. Bien mélanger et stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt à lancer. <ol><li> Exemple: pour un gel à 2 mg / ml dans un volume de gel de 1 ml (volume typique d&#39;un moulage en gel dans 6 puits de plaque ou de 50 mm de verre plat en bas), d&#39;abord multiplier la concentration désirée (2 mg / ml) par le volume final désiré (1 ml). Prenez ce nombre (2 mg) et le diviser par la moitié de la concentration en actions cotées sur la bouteille (9,49 mg / ml). Dans ce cas, 0,42 ml de collagène neutralisé sont dilués avec 0,58 ml de mélange / support de cellules. </li></ol></li></ol></li><li> Pipet le collagène / cellule / mélange des médias de la glace soit dans une culture non-tissu traité plaque à 6 puits ou un verre plat en bas de 50 mm. Utilisez la pointe de la pipette pour répartir uniformément la solution. Remarque: il est important d&#39;utiliser une culture non tissulaire plaque traitée pour réduire au minimum la fixation ou la croissance des cellules en dehors de la collagen gel. </li><li> Permettre de polymériser à la température ambiante pendant environ 10 - 15 min. Les gels doivent devenir opaque lors de la polymérisation. </li><li> Après qu&#39;il a tourné opaque, déplacer assiette ou un plat à 37 ° C pendant encore 45 - 60 min pour terminer la polymérisation. </li><li> Après 45 - 60 min, ajouter 2 - 3 ml de milieu et de libérer les gels des parois du puits en exécutant une pointe p200 de pipette autour du périmètre du bien ou un plat. Antenne Agiter doucement pour libérer le gel. Le gel de collagène doit être flottant dans un milieu. </li></ol> 2. Western blot, Cell morphogenèse et Gel Gontractility Assay <ol><li> Pour évaluer les niveaux de protéines, la morphologie ou la contractilité cellulaire par rapport à la rigidité ECM, commencer par coulage des gels de collagène, selon 01.01 à 01.06, ensemencé avec des cellules pour une 7 - essai de 10 jours. Déterminer chaque taux d&#39;ensemencement de la lignée cellulaire empiriquement en fonction de taux de croissance et la confluence. Pour un essai de 10 jours, la densité d&#39;ensemencement peut varier de 20.000 - 100.000 cellules / gel. </li><li> Mesurerla contractilité cellulaire, mesurer le diamètre de gel à l&#39;aide d&#39;une règle ou d&#39;une caméra toutes les 24 h ou à l&#39;intervalle de temps approprié. Remarque: En outre, les images correspondantes collectées à partir d&#39;un microscope peuvent être examinés pour rechercher des caractéristiques morphologiques caractéristiques de la lignée cellulaire ensemencée dans le gel, telles que les structures en forme acini, tubules épithéliaux, des saillies cellulaires et lameliapodia. </li><li> Pour évaluer les niveaux de protéines, lyser les gels dans RIPA tampon et le processus d&#39;analyse par Western blot de protéines d&#39;intérêt , comme décrit dans Wozniak et al. 17 et Gallagher et al. 18. <ol><li> IMPORTANT: Dans les comparaisons de la contractilité entre les lignées cellulaires, de normaliser la contractilité à l&#39; ADN total, qui peut être extrait à partir des gels tel que décrit par Lui, et al 19, ou à une invariables, protéine de ménage (histones, GAPDH, etc.) par Western. Une analyse par transfert, comme décrit dans Wozniak et al. , 17 et Gallagher et al. 18. Si le comptage des cellules dans le gel en utilisant un hémocytomètre, assurez-vous de normaliser le nombre de cellules à la surface totale de gel que le gel contractant se concentrera cellules. </li></ol></li><li> gels d&#39;alimentation tous les 3 - 4 jours en enlevant 1 ml de milieu et de le remplacer par 1 ml de milieu frais. Assurez-vous de nourrir gels après la mesure est considérée comme l&#39;ajout de milieu frais / sérum provoque un pic dans la contractilité. </li></ol> 3. Génération de PDMS microcanaux pour l&#39;alignement de collagène fibre Remarque: Pour générer des matrices de collagène alignées, un moule pour PDMS microcanaux (figure 2A) nécessite un maître de silicium SU-8 réalisé par lithographie douce 15. <ol><li> Pour les canaux de PDMS, mélanger soigneusement PDMS dans une tasse jetable avec un bâtonnet. Pour un maître de silicone de 6 pouces, mélanger 20 g de base d&#39;élastomère avec 2 g d&#39;agent de durcissement. </li><li> Dégazer le mélange PDMS en plaçant le gobelet jetable dans une chambre à vide sous une pression de vide550 mm de Hg. De gaz pour les 1 - 1,5 h. </li><li> Alors que de dégazage les PDMS, préparer le maître de silicone pour la coulée. Préparer en plaçant une feuille de film transparent sur une plaque suivie par le maître de silicone. Assurez-vous que le moule de microcanaux vers le haut. REMARQUE: Pendant PDMS coulée et le durcissement, le maître de silicone sera prise en sandwich entre deux feuilles de film transparent. </li><li> Après 1 à 1,5 h, retirer les PDMS de-gazés de la chambre à vide, et verser lentement sur le maître de silicone. IMPORTANT: Éviter les bulles d&#39;air. Continuer à verser dans le centre de maître, et permettre à la gravité de l&#39;étaler uniformément. NOTE: La baisse PDMS n&#39;a pas besoin de prolonger tout le chemin vers le bord du maître. </li><li> Après PDMS a été versé sur le maître, appliquer une deuxième feuille de film transparent au-dessus du maître de silicone et PDMS. Soigneusement, rouler la seconde feuille de transparence sur le dessus du maître PDMS / silicone pour éviter les bulles d&#39;air. Ne vous précipitez pas. PDMS doivent maintenant être réparties uniformément omaître ver. </li><li> Placez délicatement une feuille de caoutchouc sur le dessus de la transparence, suivie d&#39;une &quot;feuille acrylique 1/8. </li><li> Ajouter trois 10 lb poids sur le dessus de la feuille acrylique. Dans un premier temps, les poids seront &quot;flotter&quot;. Leur permettre de régler et de stabiliser avant d&#39;aller plus loin. </li><li> Réglez la température de la plaque chauffante à 70 ° C et la guérison PDMS pendant 4 heures. Laisser refroidir pendant au moins 1 heure supplémentaire avant de déranger. </li><li> Retirer délicatement la feuille supérieure de film transparent de la plaquette, et enlever les canaux avec une pince. </li><li> Magasin dans un plat sans poussière avant d&#39;être prêt à utiliser. </li></ol> 4. Prepping PDMS microcanaux d&#39;emploi <ol><li> La place des canaux à l&#39;envers sur le nouveau film de transparence propre,. Nettoyez tous les ports (Figure 2b) en utilisant un mouvement circulaire avec une forte pince. Retirez tous les fragments de PDMS. </li><li> canaux propres à l&#39;aide d&#39;un morceau de ruban adhésif d&#39;emballage comme un chiffon collant. Appliquer du ruban à la surface du banc (côté collant vers le haut), puis régler le canal on top. Appuyez sur les canaux avec bout rond de pince pour assurer un bon contact. Retirez et répéter sur les deux côtés jusqu&#39;à ce que les débris visibles est enlevé. </li><li> Transfert nettoyée, préparée canaux PDMS dans un cône de 50 ml avec 70% EtOH. Vortex à la vitesse maximale pendant 30 secondes. Jeter EtOH et remplacer avec des produits frais 70% EtOH. Conserver dans 70% EtOH jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Dans le tissu hotte de culture et en utilisant des techniques d&#39;asepsie, transférer les canaux de PDMS à un couvercle en verre propre et stérile ou en verre plats de fond. Mettez le canal vers le haut et UV traitement jusqu&#39;à ce que EtOH a évaporé. </li><li> Une fois sec, retournez les PDMS afin que les canaux sont orientés vers le bas vers la lamelle. Appuyez sur le canal PDMS vers le bas sur le verre pour faire une bonne étanchéité. Ajouter un patch de PDMS stériles pour couvrir / fermer le centre port (port B, Figure 2b). Laisser sécher complètement avant de poursuivre. </li><li> Précouche à l&#39;intérieur du canal avec 10 pg / ml de collagène dans de l&#39;eau stérile. Pour revêtir, placer une gouttelette de 100 pi sur le sommet d&#39;une channel, et tirer au travers avec le vide. Au bout de 1 h à 37 ° C, les canaux de transfert remplis de solution de revêtement de collagène pour un réfrigérateur. Réfrigérer pendant environ 15 - 30 min. </li><li> Éliminer la solution de revêtement de collagène avec aspiration ou d&#39;une pipette, et pour commencer la préparation de collagène. </li></ol> 5. Collagène Préparation à l&#39;utilisation dans des microcanaux <ol><li> Sur la glace, neutraliser le collagène (1: 1) avec de la glace à froid 100 mM HEPES dans 2x PBS, pH 7,4. Bien mélanger jusqu&#39;à homogénéité (Pour plus de détails, voir la section 1.1). </li><li> Diluer collagène neutralisé aux concentrations appropriées avec les médias de la cellule (Pour plus de détails, voir la section 1.2). Incuber pendant 15 min sur la glace. </li><li> Dans le même temps, froid canaux sur la glace monté. NOTE: Le but est d&#39;avoir tous les composants pour le processus de canal à 4 ° C ou moins. Collagène température et le temps nucléation sont des paramètres clés du processus de polymérisation, et peut être le point de départ pour une optimisation plus poussée, si nécessaire. </li><li> Count cellules avec un hémocytomètre et resuspendre à la densité de semis appropriée à ce moment. Pour la facilité de calcul, la remise en suspension à 1 - 3 millions de cellules / ml. (Pour plus de détails, voir également la section 2.1). </li><li> Une fois que les cellules ont été comptées et 15 min ont passé, procéder au collagène de coulée. </li></ol> 6. Verser alignés et Random collagène microcanaux <ol><li> Avant de dessiner le collagène à travers des canaux, ajuster et régler la pression à vide avec un régulateur de vide en ligne. la pression de vide fournit la force pour induire et contrôler le débit d&#39;écoulement du collagène, qui détermine le degré d&#39;alignement. <ol><li> Pour les matrices aléatoires ou non alignés, utilisant un large canal (3 mm de large x 200 um de hauteur) avec une pression de vide de 10 mm Hg ou moins. </li><li> Pour les matrices alignées, utiliser le canal étroit (1 mm de largeur x 200 um de hauteur) avec une pression de vide de 60 mm Hg ou plus. </li></ol></li><li> Supprimer la chaîne montée de la glace et placer sur surface propre, aseptisée de flux laminaire hood. </li><li> Travaillez rapidement et charger 120 - 150 pi de collagène neutralisé dans le port A (Figure 2b). </li><li> Tirer le collagène dans le canal en plaçant un 25 ml de pipette attaché à la canalisation à vide au- dessus de l&#39; orifice C (figure 2b). Dessinez le collagène par le biais d&#39;un seul mouvement uniforme. IMPORTANT: Pour les matrices aléatoires ou non alignés, dessiner collagène lentement à travers le canal (environ 0,5 à 1 mm par seconde), et arrêter une fois qu&#39;il atteint la fin. Pour les matrices alignées, dessiner le collagène dans plus rapidement, mais prendre soin d&#39;éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Retirez soigneusement l&#39;excès de collagène de la région portuaire avec Pipetman P200 ou aspirateur. </li><li> Placez PDMS patchs stériles sur les deux ports A et C. Tous les ports doivent maintenant être couverts. </li><li> Après 2 - 3 minutes, retirez centre correctif PDMS (port B) et ajouter 2 - 3 pi de cellules (5 - 10 000 cellules) dans le port central. Laisser polymériser partiellement (tourner opaque) à la température ambiante pendant 10 - 15 min. </li><li> Au bout de 10- 15 min, transfert à 37 ° C pendant plus de 15 - 30 minutes pour terminer la polymérisation. Oter les couvercles PDMS et ajouter des médias pour couvrir complètement les cellules de canal et de la culture au besoin. Les cellules peuvent être alimentées par la suppression d&#39;un ml d&#39;anciens supports, et en le remplaçant par un ml de nouveaux supports. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler

gels de collagène 3D sont un ajout précieux à notre boîte à outils pour comprendre comment les cellules interprètent et répondre à leur microenvironnement local. Ce manuscrit a fourni un protocole très simple pour l&#39;intégration des cellules dans une matrice de collagène 3D et pour générer de manière reproductible des matrices de fibres de collagène ou aléatoires alignées. Les deux protocoles fonctionnent comme des plates-formes adaptables où les différentes isoformes de collagène, des agents de réticulation, ou d&#3...

De nombreux processus cellulaires ont été largement étudiés en 2 dimensions, formant ainsi une connaissance collective des mécanismes de signalisation cellulaire de base. Cependant, ces études négligent d’importants indices cellulaires reçus des propriétés structurelles et mécaniques du microenvironnement cellulaire local et de la matrice extracellulaire (MEC). Pour mieux comprendre comment les cellules interagissent dans un contexte physiologique, il est important de les étudier dans des tests tridimensionnels (3D). L’ECM pour ces tests 3D peut être soit dérivée de cellules, soit reconstituée à partir de protéines purifiées. Quelle que soit la source de l’ECM, les tests matriciels 3D se sont avérés inestimables pour comprendre comment les cellules naviguent et interagissent dans le monde physiologique. Par exemple, les cellules cultivées dans des matrices 3D présentent des modes de locomotion distincts qui dépendent de la nature mécanique de leur ECM environnante, qui ne sont pas observés dans les expériences 2D4-6. De plus, les cellules cultivées en 3D ont également des fibres de stress et des adhérences focales moins nombreuses et moins prononcées que leurs homologues cultivées sur des surfaces dures telles que le verre ou le plastique7. 
L’importance des tests 3D contextuels ne se limite cependant pas à la migration cellulaire. Certains autres événements de signalisation cellulaire ne peuvent être étudiés que par l’utilisation de tests 3D. Au cours de la différenciation tissulaire et cellulaire, la rigidité de l’environnement extracellulaire et la MEC fournissent des signaux qui peuvent influencer les événements morphogéniques. Par exemple, la tubulogenèse épithéliale mammaire ne se produit que dans les matrices 3D de faible rigidité, mais pas dans les matrices rigides ni sur les substrats 2D8,9. Lorsqu’elles sont cultivées dans des matrices 3D rigides, ces mêmes cellules épithéliales adoptent un phénotype aberrant avec une prolifération accrue et des protubérances membranaires cellulaires entraînées par une altération de la signalisation FAK et ERK10. De nombreuses autres voies de signalisation et processus cellulaires sont connus pour être affectés de manière similaire par la rigidité de l’environnement cellulaire local, et ces cascades de signalisation soulignent l’importance d’étudier les événements de signalisation et le phénotype cellulaire dans le contexte des propriétés mécaniques locales appropriées d’une ECM 3D. 
Le collagène I est une protéine particulièrement pertinente à utiliser pour les études in vitro car c’est le composant le plus abondant de l’ECM et est responsable de nombreuses propriétés mécaniques du microenvironnement cellulaire. Alors qu’elle était à l’origine considérée comme une simple protéine structurelle, son rôle est maintenant connu pour être beaucoup plus complexe. La composition, l’architecture, l’orientation, la densité et la rigidité des fibres de collagène fournissent tous un milieu concentré d’informations de signalisation5. Au cours de la progression de certaines maladies, telles que l’inflammation chronique et la tumorigenèse, le réseau de collagène est considérablement remodelé2,11. Plus précisément, dans les cancers du sein, l’augmentation du dépôt de collagène et la rigidité des tissus accompagnent et contribuent probablement à la progression tumorale. Dans ces tumeurs précoces, le réseau de collagène raidi semble tendu et plus aligné, de sorte que la plupart des fibres encapsulent la tumeuren croissance 2. Au fur et à mesure que la tumeur progresse, le collagène continue de se réorganiser et les régions du réseau fibrillaire s’orientent perpendiculairement à la limite tumorale2,12. L’alignement perpendiculaire sert de biomarqueur pronostique lorsque ces patients ont une progression sans maladie et une survie globale plus faibles1. L’une des explications de cette corrélation est que les mauvais résultats sont la conséquence d’une dissémination accrue des cellules tumorales via une migration cellulaire persistante dans des réseaux de collagène alignés3. 
Pour comprendre comment les cellules répondent spécifiquement à l’alignement et à l’organisation observés dans la progression tumorale, il est nécessaire de générer des matrices de collagène 3D aléatoires et alignées pour l’expérimentation. Il existe trois méthodologies de base pour induire l’alignement au sein des réseaux fibrillaires. La première technique utilise un dispositif induisant une tension où le collagène entre deux points est contracté ou étiré pour générer un alignement. Les fibres parallèles à l’axe de force sont tendues tandis que les fibres perpendiculaires à l’axe sont comprimées et déformées. Alors que les techniques induites par la déformation offrent généralement un excellent alignement, cette approche nécessite un équipement encombrant qui n’est pas facilement adaptable à de nombreuses plates-formes3,13. Alternativement, une tension induite par les cellules peut être créée en plaçant des bouchons localisés de cellules qui se contractent et alignent ensuite le collagène13. Cette méthode a le problème d’être variable, car de nombreux paramètres peuvent être sujets à changement. La deuxième méthode utilise des billes magnétiques et un champ magnétique pendant la polymérisation pour induire l’alignement du collagène13,14. De bons résultats peuvent être obtenus avec cette méthode avec un équipement peu sophistiqué, mais elle nécessite l’utilisation d’anticorps ou d’une autre méthode pour magnétiser le polymère. Par conséquent, il peut être quelque peu coûteux à utiliser, et la rigidité du gel de collagène est potentiellement modifiée par l’augmentation des connexions dans le réseau. De plus, les billes magnétiques utilisées dans ce processus sont souvent autofluorescentes, ce qui est problématique pour les expériences d’imagerie. Enfin, l’alignement peut être généré par les canaux microfluidiques PDMS3,15,16. Dans cette méthode, l’alignement du collagène est réalisé en faisant circuler le collagène polymérisé à travers de petits canaux microfluidiques. Ces canaux microfluidiques peuvent être réalisés dans une multitude de conceptions et sont facilement adaptables à de nombreuses plateformes. De plus, ils sont très économiques car de très petites quantités de collagène et d’autres réactifs sont utilisées en raison de leur petite taille.
Voici un protocole simple pour intégrer des cellules dans un hydrogel de collagène fibrillaire en 3 dimensions. De plus, une technique plus avancée, dans laquelle des canaux microfluidiques PDMS sont utilisés pour contrôler l’organisation et l’alignement de la matrice de collagène, est également fournie. Ce protocole est facilement adaptable à de nombreuses plateformes et peut générer de manière reproductible des matrices de collagène alignées et aléatoires pour l’étude de la migration cellulaire, de la division cellulaire et d’autres processus cellulaires dans un microenvironnement physiologique tridimensionnel.

<table><tbody><tr><td>Collagène haute concentration queue de rat</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>SylGard184 kit élastomère</td><td>Corning</td><td>NC9285739</td><td>Élastomère pour canaux PDMS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310</td><td>Pour tampon de neutralisation HEPES</td></tr><tr><td>KCl&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Pour tampon de neutralisation HEPES</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td>Pour tampon de neutralisation HEPES</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374</td><td>Pour tampon de neutralisation</td></tr><tr><td>HEPES NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Pour tampon de neutralisation HEPES</td></tr><tr><td>Levy Hémacytomètre Neubauer Fisher</td><td></td><td>15170-208</td> amélioré <td></td></tr><tr><td>à 6 puits de comptage</td> de cellules<td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre de 50 mm</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Dessiccateur sous vide en plastique</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>Chambre de dégazage pour film transparent PDMS</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>Film plastique pour couler des canaux pdms</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp ;</td><td>HP141925</td><td>Plaque chauffante pour le durcissement des microcanaux PDMS</td></tr><tr><td>Régulateur de vide</td><td>Precision Medical</td><td>PM3100</td><td>Régulateur de vide pour microcanaux de collagène</td></tr><tr><td>Feuille de caoutchouc 8 » x 8 » Amazon</td><td>- Rubber-Cal</td><td>Silicone - Feuille</td><td>de caoutchouc 60A pour couler le microcanal PDMS</td></tr><tr><td>8 » x 8 » x 0,125 » Feuille acrylique</td><td>Amazon</td><td>Plaques de plexiglas</td><td>pour verser les microcanaux PDMS</td></tr><tr><td>Poids de 10 lb</td><td>Amazon</td><td>CAP Barre</td><td>pour verser des microcanaux PDMS</td></tr><tr><td>Tubes coniques</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en plastique</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B et 667225B</td><td>2&nbsp ; ml, 5 nbsp ; ml, et 25&nbsp ; ml</td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td>Fisher</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de la 3d collagène gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3d<em&gt; in vivo</em

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historiquement, la plupart des processus cellulaires n’ont été étudiés qu’en 2 dimensions. Bien que ces études aient été informatives sur les mécanismes généraux de signalisation cellulaire, elles négligent d’importants signaux cellulaires reçus des propriétés structurelles et mécaniques du microenvironnement local et de la matrice extracellulaire (ECM). Pour comprendre comment les cellules interagissent au sein d’une MEC physiologique, il est important de les étudier dans le contexte de tests en 3 dimensions. La migration cellulaire, la différenciation cellulaire et la prolifération cellulaire ne sont que quelques-uns des processus qui se sont avérés être influencés par des modifications locales des propriétés mécaniques d’une MEC tridimensionnelle. Le collagène I, un composant fibrillaire central de l’ECM, est plus qu’un simple élément structurel d’un tissu. Dans des conditions normales, les signaux mécaniques du réseau de collagène dirigent la morphogenèse et maintiennent les structures cellulaires. Dans les microenvironnements malades, tels que le microenvironnement tumoral, le réseau de collagène est souvent remodelé de manière spectaculaire, démontrant une composition altérée, un dépôt amélioré et une organisation des fibres altérée. Dans le cancer du sein, le degré d’alignement des fibres est important, car une augmentation des fibres alignées perpendiculairement à la limite de la tumeur a été corrélée à un pronostic plus sombre de la patiente1. L’alignement des matrices de collagène entraîne une dissémination accrue des cellules tumorales via la migration persistante2,3. Ce qui suit est un protocole simple pour intégrer des cellules dans un hydrogel de collagène fibrillaire en 3 dimensions. Ce protocole est facilement adaptable à de nombreuses plateformes et peut générer de manière reproductible des matrices de collagène alignées et aléatoires pour l’étude de la migration cellulaire, de la division cellulaire et d’autres processus cellulaires dans un microenvironnement physiologique tridimensionnel accordable.

Alors que les tests 3D peuvent être faits dans la même rigidité de gel de collagène, de faire varier la rigidité du gel peut être utilisée pour déterminer comment les cellules répondent à des changements mécaniques dans leur microenvironnement cellulaire. Un hydrogel de collagène rigide est défini comme un gel dans lequel les cellules incorporées ne sont pas capables de contracter localement le collagène environnant. La contractilité intrinsèque des différents types de cellules est uniqu...

Le collagène est une composante essentielle de l&#39;ECM, et fournit des indices essentiels pour plusieurs processus cellulaires allant de la migration vers la différenciation et la prolifération. Pourvu ici est un protocole pour l&#39;intégration des cellules dans les hydrogels de collagène 3D, et une technique plus avancée pour générer des matrices de collagène randomisées ou alignées à l&#39;aide de microcanaux PDMS.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des matrices de collagène tridimensionnelles alignées et aléatoires, afin d'observer la migration cellulaire ou d'autres processus cellulaires dans un environnement tridimensionnel. Cette méthode est conçue pour reproduire les caractéristiques du collagène présentes dans les tissus réels, ce qui peut aider à répondre à des questions clés, telles que les mécanismes utilisés par les cellules pour reconnaître une matrice extracellulaire alignée ou aléatoire. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de manipuler l'organisation de l'environnement tridimensionnel, d'observer par imagerie les cellules à l'intérieur de celui-ci, et de réaliser ces expériences de manière économique avec du matériel couramment disponible.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles n'homogénéisent pas suffisamment la solution de collagène et le tampon de neutralisation, et elles aspirent le collagène à travers les canaux de manière irrégulière. Cette procédure sera démontrée par Brian Burkel, chercheur senior dans mon laboratoire. Pour commencer, mélangez soigneusement le collagène et l

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Apprenez à préparer des matrices de collagène 3D alignées et aléatoires pour étudier la migration cellulaire et les interactions cellule-ECM. Cette méthode reproduit les caractéristiques tissulaires réelles avec un équipement simple et économique.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l'étude des interactions 3D

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