Name: siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Apprenez la transfection siRNA et l'analyse EMSA sur des cytotrophoblastes villositaires humains fraîchement isolés. Cette méthode efficace facilite l'étude des interactions ADN-protéines et de la régulation génique placentaire.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la sciences et en génie du Conseil national du Canada (CRSNG) (# 298527) (BB). CT a été soutenu par une bourse de FARE institutionnelle. AV a été soutenu par un doctorat du CRSNG Graham Bell Bourse d&#39;études. BB titulaire d&#39;une chaire de recherche du Canada en rétrovirologie humaine (niveau 2). Merci à Beatrix Beisner de l&#39;aide dans la révision du texte.

Le comité d&#39;éthique de l&#39;UQAM a approuvé ces protocoles, qui sont en conformité avec les directives du comité d&#39;éthique de l&#39;Hôpital St-Luc du Centre hospitalier universitaire de Montréal (Montréal, Canada). Les participants ont signé un formulaire de consentement éclairé. 1. Moyen Préparation et isolement de primaires villosités cytotrophoblastes <ol><li> Préparer un milieu de culture pour les cytotrophoblastes villeux primaires humains en complétant Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 25 mM de HEPES, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Filtrer le milieu préparé à travers un filtre de 0,22 um stérile et stocker dans un congélateur à -20 ° C en aliquotes de 50 ml. </li><li> Isoler cytotrophoblastes villosités primaires de placentas frais suivants protocoles standard 3. <ol><li> En utilisant des pinces, retirer la membrane foetal à partir du tissu en grattant doucement le tout, en prenant soin de ne pas enlever le tissu villeux. Coupe lerestante villosités placentaires en cubes d&#39;environ 3 x 3 cm à l&#39;aide de scalpel et les ciseaux. Laver soigneusement avec de l&#39;eau contenant 0,9% de NaCl pour éliminer le sang maternel. <ol><li> Tenir chaque cube avec une pince, retirer délicatement le tissu villeux de navires restants et des ciseaux de tissu fibreux à l&#39;aide. </li><li> 15 à 30 mg de tissu villeux, digèrent quatre fois dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant de la trypsine ( à partir de 9,6 x 10 5 à 1,8 x 10 6 U; concentration finale 1,2 mg / ml) et de la désoxyribonucléase I (DNase I) ( une concentration finale de 200 pg / ml) pendant 30 min à 37 ° C dans un bain-marie avec une agitation continue. Remarque: Utilisez 150 ml volume total pour la première digestion, 100 ml pour la deuxième digestion et 75 ml pour les deux digestions restants. </li></ol></li><li> Recueillir le surnageant contenant des cellules dispersées et centrifuger à 1.250 xg pendant 15 min sans frein. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de DMEM contenant préchauffée1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Couche des cellules dispersées au - dessus d&#39;un 5% discontinu - 70% gradient de silice polyvinylpyrrolidone revêtu (voir le tableau 1 pour la préparation gradient) et centrifuger pendant 23 min à 507 xg sans frein. Enlever la couche de densité entre 1,017 à 1,033 par aspiration et collecte des couches entre 40% et 50% du gradient avec une nouvelle pipette. Laver les cellules abondamment avec 10 ml de pré-chauffé DMEM contenant 1% de pénicilline / streptomycine. Note: La fraction recueillie correspond à des densités entre 1.048 et 1.062, qui abrite les trophoblastes. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. En bref, mélanger des cellules et ajouter 10 ul dans un nouveau tube. Ajouter 10 pi de bleu trypan et mélanger doucement à nouveau. Dresser la suspension cellulaire et remplir les chambres de hémocytomètre. Compter les cellules sous objectif 10X. </li><li> Placez 1 x 10 6 et 4,5 x 10 6 cellules dans des tubes séparés pour une utilisation dans les sections 1.3 et 2, respectivementl y. Ensemencer les cellules restantes à une densité de 1,5 x 10 6 cellules / puits dans du milieu DMEM additionné et de la culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant un maximum de 4 jours pour les autres expériences. </li></ol></li><li> L&#39;évaluation de la pureté des villosités primaires isolées cytotrophoblastes <ol><li> Spin 1 x 10 6 des cytotrophoblastes fraîchement isolées dans des tubes à centrifuger à 300 x g. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de solution salée préchauffée tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger les cellules à 300 xg et supprimer PBS par aspiration. </li><li> Ajouter 1 ml de methanol froid aux cellules et on incube à -20 ° C pendant 20 min. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 minutes et éliminer le methanol par aspiration. Attention: Utiliser un masque à cartouche, lunettes de protection et des gants de caoutchouc lors de la manipulation du méthanol. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS à la température ambiante pour réhydrater les cellules, centrifuger à 300 xg et enlever PBS par aspiration. </li><li> Incuber les cellules dans du PBS contenant du FBS (1:50 [v / v] dilution) et un FcRun réactif de blocage (1:10) pendant 45 min à température ambiante pour éliminer la liaison non spécifique. </li><li> Laver deux fois avec 500 pi de la température ambiante PBS, les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min et retirez PBS par aspiration. Resuspendre les cellules dans 100 ul de PBS température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec un isothiocyanate d&#39;anticorps monoclonal de souris de fluorescéine (FITC) LP5K anti-humain de la cytokératine-7 clone d&#39;anticorps (1: 200) ou un anticorps de contrôle correspondant à l&#39;isotype non spécifique dans du PBS contenant 0,2% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante l&#39;obscurité. Laver les cellules dans du PBS. </li><li> Analyser les cellules par cytométrie en flux 3. Utiliser des préparations cellulaires, qui font preuve d&#39;un minimum de 96% de cellules CK-7 positives par cytométrie de flux pour d&#39;autres expériences. </li></ol></li></ol> 2. siRNA Transfection des droits primaires villosités cytotrophoblastes <ol><li> Transfection de cytotrophoblastes villosités primaires humains en utilisant un dispositif de microporation <ol><li> Préparer des plaques à 6 puits contenant2 ml de milieu DMEM additionné pour l&#39;incubation des cellules micropore. </li><li> Après isolement de cytotrophoblastes primaires (voir section 1.2), prélever une aliquote de cellules en suspension et de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Transférer 1,5 x 10 6 cellules à un microtube et un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Laver les cellules avec 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -free) et sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules doucement dans 100 ul de tampon de remise en suspension. Note: Eviter maintenir la suspension de cellules pendant plus de 15 à 30 min à température ambiante, afin de maximiser la viabilité cellulaire et de l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Ajouter 300 ng de syncytine-2 siRNA (ou control-brouillées siRNA) au tube de 1,5 ml et aspirer le mélange de cellules-siRNA en utilisant une transfection pipette 100 pi. Insérerla pipette dans la station (voir la liste des matériaux) et soumettre les cellules à une impulsion unique de 30 msec 1300 V. </li><li> Transférer immédiatement les cellules à des plaques 6 puits (préparé à l&#39;étape 2.1.1) contenant 37 ° C préchauffé milieu supplémenté pour éviter des dommages aux cellules. </li><li> Répétez les étapes 2.1.5 et 2.1.6 pour les échantillons restants. </li><li> Agitez doucement la plaque pendant 30 secondes pour assurer une distribution des cellules. Incuber la plaque à 37 ° C dans un humidifié incubateur à CO2 pendant 24 à 48 heures. Actualisez milieu de culture 24 heures après la transfection. </li><li> Évaluer l&#39;efficacité de transfection par analyse Western blot (voir les étapes 3 à 6). </li></ol></li><li> Lipofection de siRNA dans les cytotrophoblastes primaires humaines <ol><li> Après isolement de cytotrophoblastes villeux, ensemencer les cellules à une densité de 1,5 x 10 6 cellules par puits dans des plaques à 6 puits dans 2 ml de milieu de culture et mettre à incuber pendant 18 heures. </li><li> Diluer 300 ng de syncytine-2 spécifique siRNA (ou brouillés contrôle-ARNsi) et 5 ul de réactif de transfection à base de lipides dans des tubes séparés de 1,5 ml dans un volume total de 10 ul de milieu aux antibiotiques et sans sérum. Incuber pendant 5 min. </li><li> Mélanger les réactifs dilués et laisser incuber pendant 20 minutes supplémentaires à la température ambiante pour former le complexe de transfection. Ajouter 90 ul de milieu sans sérum et aux antibiotiques, au mélange à un volume final de 100 ul. </li><li> Éliminer le milieu de culture à partir des plaques à 6 puits (étape 2.2.1). Ajouter 2 ml de milieu frais et le mélange de transfection de 100 ul dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant 24 à 48 heures. Actualisez milieu de culture 24 heures après la transfection. </li><li> Évaluer l&#39;efficacité de transfection par analyse Western blot (voir les étapes 3 à 6). </li></ol></li></ol> 3. Préparation de lysats de toute la culture cellulaire <ol><li> Retirez le support et rincer chaque puits ( à partir des étapes 2.1.8 et 2.2.4) en utilisant DPBS pré-chauffé (Mg 2+, Ca 2+ libre). Aspirer le DPBS et ajouter 500 pi de trypsine à 0,25% d&#39;acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Incuber pendant 1-3 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2. Arrêter le traitement de la trypsine en ajoutant 500 ul de sérum contenant du milieu de croissance. Note: Utiliser le volume des médias appropriés selon le type de flacon / plat: 1 ml par 10 7 cellules / boîte de 100 mm / 150 cm 2 flacon; 0,5 ml par 5 x 10 6 cellules / boîte de 60 mm / 75 cm 2 flacon. </li><li> Transfert des cellules dans un tube de 1,5 ml, un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 2 min à température ambiante. Laver les cellules avec du DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) et un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 2 min à température ambiante. </li><li> Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot. Placer le tube sur la glace. Reprendre le culot dans 50-200 ul Radio-immunoprécipitation Assay (RIPA) tampon glacée (voir le tableau 2 pour la composition du tampon) contenant fraîchement ajoutered protéase et d&#39;inhibiteurs de phosphatase à une concentration finale 1x. En bref, le tube vortex et laisser sur la glace pendant 30 min. </li><li> Spin à 16.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Placez délicatement le tube sur la glace. En utilisant une pipette, transférer le surnageant dans un tube à centrifuger pré-refroidi frais conservés sur la glace. Jeter le culot. </li></ol> 4. Préparation des extraits nucléaires de cellules cultivées <ol><li> Pour chaque puits (étape 1.2.5), laver cytotrophoblastes culture deux fois avec 1 ml de pré-chauffé DPBS (Mg 2+, Ca 2+ libre). Aspirer DPBS et ajouter 500 pi de 0,25% de trypsine / EDTA. Incuber pendant 1-3 min à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 et d&#39; arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant 500 ul de sérum contenant du milieu de croissance. </li><li> Transfert des cellules dans un tube de 1,5 ml, un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 2 min à température ambiante. Laver les cellules avec du DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) et un culot de cellules par centrifugation ,à 300 g pendant 2 min à température ambiante. Retirez délicatement tout surnageant sans perturber le culot et placer le tube sur la glace. </li><li> Extraire la protéine nucléaire selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration en protéine de chaque échantillon en utilisant un dosage de protéine de quantification (Bradford ou un dosage à l&#39;acide bicinchoninique (BCA)). </li></ol> 5. Préparation des échantillons et Électrophorèse <ol><li> Déterminer la concentration en protéines de chaque extrait cellulaire en utilisant un dosage de protéine de quantification (par exemple, Bradford 8 ou 9 BCA). </li><li> Selon les instructions du fabricant (si les anticorps pourraient être utilisés dans la réduction et la dénaturation des conditions), ajouter un volume égal de 2x Laemmli Sample Buffer (tableau 2) à 20-30 ug de protéine totale. </li><li> Faire bouillir les lysats cellulaires à 100 ° C pendant 5 min. Aliquoter 50-100 ul de lysat pour éviter les cycles / de congélation-décongélation répétés et stocker les tubes restants à -20 ° C pour une utilisation future. </li&gt; <li> Tandis que les échantillons sont le chauffage, la préparation de 1 litre de 1 x tampon en cours d&#39; exécution (tableau 2). </li><li> Faites tourner les échantillons à 16.000 xg pendant quelques secondes et placez-les sur la glace. </li><li> Charger la même quantité de protéine dans chaque puits d&#39;un gel SDS-PAGE à 12% (voir le tableau 2 pour la composition de gel), avec un marqueur de poids moléculaire. Exécutez le gel pendant 1-2 heures à 100 V. </li></ol> 6. Le transfert de la protéine à partir du gel à la membrane <ol><li> Activer le fluorure de polyvinylidène (PVDF) avec du methanol pendant 1 min, puis rincer avec une solution tampon / 10% de méthanol de transfert de 1x. Selon les instructions du fabricant, le transfert pendant 30 minutes à 1 heure selon la taille de la protéine. Remarque: L&#39;efficacité du transfert peut être évaluée en utilisant Ponceau Rouge coloration avant l&#39;étape de blocage. </li></ol> 7. Anticorps Staining <ol><li> Bloquer la membrane pendant 1 heure à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C en utilisant une solution de blocage de 5%. </li><li> Incuber la membrane avec des anti-syncytine-2 anticorps (4 ug / ml; 1: 5000) 6 ou avec un anticorps anti-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) dans une solution de blocage de 5% pendant une nuit à 4 ° C (anti-syncytine-2) ou pendant 45 min à température ambiante. Laver la membrane trois fois dans une solution saline tamponnée au Tris Tween (TBST; voir le tableau 2 pour la composition du tampon) pendant 5 min. </li><li> Incuber la membrane avec de la peroxydase de raifort approprié (HRP) conjugué à anti-lapin ou un anticorps anti-souris (1: 10000) dans un tampon de blocage 5% dans du TBST à température ambiante pendant 1 h. Laver la membrane trois fois dans TBST pendant 5 minutes, puis rincer à TBS. Détecter les signaux en utilisant le substrat à base de blot chimioluminescence. </li></ol> 8. radiomarquage de Single Stranded Oligonucleotide <ol><li> réaction de phosphorylation <ol><li> Dans un microtube, ajouter 50 ng d&#39;un oligonucléotide avec un tampon avant le long de polynucleotide kinase T4 1x, U 1T4 polynucleotide kinase et 20 uCi (γ- 32 P) ATP et de faire augmenter le volume de réaction à 20 pi avec de l&#39; eau sans nucléase. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Arrêter la réaction en ajoutant 5 ul de 0,5 M d&#39;EDTA. Compléter le volume à 50 ul avec de l&#39;eau sans nucléase. </li></ol></li><li> L&#39;élimination des nucléotides non constituées à partir d&#39;oligonucléotides <ol><li> Préparer une colonne G-25 équilibrée avec du tampon TE (tableau 2) suivant les instructions du fabricant. Placer la colonne dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse sans DNase frais. </li><li> Ajouter lentement 50 pi de sonde (de l&#39;étape 8.1.2) sur la résine, en faisant attention à ne pas perturber le lit de résine. Centrifugation pendant 2 minutes à 350 x g pour recueillir l&#39;échantillon purifié dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Laver la colonne G-25 avec 36 pi d&#39;eau sans nucléase et de spin pendant 2 min à 350 xg pour les recueillir dans le tube à centrifuger. </li></ol></li><li> Hybridation avec le brin complémentaire oligonucleotide <ol><li> Transférer la sonde radiomarquée (86 ul) dans un tube de 1,5 ml et ajouter 200 ng de l&#39;oligonucléotide inverse et 1x de tampon d&#39;hybridation ( voir le tableau 2). Pendant 5 min à 95 ° C et on laisse une nuit à température ambiante pour refroidir. </li><li> Préparer des oligonucléotides double brin non radioactifs en ajoutant 50 ng de non marqué avant et arrière oligonucléotides et 1x de tampon de recuit dans un tube de 1,5 ml. Compléter le volume à 100 pi avec de l&#39;eau sans nucléase. La chaleur et maintenir à la température ambiante comme décrit à l&#39;étape 8.3.1. </li></ol></li></ol> 9. Préparation d&#39;un gel de polyacrylamide non dénaturant pour EMSA <ol><li> Préparer un gel natif de 4% (10 x 12 cm) avec un 1,5 mm d&#39; espace-peigne (voir le tableau 2 pour la composition de gel). Nettoyer les plaques de verre à l&#39;aide d&#39;eau distillée. Remarque: Il est essentiel que les plaques soient totalement exempts de détergent ionique, comme SDS. </li><li> Immédiatement pnotre solution d&#39;acrylamide entre les plaques et permettre à la polymérisation de procéder (environ 30 minutes). </li><li> Assembler l&#39;appareil d&#39;électrophorèse et remplir le réservoir avec 0,5x TBE. Pré-exécuter le gel pendant 30 min à 1 h à 150 V avant le chargement des échantillons. </li></ol> La réaction de liaison 10. ADN <ol><li> Dans un tube de 1,5 ml, ajouter 10 pg d&#39;extrait nucléaire (étape 4.3) 1x Gel Décalage reliure tampon (tableau 2) et compléter le volume final à 10 pi avec de l&#39; eau sans nucléase. Comme témoin, on prépare un tube sans extrait nucléaire. Pour la réaction de la concurrence, ajouter 1 pl d&#39;oligonucléotide froid non spécifique ou spécifique double brin (étape 8.3.2). </li><li> Ajouter 1 pl de sonde radioactive de l&#39;étape 8.3.1 à chaque réaction. Laisser incuber la réaction à température ambiante pendant 20 min. Ajouter 1 pi de tampon de charge 10x gel par réaction et charger chaque échantillon sur le gel préparé à l&#39;article 9. </li><li> Exécutez le gel pendant 1 1/2 à 2 heures à 150 V. Après la migration, enveloppez le gel et le verre dans une pellicule de plastique et de la position dans une cassette d&#39;exposition au-dessous d&#39;un écran luminescent. Laissez la cassette à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Retirez l&#39;écran de la cassette d&#39;exposition et l&#39;insérer dans le dispositif d&#39;imagerie de phosphore pour la numérisation. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les études sur la fonction placentaire humaine et le développement ont été grandement améliorées par des protocoles visant à optimiser l&#39;isolement des différentes populations de cellules placentaires. L&#39;un des meilleurs population de cellules placentaires étudiée reste les cytotrophoblastes villeux, dont l&#39;étude a grandement bénéficié de protocoles optimisés permettant l&#39;isolement efficace et fiable. Cela a permis en outre un certain nombre d&#39;expériences, telles que des études de transfection et de p...

Le dysfonctionnement placentaire humain est associé au développement de plusieurs maladies associées à la grossesse comme la prééclampsie et le retard de croissance intra-utérin 1. Les trophoblastes constituent un constituant cellulaire important du placenta, qui peuvent être classés en cytotrophoblastes extravillositaires ou villeux. Lors de la fusion, les cytotrophoblastes villeux se différencient davantage en la couche syncytiotrophoblaste, une structure cellulaire multinucléaire jouant un rôle important dans l’échange fœto-maternel et la production d’hormones 2. Les cytotrophoblastes villeux primaires humains et leurs homologues différenciés représentent des échantillons biologiques importants et permettent aux chercheurs d’étudier un certain nombre de processus liés au placenta, tels que la fusion cellulaire, en culture. Par ailleurs, des efforts substantiels sont en cours pour identifier des marqueurs qui faciliteront une prise en charge appropriée et amélioreront les thérapies préventives spécifiques aux maladies liées à la grossesse. Les laboratoires isolent régulièrement les cytotrophoblastes villeux humains primaires des placentas frais, en utilisant une procédure d’isolement standard basée sur la digestion à la trypsine des villosités 3 du placenta. Comme les cytotrophoblastes en culture perdent leur capacité à proliférer et se différencient rapidement en une couche de type syncytiotrophoblaste lors de la culture 4, des méthodes de transfection très efficaces et des approches d’analyse optimisées sont nécessaires. Des études antérieures ont déterminé les conditions optimales de transfection de ces cytotrophoblastes primaires 5. Ici, une méthode différente de transfection de siRNA, qui a déjà été testée dans ce type de cellule 6, est présentée. Par rapport à une approche basée sur la lipofection, cette méthode de microporation améliore la transfection, comme l’évalue l’étendue du silençage de gènes spécifiques.
Les études de promoteur et d’expression génique permettent également de mieux comprendre la fonction placentaire. Bien que plus difficiles à utiliser en raison de la courte période pendant laquelle les cytotrophoblastes villeux primaires peuvent être cultivés, les analyses de promoteurs utilisant des protocoles standard peuvent néanmoins être abordées, comme publié précédemment 7. L’essai EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) est l’une de ces méthodes in vitro couramment utilisées, permettant une surveillance rapide et facile des interactions ADN-protéines. Des extraits nucléaires de ces trophoblastes primaires ont été utilisés pour tester une région du promoteur de la Syncytine-2 pour des interactions spécifiques. Les résultats ont révélé que les facteurs liés pouvaient être détectés à différents moments de la culture et de manière spécifique et reproductible.
Les données présentées dans ce protocole confirment que notre approche de transfection et le protocole EMSA peuvent être utilisés pour des cytotrophoblastes villeux primaires isolés et seront d’une grande utilité pour étudier les diverses fonctions des cytotrophoblastes villeux dans des conditions normales ou pathologiques.

<table><tbody><tr><td>HBSS sans&nbsp ; Ca2+, Mg2+&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose sans Hepes</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Néomycine (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>Pour le gradient de densité</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Technologies Ambion Life</td> <td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA brouillé</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, type I&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfection&nbsp ; réactifs&nbsp ;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteur de protéase</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin, anticorps liés à la HRP</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de transfert Western par chimiluminescence BM (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma ;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>#A9099</tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>#A3678</tr><tr><td>Clone d’anticorps anti-cytokératine 7 humaine LP5K,</td><td>Millipore</td><td>conjugué FITC CBL194F</td> réactif bloquant la <td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>FcR&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>Dilution 1:10</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux BD Système Acuri</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 appareil&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Tampon de</td></tr><tr><td>biosuspension numérique R (système de transfection au néon, 100&nbsp ; et micro ; l Kit)</td><td>Life technologies</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>membrane PVDF&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&nbsp ;</td><td>Activer avec du méthanol</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH humain</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin conjugué à la chèvre (HRP) ou anticorps anti-souris</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>#7074</td><td>1:10 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>#7076&nbsp ;</td><td>1:10 000</td></tr><tr><td>Réactif d’extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PER</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 colonne&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’imagerie par chimiluminsescence et fluorescence</td><td>Montr&eacute ; al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4 % gel natif</td><td>fait</td><td></td><td></td>maison</tr><tr><td>PBS</td><td>Fait</td><td></td> maison <td>1x</td></tr><tr><td>système d’imageur moléculaire personnel (PMI)</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sirna transfection et emsa analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Les cytotrophoblastes villositaires primaires humains sont une source très utile de cellules primaires pour étudier les fonctions placentaires et les mécanismes de régulation, et pour comprendre les maladies liées à la grossesse. Dans ce protocole, les cytotrophoblastes villeux primaires humains fraîchement isolés des placentas par un protocole standard DNase/trypsine sont microporés avec de petits ARN interférents (siRNA). Cette approche a fourni une plus grande efficacité pour la transfection des siRNA par rapport à une méthode basée sur la lipofection. Les cellules transfectées peuvent ensuite être analysées par transfert Western standard dans un délai de 3 à 4 jours après la transfection. De plus, à l’aide de cytotrophoblastes villeux primaires cultivés, l’analyse EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) a été optimisée et réalisée sur des extraits des jours 1 à 4. L’utilisation de ces cellules primaires cultivées et le protocole décrit permettent d’évaluer l’implication de gènes et de facteurs de transcription spécifiques dans le processus de différenciation du cytotrophoblaste villositaire en une couche cellulaire de type syncytiotrophoblaste. Cependant, la durée limitée permise en culture empêche l’utilisation de méthodes nécessitant plus de temps, telles que la génération d’une population cellulaire stable. Par conséquent, l’analyse de cette population cellulaire nécessite des protocoles de transfert de gènes hautement optimisés.

placentas frais de grossesses à terme ont été utilisés pour isoler les cytotrophoblastes villosités primaires humains pour mener l&#39;ensemble des expériences présentées dans la section Protocole. Après leur isolement, nous avons d&#39; abord analysé la pureté de cytotrophoblastes par l&#39;utilisation de la cytokératine-7 marqueur (Figure 1). Préparations cellulaires ont ainsi été colorées en utilisant un anticorps monoclonal anti-cytokératine-7. La figure 1</s...

Ce protocole décrit un procédé pour transfecter efficacement ARNsi dans les cytotrophoblastes villeux humaines fraîchement isolées en utilisant la microporation et l&#39;identification des complexes ADN-protéine dans ces cellules. Les cellules transfectées peuvent être contrôlées par Western Blot et des analyses EMSA pendant la période de culture de 4 jours.

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer les conditions optimales pour la transfection de cytotrophoblastes villiques primaires fraîchement isolés et de présenter une méthode permettant l'identification des interactions ADN-protéine au niveau des sites promoteurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le placenta, notamment celles relatives aux gènes impliqués dans la différenciation des cytotrophoblastes et aux mécanismes régulateurs participant à leur expression. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile à réaliser et très efficace.De plus, la durée nécessaire pour réaliser cette expérience est courte et permet d'inclure un grand nombre d'échantillons différents. La démonstration de ces procédures sera effectuée par Chirine Toufaily, ancienne étudiante au doctorat de mon laboratoire, ainsi que par Yong Xiao, chargé de recherche. Ici, les cytotrophoblastes villiques primaires sont isolés à partir de placentas frais selon des protocoles standard.La première étape de ce protocole consiste à analyser la pureté de la préparation par analyse FACS. Commencez par centrifuger 1 × 10⁶ cytotrophoblastes

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Génétique

Dans ce protocole, nous décrivons la dissection du placenta de la souris sur la grossesse D10.5, suivie de l'isolement des cellules trophoblastiques en utilisant un gradient de Percoll. Nous avons ensuite démontrer l'utilisation des cellules isolées dans un essai invasion matrigel.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

Ce manuscrit présente un modèle in vitro unique de cellules cytotrophoblastes villositaires humaines immunopurifiées cultivées sous hypoxie/réoxygénation. Ce modèle est adapté pour étudier les effets protecteurs de traitements prometteurs, tels que la mélatonine, sur les complications de la grossesse associées à une augmentation du stress oxydatif et à une altération de la fonction placentaire.

Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l&#39;hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

Les cellules géantes trophoblastiques (TGC) jouent un rôle clé dans le placenta pour assurer une grossesse en bonne santé. Nous présentons un protocole d’évaluation de l’état transcriptionnel des gènes dans les TGC par hybridation in situ fluorescente naissante sur des coupes cryostat d’embryons post-implantatoires ou des cultures à court terme de cônes ectoplacentaires embryonnaires du jour 7.

Transcriptionnelle Analyse par Naissant ARN FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellules Trophoblast géants ou<em&gt; In vitro</em&gt; Cultures à court terme de ectoplacentaire Cône explants

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.

Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta

Cette étude présente un protocole pour le tissu réversible clearing, immunomarquage, rendu 3D et l’analyse des réseaux vasculaires dans des échantillons de villosités du placenta humain sur l’ordre de 1 à 2 mm,3.

Rendu tridimensionnel et l’analyse d’immunomarquées, a précisé réseaux vasculaires villosités placentaires humains

Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.

Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

Nous présentons ici un protocole très accessible pour évaluer le mouvement cellulaire dans les cellules Trophoblastiques humaines à l’aide de trois essais in vitro : le test de gratter, le dosage d’invasion de transwell et le test de prolifération cellulaire.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Le protocole actuel permet de récupérer des structures tubulaires formées dans l’essai classique d’angiogenèse-formation de tubes in vitro où les cellules, telles que les cellules trophoblastiques, s’organisent en structures capillaires sur une couche de matrice de membrane basale extracellulaire. Les structures récupérées sont utilisées pour l’isolement de l’ARN et des protéines pour diverses analyses biochimiques.

Récupération de cellules trophoblastiques à partir d’un test de formation de tube d’angiogenèse pour l’analyse de l’expression des marqueurs de différenciation

Ce protocole permet la purification, la caractérisation et la culture des trophoblastes extravilleux primaires HLA-G+ (EVT) à partir de la base de la déduite basale et de la membrane chorionique des placentas humains à terme. Les cultures primaires d’EVT maintiennent leur viabilité pendant 96 heures, permettant la coculture avec des cellules immunitaires maternelles correspondantes à l’échantillon et l’analyse cytométrique et moléculaire de leurs interactions en flux subséquente.

Purification des trophoblastes extravilleux HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle

Apprenez la transfection siRNA et l'analyse EMSA sur des cytotrophoblastes villositaires humains fraîchement isolés. Cette méthode efficace facilite l'étude des interactions ADN-protéines et de la régulation génique placentaire.

siRNA Transfection et EMSA Analyses sur fraîchement isolés villosités cytotrophoblastes humaines

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