Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces

L’objectif général de cette procédure est de démontrer un système de génération de mutants non marqués chez l’espèce cyanobactérienne Synechocystis PCC6803 et de mutants marqués chez l’espèce Synechococcus PCC7002. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique des cyanobactéries. Comme comment introduire des altérations chromosomiques dans une souche.

Par insertion d’un gène de résistance aux antibiotiques, suivie d’un retrait ultérieur de cette cassette, à l’aide d’un marqueur sélectionnable négatif. Le principal avantage de cette technique est que les souches peuvent être manipulées génétiquement à plusieurs reprises. Permettre d’introduire dans une souche autant d’alternances que nécessaire.

Après avoir préparé les milieux, les souches de cyanobactéries et les plasmides, selon le protocole de texte. Mettez en place une culture fraîche en inoculant une boucle pleine de cellules cyanobactériennes, dans 30 à 50 millilitres de milieu BG11. Cultivez la culture à la lumière de 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu’à un OD7500, égal à 0,2 à 0,6.

Après l’incubation, centrifugez un à deux millilitres de la culture à 2 300 g pendant cinq minutes. Ensuite, après avoir jeté le surnageant, utilisez le milieu BG11 pour laver les granules une fois, en pipetant doucement pour remettre les cellules en suspension. Comme le vortex peut entraîner la perte de pili, qui sont essentiels à l’absorption de l’ADN.

Après avoir à nouveau granulé les cellules et retiré le surnageant, ajoutez le milieu BG11 à un volume final de 100 microlitres et transférez les cellules dans un tube à fond rond de 14 millilitres. Ensuite, ajoutez 1 microgramme du plasmide A préalablement préparé aux cellules. Et tapotez doucement pour mélanger.

Ensuite, posez les tubes horizontalement dans l’incubateur à 30 degrés Celsius et incubez pendant quatre à six heures. Après l’incubation, étaler des aliquotes du mélange d’ADN plasmidique de culture cellulaire sur des plaques de gélose BG11 sans antibiotiques. Et incuber à 30 degrés Celsius.

Environ 24 heures plus tard, préparer une solution de gélose à 0,6 %, dans de l’eau contenant de la kanamycine. Et laissez-le refroidir à 42 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 2,5 à trois millilitres sur les bords des plaques de culture et inclinez la plaque, de sorte que la solution forme une couche supérieure de gélose uniforme à la surface.

Incuber les plaques environ sept jours pour que les colonies soient visibles. Divisez ensuite une plaque de gélose BG11 fraîche et de kanamycine en six secteurs. Et utilisez un cure-dent à bout émoussé pour faire ressortir les colonies individuelles.

Pour effectuer une PCR, pour confirmer un knockout marqué, transférez une petite quantité de cellules dans un tube contenant 50 microlitres d’eau et environ 20 billes de verre de 425 à 600 micromètres. Secouez les cellules et les billes à environ 2 000 tr/min pendant cinq minutes, avant d’essorer à 15 700 g pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez cinq microlitres de surnageant pour préparer des réactions PCR de 50 microlitres avec des préliminaires d’ADN.

Pour valider les mutants, après avoir conçu des amorces selon le protocole de texte, amplifiez le produit à l’aide du programme suivant, et incluez un contrôle de type sauvage. À l’aide de gelelektroforeses, vérifiez le génotype des transformants knock-out. Montrant une bande d’environ quatre paires de kilobase et dépourvue de la bande de type sauvage.

Pour plus de détails, reportez-vous au protocole textuel. Si une bande de type sauvage est toujours présente, retracez la souche sur la plaque fraîche et répétez la PCR. Répétez le processus de validation jusqu’à ce que le mutant soit séparé et qu’aucune bande de type sauvage ne soit observée dans la réaction PCR.

Pour une souche qui présente un profil mutant marqué, re-streak sur une plaque fraîche pour l’utiliser dans la génération d’un knockout non marqué. Pour générer des mutants Synechocystis non marqués, mettez en place une nouvelle culture de l’inactivation marquée en inoculant la boucle pleine de cellules dans 30 à 50 millilitres de milieu BG11. Cultivez la culture pendant deux à trois jours jusqu’à OD750, égal à 0,2 à 0,6.

Centrifugez 10 millilitres de la culture à 2, 300 g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Ensuite, utilisez le milieu BG11 pour laver doucement les cellules. Après avoir ajouté BG11 à un volume final de 200 microlitres et transféré les cellules dans un tube à fond rond de 14 millilitres, ajoutez 1 microgramme d’ADN plasmidique B aux cellules et tapotez doucement pour mélanger.

Ensuite, déposez les tubes horizontalement dans l’incubateur et incubez pendant quatre à six heures. Après l’incubation, ajoutez 1,8 millilitre de milieu BG11 et incubez les échantillons pendant un total de quatre jours en agitant. C’est un temps suffisant pour permettre à la recombinaison de se produire dans les multiples copies chromosomiques.

Des aliquotes de 50, 10 et 1 microlitre de la culture transformée sur des plaques de gélose BG11 plus 5 % de saccharose et incuber pendant environ sept jours pour générer des colonies uniques. Ensuite, à l’aide d’un cure-dent à bout émoussé, faites éclore 30 à 50 colonies individuelles sur des plaques de BG11 plus de kanamycine. Appliquez ensuite du BG11 plus 5 % de saccharose.

Les colonies qui se développent sur du BG11 et du saccharose, mais pas sur des plaques contenant de la kanamycine, sont potentiellement non marquées. Les colonies qui se développent sur les deux plaques sont susceptibles d’être résistantes au saccharose en raison d’une mutation du gène sacB. En suivant la méthode PCR, démontrée plus tôt dans cette vidéo, vérifiez les knockouts non marqués, qui produiront une bande de gel correspondant à la taille de type sauvage moins la région supprimée.

Si la souche présente un profil mutant non marqué, il faut la réappliquer sur de la gélose BG11 fraîche sans antibiotiques. Pour conserver les souches à long terme, mettez en place une nouvelle culture de la souche en inoculant une boucle pleine de cellules dans 30 à 50 millilitres de milieu BG11. Cultivez la culture pendant trois à quatre jours jusqu’à ce que la DO 750 soit égale à 0,4 à 0,7.

Après avoir utilisé BG11 pour laver les cellules une fois, remettez la pastille en suspension dans environ deux millilitres de BG11. Ajoutez 0,8 millilitre de cellules concentrées dans un tube. Ajoutez ensuite 0,2 millilitre de glycérol stérilisé à 80 %.

Dans un autre tube, ajoutez 0,93 millilitre de cellules concentrées et 0,07 millilitre de DMSO. Stockez les deux tubes à moins 80 degrés Celsius. Pour raviver les souches, retirez le tube et utilisez un cure-dent à bout émoussé pour gratter certaines cellules sur une plaque de gélose sans antibiotiques.

Ensuite, utilisez une boucle stérile pour faire des traînées comme d’habitude. Cette figure montre des exemples de plasmides A et B utilisés pour générer des mutants de délétion. Dans chaque cas, les cinq régions de bordage principal et les trois régions de bordage principal sont d’environ 900 à 1 000 paires de bases.

Le plasmide B peut également contenir une cassette de gènes entre les cinq premiers et trois premiers d’environ une paire de kilobases flanquant les régions. Ou une version modifiée de la séquence du gène natif. Lors de la transformation avec le plasmide A, plusieurs centaines de colonies apparaîtront sur une plaque après sept à 10 jours.

Si les gènes ne sont pas essentiels et que les mutants présentent une croissance, similaire à celle de la souche de type sauvage, alors tous les chromosomes doivent contenir une séquence insérée de copie npt1/sacB, déterminée par PCR. Si les gènes ne sont pas essentiels et que les mutants se développent lentement, plusieurs cycles de re-streaking avec des concentrations croissantes de kanamycine sont nécessaires pour obtenir un mutant marqué ségrégué. Si, lors de la remise en stries, un mutant marqué n’est pas obtenu, le gène est probablement essentiel à la survie.

La majorité des colonies individuelles, obtenues par transformation avec le plasmide B, seront sensibles à la kanamycine et résistantes au saccharose. Comme démontré ici, l’amplification par PCR de la région cible dans ces colonies, montre que près de 100 % du profil mutant non marqué. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures sur une période de six semaines si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser une technique stérile. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la mesure de la production d’oxygène, ou la chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la mesure des taux de photosynthèse ou de la production de métabolites. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la génétique des cyanobactéries.

Explorer les principaux processus biochimiques et physiologiques de cet embranchement, ainsi que les souches développementales à des fins industrielles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des knockouts non marqués chez les espèces de Synechococcus PCC6803.