Name: Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Découvrez une méthode de génération de mutants non marqués chez Synechocystis sp. PCC6803 et de mutants marqués chez Synechococcus sp. PCC7002. Cette technique permet des manipulations génétiques répétées pour la recherche en génétique cyanobactérienne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous sommes reconnaissants à l&#39;Environmental Services Association Education Trust, la biologie synthétique dans le fonds Synbio Cambridge et le Ministère de la justice sociale et l&#39;autonomisation, Gouvernement de l&#39;Inde, pour un soutien financier.

<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes les plus critiques dans la production de mutants non marquées sont: 1) la conception plasmidique soin d&#39;assurer que la région ciblée est modifiée; 2) veiller à ce que les échantillons restent axénique, en particulier lorsqu&#39;elles sont cultivées sur le saccharose; 3) le placage des cellules pour la production mutante marquée sur BG11 transformé d&#39;abord des plaques de gélose dépourvues d&#39;antibiotiques, suivie par l&#39;addition d&#39;agar-agar, plus des antibiotiques 24 heures plus tard; 4) la c...

Les cyanobactéries sont un phylum ancienne et diverse évolutionnaire des bactéries présentes dans presque tous les milieux naturels sur la Terre. Dans les écosystèmes marins , ils sont particulièrement abondants et jouent un rôle clé dans de nombreux cycles de nutriments, ce qui représente environ la moitié de la fixation du carbone 1, la majorité de l&#39; azote fixation 2 et des centaines de millions de tonnes de la production d&#39;hydrocarbures 3 dans les océans chaque année. Chloroplastes, l&#39;organite responsable de la photosynthèse dans les algues et les plantes eucaryotes, sont susceptibles d&#39;avoir évolué à partir d&#39; une cyanobactérie qui a été englouti par un organisme hôte 4. Les cyanobactéries se sont révélés utiles des organismes modèles pour l&#39;étude de la photosynthèse, le transport d&#39;électrons 5 et les voies biochimiques, dont la plupart sont conservés dans les plantes. En plus des cyanobactéries sont de plus en plus utilisé pour la production de denrées alimentaires, les biocarburants 6, 7 et électricité industriels composés 8, en raison de leur salutconversion ghly efficace de l&#39; eau et du CO 2 à la biomasse en utilisant l&#39; énergie solaire 9. De nombreuses espèces peuvent être cultivées sur des terres non arables avec des nutriments minimaux et l&#39;eau de mer, ce qui suggère que les cyanobactéries pourraient être cultivées à grande échelle sans affecter la production agricole. Certaines espèces sont également des sources de produits naturels, y compris les antifongiques, antibactériennes et anti-cancer composés 10,11. La capacité de générer des mutants est essentielle pour comprendre la photosynthèse des cyanobactéries, la biochimie et la physiologie, et essentielle pour le développement de souches à des fins industrielles. La majorité des études publiées générer des souches génétiquement modifiées par insertion d&#39;une cassette de résistance aux antibiotiques au site d&#39;intérêt. Cela limite le nombre de mutations qui peuvent être introduites dans une souche, car seulement quelques cassettes de résistance aux antibiotiques sont disponibles pour une utilisation dans les cyanobactéries. Les souches contenant les gènes conférant aux antibiotiques resistance ne peut pas être utilisé pour la production industrielle dans les étangs ouverts, ce qui est susceptible d&#39;être le seul moyen rentable pour produire des biocarburants et autres produits à faible valeur 12. La génération de mutants non marqués surmonte ces limitations. les mutants non marqués ne contiennent pas d&#39;ADN étranger, à moins d&#39;inclure intentionnellement, et peuvent être manipulées à plusieurs reprises. Par conséquent, il est possible de générer autant de modifications dans une souche telle que souhaitée. En outre, des effets polaires sur les gènes en aval du site de modification peuvent être minimisés, ce qui permet une modification plus précise de l&#39;organisme 13. Pour générer des souches de mutants, des plasmides suicides contenant au moins deux fragments d&#39;ADN identiques à des régions dans le chromosome de cyanobactéries flanquant le gène à supprimer (appelée 5 &#39;et 3&#39; des régions adjacentes) sont tout d&#39;abord construit. Deux gènes sont ensuite insérés entre ces régions adjacentes. L&#39;un d&#39;entre eux codant pour une protéine de résistance à un antibiotique; le second code SacB, qui produces levansucrase, un composé conférant une sensibilité au sucrose. Dans la première étape du procédé, les mutants marqués, les souches contenant l&#39; ADN étranger certains sont générés. Le produit de construction de plasmide est mélangé avec les cellules de cyanobactéries, et l&#39;ADN est repris naturellement par l&#39;organisme. Les transformants sont sélectionnés par croissance sur des plaques d&#39;agar contenant l&#39;antibiotique approprié et le génotype mutant vérifié par PCR. plasmides de suicide ne peuvent pas se répliquer dans la souche d&#39;intérêt. Par conséquent, toutes les colonies résistantes aux antibiotiques vont résulter d&#39;un événement de recombinaison dans lequel le gène d&#39;intérêt inséré dans le chromosome. Pour générer des mutants non marqués, le mutant marqué est ensuite mélangé avec un second plasmide suicide ne contenant que les régions flanquantes 5 &#39;et 3&#39;. Cependant, si l&#39;insertion de l&#39;ADN étranger est nécessaire, un plasmide consistant en 5 &#39;et 3&#39; des régions avec une cassette contenant les gènes d&#39;intérêt inséré entre ces fragments d&#39;ADN flanquant, peut être utilisé. Selection est par croissance sur des plaques de gélose contenant du saccharose. Sous forme de saccharose est létal pour les cellules lorsque le produit du gène sacB est exprimé, les seules cellules qui survivent sont ceux dans lesquels un deuxième événement de recombinaison a eu lieu, de sorte que le gène de la sensibilité du saccharose, en plus du gène de résistance aux antibiotiques, a été recombinée de la le chromosome et sur le plasmide. En conséquence de l&#39;échange par recombinaison, les régions de flanquement et des ADN entre eux sont insérés dans le chromosome. Nous avons utilisé avec succès ces méthodes pour générer de multiples mutations chromosomiques dans la même souche de Synechocystis sp. PCC6803 (ci - après dénommé Synechocystis) 13,14, pour introduire des mutations ponctuelles dans un gène d&#39;intérêt et 13 pour l&#39; expression de cassettes de gènes. Alors que la génération de KO non marqués a été démontrée avant notre travail dans Synechocystis 15,16, une méthode détaillée, aidé parune présentation visuelle des étapes critiques, ne sont pas accessibles au public. Nous avons également appliqué la même méthode pour la production de KO marquées dans un autre modèle cyanobactérie, Synechococcus sp. PCC7002 (ci - après dénommé Synechococcus). Ce protocole offre une méthode claire et simple pour générer des mutants et un protocole rapide pour la validation et le stockage de ces souches.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>acide citrique</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium ferrique</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cyanocobalamine</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto</td><td>agar BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 90 mm triple ventilée</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro ; m filtres</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml flacons</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp ; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité&nbsp ;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification d’ADN&nbsp ;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani broth</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET plasmide miniprep</td><td>kit Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml tube à fond rond</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymérase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro ; Billes de verre m</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ampoules fluorescentes</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron photobioréacteur</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération de signalisés et mutants dans modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Les cyanobactéries sont des organismes écologiquement importants et des plateformes potentielles pour la production de biocarburants et de produits industriels utiles. La manipulation génétique des cyanobactéries, en particulier des organismes modèles tels que Synechocystis sp. PCC6803 et Synechococcus sp. PCC7002, est un outil clé pour la recherche fondamentale et appliquée. La génération de mutants non marqués, par lesquels des altérations chromosomiques sont introduites dans une souche par l’insertion d’une cassette de résistance aux antibiotiques (un fragment d’ADN manipulable contenant un ou plusieurs gènes), suivie d’un retrait ultérieur de cette cassette à l’aide d’un marqueur sélectionnable négatif, est une technique particulièrement puissante. Les mutants non marqués peuvent être manipulés génétiquement à plusieurs reprises, ce qui permet d’introduire autant de modifications que nécessaire dans une souche. De plus, l’absence de gènes codant pour des protéines de résistance aux antibiotiques dans la souche mutée est souhaitable, car elle évite la possibilité d’une « fuite » d’organismes résistants aux antibiotiques dans l’environnement. Cependant, les méthodes détaillées pour les cycles répétés de manipulation génétique des cyanobactéries ne sont pas bien décrites dans la littérature scientifique. Nous fournissons ici une description complète de cette technique, que nous avons utilisée avec succès pour générer des mutants avec des délétions multiples, des mutations ponctuelles au sein d’un gène d’intérêt et l’insertion de nouvelles cassettes de gènes.

La conception du plasmide est essentielle pour le succès de la génération des deux mutants marqués et non marqués. La figure 1 donne un exemple de plasmide A et B utilisées pour générer un mutant de deletion dans les gènes et Synechocystis cpcC1 cpcC2 13. Dans chaque cas, les régions flanquantes 5 &#39;et 3&#39; sont à peu près 900-1,000 pb. régions flanquant réduits peuvent être utilisées, bien que le plus petit, nous avons mis à l&...

L’introduction de multiples altérations génomiques dans les cyanobactéries est un outil essentiel dans le développement de souches à des fins industrielles et de recherche fondamentale. Nous décrivons un système de génération de mutants non marqués chez l’espèce cyanobactérienne modèle Synechocystis sp. PCC6803 et de mutants marqués chez Synechococcus sp. PCC7002.

Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

L’objectif général de cette procédure est de démontrer un système de génération de mutants non marqués chez l’espèce cyanobactérienne Synechocystis PCC6803 et de mutants marqués chez l’espèce Synechococcus PCC7002. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique des cyanobactéries. Comme comment introduire des altérations chromosomiques dans une souche.Par insertion d’un gène de résistance aux antibiotiques, suivie d’un retrait ultérieur de cette cassette, à l’aide d’un marqueur sélectionnable négatif. Le principal avantage de cette technique est que les souches peuvent être manipulées génétiquement à plusieurs reprises. Permettre d’introduire dans une souche autant d’alternances que nécessaire.Après avoir préparé les milieux, les souches de cyanobactéries et les plasmides, selon le protocole de texte. Mettez en place une culture fraîche en inoculant une boucle pleine de cellules cyanobactériennes, dans 30 à 50 millilitres de milieu BG11. Cultivez la culture à la lumière de 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu’à un OD7500, égal à 0,2 à 0,6.Après l’incubation, centrifugez un à deux millilitres de la culture à 2 300 g pendant ci

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Weber, N., et al., Transformation naturelle, expression protéique et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo décrit une procédure de transformation naturelle dans les cyanobactéries filamenteuses à l’aide de l’ADN plasmidique pour obtenir une expression stable de la GFP et une résistance aux antibiotiques par recombinaison homologue.

Transformation naturelle et expression de la GFP chez la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacuna

Source : Lea-Smith, D. J., et al. Génération de mutants marqués et sans marqueurs chez des espèces cyanobactériennes modèles. J. Vis. Exp. (2016)La vidéo montre une méthode pour générer des mutants marqués par des antibiotiques chez les cyanobactéries. Le protocole commence par la culture de cyanobactéries, suivie d’étapes de centrifugation et de lavage qui préservent les piles de surface. Un plasmide porteur d’un gène de résistance aux antibiotiques flanqué de séquences homologues est ensuite...

Génération de mutants marqués aux antibiotiques chez les cyanobactéries par recombinaison homologue

Les mutants létaux sensibles à la température (ts) sont des outils précieux pour identifier et analyser les fonctions essentielles. Nous décrivons ici des méthodes pour générer et classer des mutants létaux à haut débit.

À haut débit robotisé Isolation assistée sensible à la température létale Mutants en<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Nous présentons ici des protocoles pour les novices chercheurs pour lancer phénotypage du genre bactérien important sur le plan pharmacologique Streptomyces.

Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement

Ici, nous présentons un protocole décrivant comment i) assembler un vecteur auto-réplicant à l'aide de la boîte à outils modulaire de clonage CyanoGate, ii) introduire le vecteur dans un hôte cyanobactérieparpare par conjugaison, et iii) caractériser les souches transgéniques cyanobactéries en utilisant un lecteur de plaque ou cytométrie de flux.

Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

Ce protocole utilise des promoteurs-reporters fluorescents, la microscopie à cellules vivantes et l’extraction individuelle d’inclusion dans une approche génétique dirigée vers l’avant pour identifier et isoler les mutants développementaux de Chlamydia trachomatis.

Approche génétique avancée des cellules vivantes pour identifier et isoler les mutants du développement dans chlamydia trachomatis

Ici, nous décrivons la construction de mutants nuls d’Aeromonas dans des glycosyltransférases spécifiques ou des régions contenant des glycosyltransférases, les tests de motilité et la purification des flagelles effectués pour établir l’implication et la fonction de leurs enzymes codées dans la biosynthèse d’un glycane, ainsi que le rôle de ce glycane dans la pathogenèse bactérienne.

Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne

La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse qui a été isolée à partir de bassins rocheux marins. Cet article décrit l’isolement des filaments à partir de sources naturelles, l’extraction de l’ADN, le séquençage du génome, la transformation naturelle, l’expression du sfGFP, la cryoconservation et les méthodes de motilité.

Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacune

Ce protocole fournit une ligne directrice complète pour la mise en place et le suivi quantitatif des co-cultures, y compris les cyanobactéries photoautotrophes sécrétant du sucre et les levures hétérotrophes.

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

En utilisant la stimulation électrique à haute fréquence, la saisie-comme l'activité peut être induite...

Les dosages des Saisies en Neurocircuit Mutants épilepsie du Drosophile</em

Découvrez une méthode de génération de mutants non marqués chez Synechocystis sp. PCC6803 et de mutants marqués chez Synechococcus sp. PCC7002. Cette technique permet des manipulations génétiques répétées pour la recherche en génétique cyanobactérienne.

Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces

Explorer plus de vidéos