Développement d'un fibrotique du foie Modèle induite de l'éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

L’objectif global de ce protocole est d’établir un modèle de foie fibrotique induit par l’éthanol chez le poisson zèbre et d’effectuer des criblages chimiques à l’aide de ce modèle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération du foie. Comme les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rentable et permet de gagner du temps dans le criblage chimique vevo. De plus, une analyse détaillée de l’évolution temporelle peut être effectuée grâce à la visualisation d’une seule cellule. Mianbo Huang, postdoctorant, et Jin Xu, un étudiant diplômé du laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Après avoir préparé les réactifs conformément au protocole de texte, mettez en place des bassins d’accouplement avec des séparateurs en utilisant des poissons-zèbres transgéniques adultes contenant la protéine de liaison aux acides gras 10a :CFP-NTR avec Tp1 :mCherry et Tg(hand2 :EGFP)Zebrafish. Le lendemain matin, deux heures après avoir retiré les séparateurs, récoltez les embryons en filtrant l’eau du système et en transférant les embryons dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres contenant du milieu embryonnaire. 56 heures après la fécondation, ou HPF, ajoutez 1,5 % d’éthanol aux embryons.

Utilisez une pellicule plastique pour couvrir les plaques afin d’éviter l’évaporation de l’éthanol. Ensuite, incubez à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Préparez un milieu frais de 15 millimolaires de MTZ et d’embryons avec 0,1 % de DMSO et ajoutez de l’éthanol à une concentration finale de 1,5 %.

Ensuite, à 80 HPF, traitez les embryons triés avec 20 millilitres de solution d’éthanol MTZ par boîte de Pétri. Utilisez une pellicule plastique pour couvrir les plaques afin d’éviter l’évaporation de l’éthanol et couvrez d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la lumière. Ensuite, incubez à 28 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, observez les embryons au microscope épifluorescent à l’aide d’un filtre CFP et d’un grossissement de 80x pour trier les larves avec ablation presque complète des hépatocytes. Pour effectuer des criblages chimiques, retirez les plaques à 96 puits contenant dix stocks chimiques millimolaires dans du DMSO du congélateur négatif à 80 degrés. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir les plaques afin d’éviter la dégradation photocatalytique des produits chimiques et décongelez en les balançant doucement à température ambiante.

Dans des tubes de 1,5 millilitre, préparez des solutions chimiques en diluant cinq microlitres de dix solutions mères millimolaires avec un millilitre de milieu embryonnaire jusqu’à une concentration finale de 50 micromolaires. Ensuite, transférez cinq larves par puits avec ablation presque complète des hapatocytes dans des plaques de 24 puits remplies de milieu embryonnaire. Ensuite, retirez le milieu embryonnaire et ajoutez 500 microlitres de solutions chimiques dans chaque puits.

À l’aide d’une feuille d’aluminium, couvrez les plaques et incubez les larves à 28 degrés Celsius pendant 50 heures. Après l’incubation, observer le nombre et/ou l’intensité des hépatocytes exprimant la CFP au microscope épifluo-senti à un grossissement de 80x. Imagez des larves vivantes avec un nombre accru ou réduit et/ou une intensité d’hapatocytes exprimant la CFP.

Mettez en place des accouplements de poissons-zèbres transgéniques contenant la protéine de liaison aux acides gras 10a :CFP-NTR avec TP1 :mCherry et élevez les larves triées jusqu’à l’âge de six à 12 mois. Utilisez un filet pour transférer le poisson-zèbre transgénique adulte dans les bassins d’accouplement. Préparez de l’éthanol frais à un pour cent dans l’eau du système, puis utilisez 500 millilitres de la solution pour remplacer l’eau du système dans les réservoirs d’accouplement.

Incuber les réservoirs à 28 degrés Celsius pendant 72 heures, en transférant les poissons dans une solution d’éthanol frais et en retirant tous les poissons morts quotidiennement pendant l’incubation. Préparez une solution fraîche de MTZ de dix millimolaires dans l’eau du système avec 0,1 % de DMSO, puis ajoutez 500 millilitres de solution MTZ préchauffée pour les poissons dans des réservoirs d’accouplement d’un litre. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir les réservoirs.

Incuber à 28 degrés Celsius pendant huit heures et analyser selon le protocole texte. Après l’anesthésie selon le protocole textuel, exposez les organes gastro-intestinaux à l’aide de ciseaux pour couper la peau et souligner le muscle le long du ventre, de la nageoire anale à l’opercule. Ensuite, coupez vers l’arrière le long du côté du poisson jusqu’à la nageoire anale.

Placez le poisson dans un tube conique de quinze millilitres et utilisez du PBS pour le laver une fois. Retirez ensuite le PBS et ajoutez quatre millilitres de formaldéhyde à trois pour cent fraîchement préparé dans un tampon PEM. Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour fixer le poisson.

Le lendemain, après avoir lavé les échantillons selon le protocole de texte, coupez l’œsophage pour disséquer tout l’intestin avec le foie de la cavité corporelle. Placez ensuite les organes gastro-intestinaux dans un moule de sectionnement et utilisez quatre pour cent d’agarose à faible point de fusion pour intégrer le tissu. Ensuite, coupez le bloc en forme de trapèze et collez-le à la base.

Ensuite, utilisez un vibratome et, en partant de l’extrémité intérieure du tissu, coupez les échantillons en sections transversales à des intervalles de cinquante micromètres jusqu’à ce que le PBS soit glacé. Utilisez un pinceau numéro un pour transférer les sections sur une plaque à six puits avec PBS. Après avoir immunocoloré les sections selon le protocole textuel, utilisez un pinceau numéro un pour transférer doucement les sections sur des lames de verre.

Utilisez des lingettes pour enlever l’excès de PBS avant d’ajouter une goutte de support de montage et une lamelle. Utilisez ensuite du vernis à ongles pour sceller le verre de protection. Enfin, à l’aide d’un système confocal équipé d’une lentille à huile 40x 1,3 NA, capturez des images Z-Stack à une intensité de 20 à 50 % et à des intervalles d’un microampèremètre.

Cette figure montre que les larves traitées à l’éthanol MTZ développent une courbure vers le haut du tronc et de la queue, un paricardialidema et une incapacité à gonfler la vessie natatoire. Comme on le voit ici, les foies témoins traités au DMSO n’ont montré aucun dépôt de collagène fibulaire de type 1. Alors que les foies traités à l’éthanol MTZ présentaient une accumulation élevée de collagène de type 1 à 25 et 50 heures après l’ablation.

De plus, par rapport aux foies contrôlés traités au DMSO, les CSH ont augmenté en nombre et ont adopté une forme semblable à celle du myofibrillblaste sans processus cytoplasmiques dans les foies en régénération traités à l’éthanol MTZ. Cette figure montre le développement d’un modèle de foie fibrotique induit par l’éthanol chez des poissons-zèbres adultes traités avec un pour cent d’éthanol suivi d’un MTZ. D’après ces analyses temporelles, on a observé une augmentation significative des dépôts de collagène de type 1 dans les foies en régénération traités au MTZ à l’éthanol deux, trois et quatre jours après l’ablation, par rapport aux foies traités au DSMO.

Dans cette expérience de criblage chimique, les hépatocytes ont été ablatés en présence de 1,5 % d’éthanol et de 15 millimolaires de MTZ. Et les larves ont ensuite été exposées à des produits chimiques pendant 50 heures. Un certain nombre d’agonistes de wint, tels que des inhibiteurs de la glycogène synthase kinase-3 et un activateur de wint, ont favorisé la régénération des hépatocytes par rapport au DMSO.

Ces données suggèrent que ce modèle fibrotique soutenu fournit un outil inestimable pour découvrir de petites molécules qui améliorent la régénération des hépatocytes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de réaliser une ablation presque complète des hépatocytes et de maintenir la concentration d’éthanol tout au long de la procédure.

À la suite de cette procédure, l’efficacité des composés chimiques identifiés peut être testée dans des modèles de lésions hépatiques de mammifères. Après son développement, cette technique peut ouvrir de nouvelles voies dans le domaine de la thérapie de régénération cellulaire pour explorer la découverte potentielle de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints d’insuffisance hépatique chronique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer un modèle de foie fibrotique induit par l’éthanol chez le poisson zèbre et de la façon d’effectuer des criblages chimiques.

N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et la manipulation du réactif dans une hotte chimique, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.