Name: Développement dun fibrotique du foie Modèle induite de léthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Découvrez comment établir un modèle de fibrose hépatique induite par l'éthanol chez le zebrafish pour étudier la régénération des hépatocytes. Cette méthode permet des criblages chimiques efficaces et une analyse temporelle détaillée des mécanismes cellulaires.

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Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du GTEC (2731336 et 1411318), le NIH (K01DK081351) et la NSF (1.354.837) au SHC Nous remercions Alem Giorgis pour la lecture critique du manuscrit.

Zebrafish ont été soulevées et élevé en utilisant un protocole standard qui répond aux critères du National Institutes of Health et approuvés par le Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care et utilisation Comité. 1. Préparation des solutions <ol><li> Préparer l&#39;eau d&#39;œuf de 20 L (utilisés de façon interchangeable avec «moyen d&#39;embryons &#39;) pour maintenir le poisson zèbre embryonnaire / larvaire. Dissoudre 1,5 g de CaSO 4 et 6 g de sel marin instantané de la mer dans 250 ml d&#39; eau distillée. Verser dans une bonbonne remplie de 20 L d&#39;eau distillée et agiter. </li><li> Préparer 1 L (PTU) solution mère-2-thiourée 1-phenyl (20x). Dissoudre 0,6 g PTU poudre dans 1 litre d&#39;eau distillée. Ajouter 1 ml de solution mère par 20 ml de milieu d&#39;embryon à une concentration finale de 0,003% en tant que solution de travail. ATTENTION: PTU peut provoquer une toxicité systémique après inhalation ou exposition cutanée. Préparer et utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. </li><li> Préparer 1 L éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate (Tricaine) solution mère (20x). Dissoudre 4 g de poudre de Tricaine dans de l&#39;eau distillée. Ajuster le pH à 7 par addition de tampon Tris 1 M (pH 9), et amener le volume final à 1 litre avec de l&#39;eau distillée. Aliquoter dans 50 ml et conserver à -20 ° C. Décongeler avant utilisation. ATTENTION: Tricaine peut induire une perte de sensation. Préparer et utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. </li><li> Préparer 100 ml métronidazole larvaire (MTZ) solution de travail. Faire une solution fraîche 15 mM MTZ en dissolvant 0,25 g MTZ poudre dans 0,1% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans 100 ml de milieu d&#39;embryon. Dissoudre la poudre MTZ complètement par agitation vigoureuse. Faire une solution fraîche MTZ et utiliser une feuille d&#39;aluminium pour empêcher la dégradation photocatalytique de MTZ. ATTENTION: MTZ peut provoquer une irritation. Préparer et utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. </li><li> Préparer 100 ml larvaire éthanol / métronidazole (EtOH / MTZ) solution de travail. Faire une solution fraîche MTZ et utiliser une feuille d&#39;aluminium pour empêcher photocatalytique degradation de MTZ. Ajouter 1,5 ml d&#39;éthanol à 100% dans 100 ml d&#39;une solution MTZ à une concentration finale de 1,5% juste avant l&#39;utilisation. </li><li> Préparer 500 ml d&#39;une solution de travail adulte MTZ. Faire une solution fraîche 10 mM MTZ en dissolvant 0,83 g MTZ poudre dans 0,1% de DMSO dans 500 ml d&#39;eau du système. Dissoudre la poudre MTZ complètement par agitation vigoureuse. Faire une solution fraîche MTZ et utiliser une feuille d&#39;aluminium pour empêcher la dégradation photocatalytique de MTZ. </li><li> Préparer 1 tampon L PEM. Dissoudre 30,2 g TUYAUX, 0,74 g EGTA, et 0,12 g MgSO 4 dans de l&#39; eau distillée. Ajuster le pH à 7 avec NaOH. Amener le volume final à 1 L avec de l&#39;eau distillée. </li></ol> 2. Préparation de larvaire Zebrafish <ol><li> Mettre en place l&#39; accouplement de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulte avec Tg (hand2: EGFP) PD24 13 zebrafish adulte dans des réservoirs d&#39;accouplement. Utilisez diviseurs pour effectuer l&#39;accouplement chronométré. </li><li> Retirez le divider le lendemain matin et permettre aux poissons de s&#39;accoupler sans interruption. embryons de récolte 2 heures plus tard par la tension de l&#39;eau du système et le transfert des embryons en 100 mm boîtes de Pétri avec un milieu d&#39;embryon. </li><li> Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri. En vertu d&#39;un stéréomicroscope, enlever les œufs non fécondés à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. Cultiver des embryons à 28 ° C et ajouter phénylthiourée (PTU) à une concentration finale de 0,003% après 10 heures post-fécondation (HPF) pour inhiber le développement de pigment. </li></ol> 3. L&#39;éthanol, le traitement métronidazole et la régénération du foie dans larvaire Zebrafish <ol><li> Préparer une solution d&#39;EtOH en ajoutant de l&#39;éthanol dans le milieu de l&#39;embryon à une concentration finale de 1,5%. Ne pas ajouter de PTU. </li><li> Traiter les embryons avec une solution d&#39;éthanol à 20 ml par boîte de Petri de 56 à 80 HPF. Couvrir les boîtes de Pétri avec une pellicule de plastique pour empêcher l&#39;éthanol évaporation. </li><li> Trier [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 </sup&gt;; Tg (hand2: EGFP) PD24] larves avec la taille du foie similaire, tel que déterminé par l&#39; expression de la PCP, à 80 HPF. Ne pas utiliser Tricaine lors du tri des larves de EtOH traité parce que cela va provoquer des taux de mortalité élevé avec traitement ultérieur EtOH / MTZ. Gardez les larves triées à une densité de 30 embryons par boîte de Pétri. </li><li> Préparer frais mM MTZ 15 dans le milieu de l&#39;embryon dans 0,1% de DMSO. Ajouter la quantité appropriée de l&#39;EtOH dans une solution de MTZ pour obtenir une concentration finale de 1,5%. Incuber larves dans 20 ml de solution EtOH / MTZ par boîte de Pétri pendant 24 heures à 28 ° C. Couvrir les boîtes de Pétri avec une pellicule de plastique pour maintenir la concentration EtOH et de papier d&#39;aluminium pour protéger de la lumière. </li><li> A la fin du traitement, éliminer la solution EtOH / MTZ en transférant les larves à de nouvelles boîtes de Pétri avec un milieu d&#39;embryons frais. Laver les larves 3 fois avec le milieu de l&#39;embryon et les conserver dans 20 ml de milieu d&#39;embryon sans PTU. </li><li> Pour trier les larves avec l&#39;ablation presque complète des hépatocytes, observer la fluorescencesous un microscope à épifluorescence avec le filtre de PDC à un grossissement de 80X. les résultats d&#39;ablation avec succès dans un minimum de fluorescence PCP dans le foie et le volume du foie réduit de manière significative. </li><li> Pour éviter la mort des larves EtOH / MTZ-traité, ne pas utiliser Tricaine pour le tri. Fixer les larves pour immunocoloration (voir la section 5) ou de garder les larves trié dans des boîtes de Pétri à 28 ° C pour d&#39;autres analyses. </li></ol> 4. Ecrans chimiques dans EtOH / MTZ-traité larvaire Zebrafish <ol><li> Apportez les plaques à 96 puits contenant 10 mM stocks de produits chimiques dans le DMSO (se référer à la liste des matières pour les détails concernant les bibliothèques chimiques commerciales) à partir de -80 ° C congélateur. Couvrir de papier d&#39;aluminium pour empêcher la dégradation photocatalytique de produits chimiques. Décongeler les solutions mères à la température ambiante avec doux balancement. </li><li> Préparer des solutions chimiques par dilution de solutions mères à 10 mM avec du milieu d&#39;embryon jusqu&#39;à une concentration finale de 50 uM (dans des plaques à 96 puits: s initialcreen; dans 1,5 ml tubes: réanalyse). Les larves de contrôle ont été traitées avec des concentrations égales de DMSO dans du milieu d&#39;embryon. </li><li> Les larves de transfert avec presque complète l&#39;ablation des hépatocytes, qui ont été traités avec 1,5% EtOH / mM MTZ 15 et trié comme mentionné ci-dessus, soit 96 puits (écran initial) ou 24 puits (retester) plaques prérempli avec le milieu de l&#39;embryon à une densité de 5 larves par puits. Utilisez des puits en double pour chaque produit chimique. </li><li> Éliminer le milieu de l&#39;embryon et ajouter soit 250 ul (plaques à 96 puits) ou 500 ul (plaques à 24 puits), des solutions chimiques à chaque puits. Plaques de recouvrement avec une feuille d&#39;aluminium et de traiter les larves de 50 h à 28 ° C. Inspecter les larves de produits chimiques de trempage quotidien et retirer toutes les larves mortes dans des puits individuels. </li><li> A la fin du traitement chimique, d&#39;observer le nombre et / ou l&#39;intensité de la PCP hépatocytes exprimant sous un microscope à épifluorescence avec le filtre de PDC à un grossissement de 80X. Photo montrant des larves vivantes améliorée ou réduirenuméro d et / ou l&#39;intensité des hépatocytes de la PCP exprimant avec un appareil photo numérique pour les enregistrements. </li><li> Préserver les larves par fixation de formaldéhyde pour l&#39;imagerie confocale comme décrit dans la section 5. </li><li> Pour tester à nouveau les produits chimiques qui facilitent la régénération hépatocytaire dans l&#39;écran initial, examiner leur activité à des concentrations supérieures et inférieures pour trouver la concentration la plus efficace avec les procédures décrites dans 4.1-4.5 ( «réanalyse»). </li></ol> 5. larvaire Zebrafish Fixation, immunocoloration et imagerie confocale <ol><li> Anesthésier larves par l&#39;addition Tricaine à une concentration finale de 0,02%. 10-15 larves transférer dans un tube de 1,5 ml et laver une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer PBS et ajouter 1 ml de fraîchement préparé 2% de formaldéhyde dans un tampon PEM pour fixer O / N à 4 ° C. ATTENTION: Formaldéhyde provoque une irritation et est connu pour être cancérigène pour l&#39;homme. Manipuler dans une hotte chimique. </li><li> Jeter la solution de fixation appropriée puis wash 3 fois avec du PBS à température ambiante. Les larves fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu&#39;à plusieurs jours. En procédant à l&#39;étape suivante donne rapidement de meilleurs résultats immunocoloration. </li><li> Retirez délicatement le jaune et la peau recouvrant la région du foie en utilisant un # 55 forceps sous un stéréomicroscope. </li><li> Et perméabiliser les larves de bloc dans un tampon bloc (4% d&#39;albumine de sérum bovin et 0,3% de Triton X-100 dans du PBS) O / N à 4 ° C. </li><li> Incuber avec un anticorps de lapin anti-collagène I à une dilution de 1: 100 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois pendant 15 minutes chacune avec le tampon de lavage (0,3% de Triton X-100 dans du PBS). </li><li> Incuber avec AlexaFluor 647 âne conjugué anticorps anti-lapin à une dilution de 1: 200 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois pendant 15 min chacune avec le tampon de lavage. Ensuite, laver une fois avec du PBS. </li><li> transférer doucement les larves sur des lames de verre à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre, et les larves fixe orient avec le côté latéral gauche vers le haut. Retirer l&#39;excès de PBS en utilisant Kimwipes. Ajouter une goutte de milieu de montage, Et le joint couvercle en verre avec du vernis à ongles. Réalisation d&#39;imagerie confocale immédiatement est fortement recommandé. </li><li> Utiliser un système confocal équipé d&#39;un objectif 40X / 1,3 d&#39;huile pour capturer des images. Utilisez la force de laser à 20-50%. Capture d&#39;images de la pile Z à 1 pm intervalles. </li></ol> 6. Préparation des adultes Zebrafish <ol><li> Mettre en place l&#39; accouplement de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulte dans des réservoirs d&#39;accouplement. Récolte des embryons le lendemain matin en forçant l&#39;eau du système et le transfert des embryons dans 100 mm boîtes de Pétri avec un milieu d&#39;embryon. </li><li> Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri. En vertu d&#39;un stéréomicroscope, enlever les œufs non fécondés à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. Cultiver les embryons à 28 ° C et ajouter PTU à une concentration finale de 0,003% au bout de 10 HPF pour inhiber le développement des pigments. </li><li> A 4 dpf, utilisez Tricaine pour anesthésier les larves et les trier [Tg (fabp10a: CFP-NTR)gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larves. Laver Tricaine en changeant d&#39;embryon milieu frais plusieurs fois. Laisser les larves de récupérer à 28 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le rythme cardiaque normal de 120-180 battements par minute 18. </li><li> Soulever les larves triées pour 6-12 mois sur la base de la procédure standard 19. </li></ol> 7. Ethanol, traitement métronidazole et Régénération hépatique à l&#39;âge adulte Zebrafish <ol><li> Transfert 6-12 mois [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] zebrafish adulte aux réservoirs d&#39;accouplement à l&#39; aide d&#39; un filet. Gardez le poisson à une densité de pas plus de 10 poissons par réservoir. </li><li> Préparer une solution d&#39;EtOH, en ajoutant de l&#39;EtOH dans l&#39;eau du système jusqu&#39;à une concentration finale de 1%. Traiter les poissons adultes avec 500 ml de solution de EtOH dans chaque réservoir et de les maintenir dans un incubateur à 28 °. </li><li> poissons Transfert adulte à la solution de EtOH frais tous les jours, rejets de poissons morts prop de poissonErly comme un biohazard. traiter en continu les animaux pendant 72 heures avant le traitement MTZ. </li><li> Préparer une solution fraîche mM MTZ 10 dans l&#39;eau du système dans 0,1% de DMSO. Préchauffer la solution de MTZ dans un incubateur à 28 °. Traiter le poisson avec 500 ml de solution MTZ dans 1 L réservoir de passage pendant 8 heures à 28 ° C, protéger de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Observez toutes les heures pendant le traitement et enlever les poissons morts immédiatement. Jeter les poissons morts correctement comme un danger biologique. A la fin du traitement MTZ, laver MTZ en transférant les animaux à l&#39;eau du système frais deux fois. </li><li> Permettre aux animaux de récupérer et de les maintenir dans un incubateur à 28 ° C. Nourrir et transférer le poisson à l&#39;eau du système frais tous les jours jusqu&#39;à ce que le point de temps pour les analyses. </li></ol> 8. Adulte Zebrafish Foie Fixation, immunocoloration et imagerie confocale <ol><li> Anesthetize poissons adultes avec 0,02% Tricaine et euthanasier dans l&#39;eau glacée pendant 15 minutes. Pat le poisson sec sur une serviette en papier et placez-le sur un tapis de dissection. </li><li> Exposer les organes gastro - intestinaux en enlevant la peau et les muscles comme précédemment décrit 20. Utilisez des ciseaux pour couper la peau et le muscle sous-jacent le long du ventre de la nageoire anale à l&#39;opercule, puis en arrière le long du côté du poisson à la nageoire anale. </li><li> Mettez le poisson dans un tube conique de 15 ml et laver une fois avec du PBS. Retirer du PBS et ajouter 4 ml de fraîchement préparé 2% de formaldéhyde dans un tampon PEM pour fixer O / N à 4 ° C. </li><li> Jeter la solution de fixation correctement, et laver 3 fois avec du PBS à la température ambiante. des échantillons fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs jours. En procédant à l&#39;étape suivante donne immédiatement de meilleurs résultats immunocoloration. </li><li> Disséquer tout l&#39;intestin au foie de la cavité du corps du poisson en coupant l&#39;oesophage. Incluez les organes gastro-intestinaux avec 4% à faible point de fusion d&#39;agarose dans un moule sectionner. </li><li> Utilisez un vibratome pour couper des échantillons dans des sections transversales à 50 um intervalles dans le froid de la glace PBS, à partir de l&#39;extrémité antérieure. Transfert sections à plaque de 6 puits avec du PBS en utilisant un pinceau # 1. </li><li> Perméabiliser et sections de bloc dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. </li><li> Incuber avec un anticorps de lapin anti-collagène I à une dilution de 1: 100 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois, 15 min chacun avec le tampon de lavage. </li><li> Incuber avec AlexaFluor 647 âne conjugué anticorps anti-lapin à une dilution de 1: 200 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois, 15 min chacun avec un tampon de lavage et une fois avec PBS. </li><li> transférer doucement sections sur des lames de verre à l&#39;aide d&#39;un pinceau # 1. Enlever l&#39;excès de PBS en utilisant Kimwipes, ajoutez une goutte de milieu de montage, et le verre de couverture de joint avec du vernis à ongles. Réalisation d&#39;imagerie confocale immédiatement est fortement suggéré. </li><li> Utiliser un système confocal équipé d&#39;un objectif 40X / 1,3 d&#39;huile pour capturer des images. Utilisez la force de laser à 20-50%. Capture d&#39;images de la pile Z à 1 pm intervalles. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous avons observé HPC à médiation par régénération des hépatocytes dans le foie se rétablissent EtOH / MTZ traités, ce qui suggère que, même en présence d&#39;une quantité importante de protéines de la MEC, notamment le type de collagène fibrillaire, les CAH conservent leur aptitude à se régénérer en hépatocytes. Le MTZ que le traitement n&#39;a pas augmenté le dépôt de protéines ECM de manière significative, alors que le seul traitement EtOH n&#39;a pas induit l&#39; activation du HPC 15. En utilisant le tr...

En dépit de la capacité de régénération des hépatocytes remarquable 1, qui sont le principal type de foie de cellules parenchymales, l&#39; insuffisance hépatique chronique affecte cette capacité, conduisant à une cellule progénitrice hépatique (HPC) de régénération -dépendante 2. Des dommages au foie chronique provient principalement de l&#39; abus d&#39;alcool, le virus de l&#39; hépatite C chronique (VHC) 3 et non-alcoolisées maladie du foie gras (NAFLD) 4. Elle conduit à une fibrose hépatique soutenue, qui est associée à l&#39;accumulation de protéines de matrice extracellulaire (ECM). Persistance accumulation ECM déforme l&#39; architecture hépatique intacte en formant un tissu de cicatrice fibreuse 5, ce qui entraîne par la suite dans la cirrhose avec une forte morbidité et la mortalité. De nombreuses tentatives ont été faites pour atténuer la réponse fibrotique principalement en se concentrant sur ​​l&#39; inhibition des cytokines et profibrogenic activés myofibroblastes 6. Ce dernier est principalement dérivé de cellules étoilées du foie (HSCs), les cellules non hépatiques parenchymateuses principaux responsables de la formation d&#39; une cicatrice hépatique 4. Néanmoins, les thérapies régénératives qui stimulent les sources cellulaires endogènes, y compris les CAH pour régénérer les hépatocytes en présence d&#39;insultes fibrogéniques soutenues attendent une enquête plus approfondie. De nombreux modèles expérimentaux de la fibrose hépatique ont été décrits chez les mammifères. Injection répétitive de tétrachlorure de carbone (CCl 4) a été largement utilisé pour induire une fibrose du foie chez les souris et de rat modèles 7. Lorsqu&#39;il est combiné avec un régime alimentaire riche en graisses (HF), l&#39; alcool conduit à une régulation positive substantielle de l&#39; expression du gène profibrogenic et la fibrose hépatique 8. Bien stéatose (accumulation de lipides) résulte de l&#39; exposition aiguë à l&#39;alcool, il rend le foie sensibles aux lésions hépatiques plus sévères 9. Le poisson zèbre, Danio rerio, a émergé comme un système modèle vertébré précieux pour l&#39; étude de la régénération. Bien qued&#39; autres vertébrés inférieurs tels que les tritons et les axolotls ont une remarquable capacité de régénération, le poisson zèbre a des avantages par rapport aux autres systèmes de modèle en ce qui concerne les stratégies de manipulation génétique et de visualisation nécessaires pour manipuler régénérative potentiel des facteurs 10. Le poisson zèbre constitue également un modèle vertébré attrayant pour étudier une maladie hépatique alcoolique (ALD) par simple addition d&#39;éthanol (EtOH) pour leur eau. L&#39; exposition aiguë EtOH à zebrafish larvaire et adulte a causé la stéatose hépatique 11-13. Lorsque le poisson zèbre adulte a reçu une exposition de EtOH prolongée, le dépôt de collagène a été observée avec une régulation positive de gènes liés à la fibrose 14. Cependant, il existe un besoin pour le développement de modèles pour étudier la régénération du foie en réponse à l&#39;EtOH comme un stimulant fibrogène. Récemment, nous avons développé un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish 15. Nous avons combiné un système d&#39;ablation génétique spécifique hépatocytes avec un traitement EtOH dans larvaire et adult poisson zèbre. Nous avons généré des deux lignées transgéniques, Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 et Tg (fabp10a: mCherry-NTR) gt2, dans lequel E. coli nitroreductase (NTR) sont fusionnées au cyan et mCherry protéine fluorescente, respectivement, sous le contrôle de la protéine de liaison 10a, le foie de base (fabp10a) promoteur acide gras spécifiques des hépatocytes. Dans ce système, NTR convertit un métronidazole promédicament non toxique (MTZ) dans un ADN inter-brin agent de réticulation 16, induisant la mort explicite des hépatocytes. En utilisant ce modèle, nous avons démontré qu&#39;une population de cellules hépatiques, qui sont sensibles à la signalisation Notch, converti en hépatocytes en la quasi-absence d&#39;hépatocytes et dans l&#39;excès de l&#39;ECM. Nous avons désigné ces cellules comme CAH. En outre, à travers des écrans chimiques, nous avons identifié les petites activateurs de molécules de signalisation Wnt et des inhibiteurs de la signalisation Notch qui augmentent la régénération hépatocytaire dans le foie fibrotique. Therefore, notre modèle de foie fibrotique chez le poisson zèbre représente un système de criblage chimique superbe par rapport à culture- cellulaire ou d&#39;un système de dépistage des mammifères à base. Il est un système in vivo avec des coûts importants et des avantages de gain de temps. Nous décrivons ici les procédures détaillées pour établir un modèle de foie fibrotique induit EtOH et pour réaliser des écrans chimiques en utilisant ce modèle chez le poisson zèbre. De plus, des analyses de temps cours ont été réalisées pour étudier la façon dont la régénération des hépatocytes se produit dans le foie fibrotique. Ce protocole fournira un outil précieux pour étudier les mécanismes et les stratégies de renforcement de régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique.

<table><tbody><tr><td>Sulfate de calcium hémihydraté (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Pipérazinediethanesulfonic (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N&prime ;,N&prime ; Acide -tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Métronidazole (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-phényl-2-thiourée (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-amino benzoïque ester éthylique (Tricaïne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Comprimé de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>Dissoudre un comprimé avec 100 ml d’eau distillée</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>à faible point de fusion agarose&nbsp ;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>Bibliothèque de composés de signalisation de cellules souches</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp ; stock mM dans DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K Bibliothèque</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp ; stock mM dans DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Dissoudre avec le DMSO à 10&nbsp ; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Dissoudre avec du DMSO à 10&nbsp ; Anticorps</td></tr><tr><td>anti-collagène I</td><td>mM Abcam</td><td>ab23730</td><td>Utilisation à 1:100 pour l’immunomarquage, réagit avec les poissons</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A31573</td><td>Utilisation à 1:200 pour l’immunocoloration</td></tr><tr><td>Milieux de montage (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de Pétri</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24 puits plaque</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Lame en verre</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Pellicule plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscope épifluorescent</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un fibrotique du foie modèle induite de l&#39;éthanol en zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes régénération

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Une fibrose hépatique soutenue avec poursuite de l’accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) entraîne la perte de compétence cellulaire du foie, conduisant à une cirrhose avec dysfonctionnement hépatocellulaire. Parmi les multiples agressions hépatiques, l’abus d’alcool peut entraîner d’importants problèmes de santé, notamment une insuffisance hépatique et un carcinome hépatocellulaire. Néanmoins, l’identité des sources cellulaires endogènes qui régénèrent les hépatocytes en réponse à l’alcool n’a pas été correctement étudiée. De plus, peu d’études ont modélisé efficacement la régénération des hépatocytes sur les lésions induites par l’alcool. Nous avons récemment rapporté l’établissement d’un modèle de foie fibrotique induit par l’éthanol (EtOH) chez le poisson zèbre dans lequel les cellules progénitrices hépatiques (HPC) ont donné naissance à des hépatocytes lors d’une perte presque complète d’hépatocytes en présence d’un stimulus fibrogène. De plus, grâce à des criblages chimiques utilisant ce modèle, nous avons identifié plusieurs petites molécules qui améliorent la régénération des hépatocytes. Nous décrivons ici en détail les procédures pour développer un modèle de foie fibrotique induit par l’EtOH et pour effectuer des criblages chimiques à l’aide de ce modèle chez le poisson zèbre. Ce protocole sera un outil essentiel pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique. De plus, ces méthodes faciliteront la découverte potentielle de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies chroniques du foie in vivo.

La figure 1 montre le développement d&#39;un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish larvaire. Pour optimiser un protocole pour exposer les larves du poisson zèbre, EtOH, nous avons d&#39;abord évalué la toxicité EtOH. 2,5 jours post-fécondation (dpf) larves ont été exposées à une concentration EtOH 1%, 1,5%, ou 2% pendant 24 heures suivie d&#39;une concurrente 24 h EtOH traitement / MTZ. L&#39;exposition à 2% d&#39;EtOH a provoqué une mortalité élevée, tandis qu...

Une fibrose soutenue avec dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire conduit à la cirrhose. L’abus d’alcool est l’une des principales causes de maladies graves du foie. Nous avons établi un modèle de foie fibrotique de poisson-zèbre induit par l’éthanol pour étudier les mécanismes et les stratégies de promotion de la régénération des hépatocytes lors de lésions induites par l’alcool.

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

L'objectif général de ce protocole est d'établir un modèle de foie fibrosé induit par l'éthanol chez le poisson zèbre et de réaliser des criblages chimiques en utilisant ce modèle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération hépatique, telles que les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les hépatocytes se régénèrent dans le foie fibrosé.Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet un criblage chimique in vivo économique et rapide. En outre, une analyse détaillée en fonction du temps peut être réalisée grâce à la visualisation d'une cellule unique. La procédure sera démontrée par Mianbo Huang, postdoctorant, et Jin Xu, étudiant diplômé, du laboratoire.Après avoir préparé les réactifs selon le protocole indiqué dans le texte, installer des aquariums d'accouplement avec des séparateurs en utilisant des zebrafish transgéniques adultes porteurs de la protéine de liaison aux acides gras 10a : CFP-NTR avec Tp1 : mCherry et des zebrafish Tg(hand2 : EGFP). Le lendemain matin, deux heures après le retrait des séparateurs, récolter les embryons en filtrant l'eau du système et en transférant les embryons dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres contenant du milieu pour embryons. À 56 heures post-fécondation, ou HPF, ajouter 1,5 pour cent d'éthanol aux embryons.Utilisez du film plastique pour couvrir les plaques afin d'éviter l'évaporation de l'éthanol. Incubez ensuite à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Préparez du MTZ frais à 15 millimolaire et du milieu pour embryons contenant 0,1 pour cent de DMSO, puis ajoutez de l'éthanol pour obtenir une concentration finale de 1,5 pour cent.Ensuite, à 80 HPF, traiter les embryons triés avec 20 millilitres de solution d'éthanol MTZ par boîte de Pétri. Utiliser du film plastique pour couvrir les boîtes afin de prévenir l'évaporation de l'éthanol et recouvrir de papier d'aluminium pour les protéger de la lumière. Puis incuber à 28 degrés Celsius pendant 24 heures.Le jour suivant, observer les embryons au microscope épifluorescent à l’aide d’un filtre CFP et d’un grossissement de 80x afin de trier les larves présentant une ablation quasi complète des hépatocytes. Pour réaliser des criblages chimiques, retirer les plaques de 96 puits contenant des stocks chimiques à dix millimolaires dans du DMSO du congélateur à moins 80 degrés. Utiliser du papier d’aluminium pour couvrir les plaques afin d’éviter la dégradation photocatalytique des produits chimiques et les décongeler par agitation douce à température ambiante.Dans des tubes de 1,5 millilitre, préparez des solutions chimiques en diluant cinq microlitres de solutions mères de dix millimolaire avec un millilitre de milieu pour embryon pour obtenir une concentration finale de 50 micromolaire. Ensuite, transférez cinq larves par puits présentant une ablation quasi complète des hépatocytes dans des plaques de 24 puits remplies de milieu pour embryon. Puis, retirez le milieu pour embryon et ajoutez 500 microlitres des solutions chimiques dans chaque puits.Avec du papier d'aluminium, couvrez les boîtes de Pétri et incubez les larves à 28 degrés Celsius pendant 50 heures. Après l'incubation, observez le nombre et/ou l'intensité des hépatocytes exprimant le CFP au microscope épifluorescent à un grossissement de 80x. Capturez des images de larves vivantes présentant un nombre accru ou réduit et/ou une intensité modifiée des hépatocytes exprimant le CFP.Installer des accouplements de zebrafish transgéniques contenant la protéine de liaison aux acides gras 10a :CFP-NTR avec TP1:mCherry et élever les larves triées jusqu'à l'âge de six à douze mois. Utiliser un filet pour transférer les zebrafish transgéniques adultes vers des aquariums d'accouplement. Préparer un mélange frais d'un pour cent d'éthanol dans de l'eau de système, puis utiliser 500 millilitres de cette solution pour remplacer l'eau de système dans les aquariums d'accouplement.Incuber les aquariums à 28 degrés Celsius pendant 72 heures, en transférant les poissons dans une solution fraîche d'éthanol et en éliminant quotidiennement les poissons morts durant l'incubation. Préparer une solution fraîche de MTZ à dix millimolaire dans de l'eau de système contenant 0,1 pour cent de DMSO, puis ajouter 500 millilitres de solution de MTZ préchauffée aux poissons dans des aquariums d'accouplement d'un litre. Utiliser du papier d'aluminium pour couvrir les aquariums.Incuber à 28 degrés Celsius pendant huit heures et analyser selon le protocole décrit dans le texte. Après avoir anesthésié selon le protocole décrit dans le texte, exposer les organes gastro-intestinaux en utilisant des ciseaux pour couper la peau et le muscle sous-jacent le long du ventre, de la nageoire anale jusqu'à l'opercule. Ensuite, couper en arrière le long du flanc du poisson jusqu'à la nageoire anale.Placer le poisson dans un tube conique de quinze millilitres et laver une fois à l'aide de PBS. Ensuite, retirer le PBS et ajouter quatre millilitres de formaldéhyde à trois pour cent fraîchement préparé dans un tampon PEM. Incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit pour fixer le poisson.Le jour suivant, après avoir lavé les échantillons conformément au protocole indiqué dans le texte, couper l'œsophage afin de disséquer l'intestin complet avec le foie depuis la cavité corporelle. Ensuite, placer les organes gastro-intestinaux dans un moule à inclusion et utiliser de l'agarose à bas point de fusion à quatre pour cent pour inclure le tissu. Puis, tailler le bloc en forme de trapèze et le coller sur la base.Ensuite, utilisez un vibratome et, en partant de l'extrémité interne du tissu, découpez des échantillons en sections transversales par intervalles de cinquante micromètres dans du PBS glacé. Utilisez un pinceau de taille n°1 pour transférer les sections dans une plaque de six puits contenant du PBS. Après immunomarquage des sections selon le protocole décrit dans le texte, utilisez un pinceau de taille n°1 pour transférer délicatement les sections sur des lames de verre.Utilisez des mouchoirs en papier pour éliminer l'excès de PBS avant d'ajouter une goutte de milieu de montage et une lame couvre-objet. Scellez ensuite la lame couvre-objet avec du vernis à ongles. Enfin, à l'aide d'un système confocal équipé d'un objectif à immersion huile 40x 1,3 NA, capturez des images en Z-Stack à une intensité de 20 à 50 pour cent et des intervalles d'un microampère.Cette figure montre que les larves traitées à l'éthanol et au MTZ développent une courbure vers le haut du tronc et de la queue, un œdème péricardique et une incapacité à gonfler la vessie natatoire. Comme on le voit ici, les foies contrôles traités au DMSO ne présentaient aucun dépôt de collagène de type I fibrillaire. En revanche, les foies traités à l'éthanol et au MTZ montraient une accumulation accrue de collagène de type I aux moments 25 et 50 heures après l'ablation.En outre, par rapport aux foies contrôles traités au DMSO, les CSH ont augmenté en nombre et adopté une forme de myofibroblaste dépourvue de prolongements cytoplasmiques dans les foies régénérants traités à l'éthanol et au MTZ. Cette figure illustre le développement d'un modèle de foie fibrosé induit par l'éthanol chez des zebrafish adultes traités avec un pour cent d'éthanol suivi de MTZ. D'après ces analyses cinétiques, un dépôt significativement accru de collagène de type I a été observé dans les foies régénérants traités à l'éthanol et au MTZ aux jours deux, trois et quatre après l'ablacion, comparé aux foies traités au DMSO.Dans cette expérience de criblage chimique, les hépatocytes ont été ablatés en présence de 1,5 pour cent d'éthanol et de 15 millimolaire de MTZ. Ensuite, les larves ont été exposées à des produits chimiques pendant 50 heures. Un certain nombre d'agonistes de wint, tels que des inhibiteurs de la glycogène synthase kinase-3 et un activateur de wint, ont favorisé la régénération des hépatocytes par rapport au DMSO.Ces données suggèrent que ce modèle fibrotique durable constitue un outil précieux pour découvrir des petites molécules qui favorisent la régénération des hépatocytes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'obtenir une ablation quasi complète des hépatocytes et de maintenir la concentration d'éthanol tout au long de la procédure.Après avoir suivi cette procédure, l'efficacité des composés chimiques identifiés peut être testée dans des modèles de lésions hépatiques chez les mammifères. Après son développement, cette technique peut ouvrir de nouvelles voies dans le domaine de la thérapie de régénération cellulaire afin d'explorer la découverte potentielle de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant d'insuffisance hépatique chronique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de développer un modèle de foie fibrosé induit par l'éthanol chez le zebrafish et de la façon d'effectuer des criblages chimiques.N'oubliez pas que le travail avec le formaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et la manipulation du réactif sous une hotte chimique, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Biologie du développement

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires des dommages induite par l'éthanol de développement, nous avons développé un modèle de poisson zèbre de l'exposition et l'éthanol sont à explorer les caractéristiques physiques, des altérations cellulaires et génétiques qui se produisent après exposition à...

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Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu'elle permet d'examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire...

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Pour aider à évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération biliaire du foie due au poisson-zèbre, nous avons établi un modèle de lésion hépatique dans lequel les hépatocytes exprimant la nitroréductase sont génétiquement ablatés lors d’un traitement au métronidazole.  Dans ce protocole, nous décrivons comment manipuler, surveiller et analyser habilement l’ablation des hépatocytes et la régénération hépatique induite par les voies biliaires.

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

Ce protocole décrit des analyses histologiques des foies provenant de larves de poissons zèbres qui ont été traitées avec 2% d'éthanol pendant 24 h. Un tel traitement aigu de l'éthanol entraîne une stéatose hépatique et un gonflement du système vasculaire hépatique.

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Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d'évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.

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Ce protocole décrit les procédures pour induire des lésions rénales aiguës (AKI) chez le poisson zèbre adulte utilisant le cisplatine comme agent néphroxique. Nous avons détaillé les étapes pour évaluer la reproductibilité de la technique et deux techniques pour analyser l’inflammation et la mort cellulaire dans le tissu rénal, la cytométrie d’écoulement et TUNEL, respectivement.

Modèle aigu de lésion rénale induit par le cisplatine chez le poisson zèbre adulte

Ce protocole décrit la procédure pour enlever le lobe ventral du foie dans le poisson zèbre adulte pour permettre l’étude de la régénération de foie.

Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Ici, nous présentons comment générer un modèle de poisson zèbre associé à la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) associé au carcinome hépatocellulaire (CHC) pour étudier l’impact du surplus de cholestérol sur le microenvironnement hépatique et le paysage des cellules immunitaires.

Analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Nous présentons ici un protocole de transplantation de cellules à haute résolution spatiale et temporelle chez des embryons et des larves de poisson-zèbre à n’importe quel stade entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation.

Transplantation cellulaire à haute résolution chez le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire

Découvrez comment établir un modèle de fibrose hépatique induite par l'éthanol chez le zebrafish pour étudier la régénération des hépatocytes. Cette méthode permet des criblages chimiques efficaces et une analyse temporelle détaillée des mécanismes cellulaires.

Développement dun fibrotique du foie Modèle induite de léthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération (Vidéo) | JoVE Journal

Développement d'un fibrotique du foie Modèle induite de l'éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

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