Préparation et analyse des In vitro Trois Breast Dimensional Carcinome Surrogates

L’objectif global de cet ensemble de procédures est de générer des cultures cellulaires tridimensionnelles pour fonctionner comme des mères porteuses du cancer du sein in vitro, et de présenter une méthode de mesure de la croissance cellulaire dans des coupes histologiques des mères porteuses. La culture cellulaire tridimensionnelle est une méthode plus pertinente sur le plan physiologique pour modéliser le comportement cellulaire in vitro que la culture cellulaire bidimensionnelle. En modifiant la composition cellulaire dans des conditions expérimentales, cet ensemble de procédures peut être adapté pour répondre à une variété de questions biologiques et pour évaluer l’efficacité de thérapeutiques candidates.

Pour incorporer les cellules dans l’ECM, sur de la glace, ajoutez les cellules et les quatre premiers composants associés énumérés dans le tableau un du manuscrit ci-joint, dans un tube de microcentrifugation de deux millimètres. Ensuite, mélangez-les délicatement par pipetage et évitez de former des bulles. Surveillez le niveau de pH à l’aide du rouge de phénol dans le MEM 10XD pour vous assurer que le mélange présente une couleur rose orangé, indiquant un pH de sept.

Si le mélange apparaît jaune et que le pH est trop bas, ajoutez lentement 7,5 % de bicarbonate de sodium, une goutte à la fois, jusqu’à ce que la couleur appropriée soit atteinte. N’oubliez pas de garder le mélange sur de la glace et d’agir rapidement pour éviter la polymérisation prématurée de l’ECM. Pour les cultures 3D solides, maintenez la lame de la chambre sur de la glace pour éviter la polymérisation prématurée de l’ECM.

Pipetez lentement 100 microlitres du mélange ECM de cellule dans chaque puits de la lame de la chambre à huit puits, et pipetez le mélange ECM de cellule sur les bords du puits pour aider à mieux répartir le mélange. Ensuite, incubez les substituts à 37 degrés Celsius, soit cinq pour cent de CO2, pendant 45 minutes pour permettre la polymérisation ECM. Après quarante-cinq minutes, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant la durée de l’expérience.

Changez de milieu de culture tous les deux jours. Une limitation de la culture 3D est que la diffusion de l’oxygène et des nutriments dans le volume peut être insuffisante pour soutenir la viabilité cellulaire. L’ajout d’un système de bioréacteur peut aider à surmonter cette limitation et à améliorer la croissance.

Pour abondir de cultures 3D dans un système de bioréacteur, préparez et assemblez secrètement la partie du système de bioréacteur qui abrite les substituts. Dans une hotte de culture cellulaire, à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 26, injectez le mélange ECM cellulaire dans la zone du bioréacteur de perfusion conçu pour contenir des cellules, et passez rapidement à l’étape suivante. Pour assurer une distribution plus uniforme des cellules à l’intérieur des substituts, placez le composant du bioréacteur abritant les substituts dans un tube conique de 50 millilitres.

Faites pivoter en continu les substituts à 18 tr/min pendant l’incubation à 37 degrés Celsius dans un four d’hybridation in situ ou un incubateur pendant 45 minutes pour permettre la polymérisation ECM. Après polymérisation et l’ajout de fluide, connectez l’ensemble du bioréacteur à la pompe. Commencer la perfusion moyenne dans un incubateur à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de CO2.

Poursuivre la perfusion du milieu pendant toute la durée de l’expérience et changer le milieu de culture au besoin pour le plan d’expérience spécifique. À la fin de l’expérience, enfermez les mères porteuses dans du gel de traitement des échantillons pour garder les mères porteuses intactes pendant le traitement et faciliter la coupe histologique. Pour ce faire, faites fondre le gel de traitement de l’échantillon dans un bain-marie à 60 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Ensuite, pipetez environ 300 microlitres de gel de traitement d’échantillons dans le fond d’un cryomoule étiqueté. À l’aide d’une lame de scalpel et d’une pince, retirez soigneusement un substitut du bioréacteur ou du puits d’une lame de chambre à huit puits et placez-le dans les cryomoules contenant du gel de traitement des échantillons. Pipette environ 300 microlitres de gel de traitement d’échantillons pour couvrir le substitut dans le cryomoule.

Ensuite, incubez-le à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois que le gel de traitement de l’échantillon s’est solidifié, retirez le gel de traitement de l’échantillon contenant le substitut du cryomoule et placez-le dans une cassette de tissu. Si plus d’une mère porteuse doit être placée dans la même cassette de tissus, des colorants de marquage tissulaire peuvent être utilisés pour distinguer les échantillons après la fixation et le traitement.

Par la suite, placez la cassette de tissu contenant le substitut dans une formule tamponnée neutre à dix pour cent pendant dix à douze heures à température ambiante pour permettre une fixation complète. Après la fixation, transférez la cassette de tissu contenant le substitut à 70 % d’éthanol. La mère porteuse fixe est maintenant prête pour le traitement en paraffine et la section histologique ultérieure.

Pour mesurer la densité cellulaire et les images photomicroscopiques des sections colorées H et E, ouvrez un fichier image de la mère porteuse. À l’aide de l’outil Polygone d’ImageJ et des bords de l’ECM comme guide, tracez le contour de la zone du substitut en faisant glisser la souris et en cliquant pour créer des points d’ancrage. Une fois décrit, sélectionnez Mesurer sous l’onglet Analyser.

Ensuite, téléchargez les fichiers image utilisés pour mesurer la zone de substitution dans Cell Profiler en faisant glisser les fichiers image vers la liste des fichiers. Ensuite, attribuez un nom à chaque image importée dans le module Importation de noms et de types et sélectionnez le type d’image. Une fois le pipeline d’analyse généré, démarrez le mode Test et cliquez sur Exécuter dans le profileur de cellules.

Et évaluez les objets filtrés pour vous assurer que la majorité des noyaux de l’image de test sont correctement identifiés et que les paramètres optimaux sont choisis pour identifier les cellules. Les noyaux inclus seront entourés en vert. Ensuite, enregistrez le projet, quittez le mode de test et cliquez sur Analyser les images.

Voici une image représentative de la section colorée H et E d’une mère porteuse perfusée cultivée pendant sept jours. Et il s’agit d’une image représentative de la section colorée H et E d’un substitut solide cultivé pendant sept jours avec un milieu changé tous les deux jours. La cellularité est beaucoup plus faible chez les substituts solides.

Ce graphique montre la comparaison du nombre moyen de cellules nucléées par zone après sept jours de croissance. Un substitut perfusé et solide. Ces données numériques soutiennent la cellularité dans les photomicrographies des coupes colorées H et E.

Et ce graphique montre la comparaison de l’indice de marquage Ki-67, qui est le minimum de la prolifération cellulaire après sept jours de croissance de substituts perfusés et solides. Ces données confirment à nouveau une croissance plus importante des substituts perfusés. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’hybridation in situ et l’amino histochimie peuvent être effectuées sur des coupes histologiques des substituts pour répondre à des questions telles que l’expression de l’ARN et des protéines.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et du traitement des substituts tissulaires in vitro tridimensionnels, et de la réalisation d’une analyse de substitution sur des coupes histologiques colorées H et E.