Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

L’objectif global de cette méthode est de visualiser la structure de la matrice cardiaque en l’absence de cellules ou d’autres matériaux non matriciels. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la fibrose, en particulier comment les différences dans le contenu de la matrice peuvent affecter l’organisation de la matrice, et comment ces changements peuvent affecter différentes cardiomyopathies ou autres maladies fibrotiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une vue qualitative de la matrice qui peut être utilisée pour augmenter les mesures quantitatives.

Le Dr Galindo et le Dr Sawyer ont d’abord eu l’idée d’utiliser cette technique après avoir constaté que le traitement régulier des porcs post-infarctus présentait des changements dans l’expression des gènes qui étaient similaires aux changements dans le contenu de la matrice après le traitement. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés si elles n’ont pas d’expérience préalable dans la préparation d’échantillons MEB, en raison de la motricité fine requise. L’échantillon de tissu doit être suffisamment grand pour être facilement vu et stocké dans une solution de glutaraldéhyde à quatre pour cent à quatre degrés Celsius.

Retirez le mouchoir de la chambre froide et rincez-le à l’eau distillée. Ensuite, plongez le tissu dans une solution d’hydroxyde de sodium à 10 %, fabriquée à partir de granulés dans de l’eau. Assurez-vous de prendre les précautions appropriées.

Conservez le mouchoir dans la solution d’hydroxyde de sodium pendant six à 10 jours à température ambiante. Procédez lorsque la couleur du tissu devient blanc cassé ou blanche. Ensuite, rincez le tissu avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’il devienne transparent.

Ensuite, mettez des gants et plongez le tissu dans un pour cent d’acide tannique pendant quatre heures à température ambiante. Après le bain d’acide tannique, rincez le tissu à l’eau distillée pendant la nuit. En préparation, dans une hotte avec des gants, préparez une solution mère de 0,2 molaire de tampon de cacodylate de sodium et une solution mère aqueuse à deux pour cent de tétroxyde d’osmium.

Utilisez un pare-éclaboussures, car le tétroxyde d’osmium présente un grave risque d’inhalation. Maintenant, faites une dilution de 0,1 molaire du tampon de cacodylate de sodium et incubez le tissu pendant cinq minutes en agitant doucement. Changez le tampon deux fois pour laver le tissu au total trois fois avec du cacodylate de sodium.

Ensuite, faites un mélange individuel de cacodylate de sodium et de tétroxyde d’osmium. Incuber le tissu dans le nouveau mélange sur un rotateur pendant une heure. Plus tard, remettez le tissu dans du cacodylate de sodium de 0,1 molaire et incubez-le en l’agitant doucement pendant cinq minutes.

Changez cette solution de bain deux fois en 15 minutes. Ensuite, déshydratez le tissu à l’aide d’une série de bains d’éthanol à des concentrations croissantes. Laissez tremper le mouchoir pendant 15 minutes dans chaque bain en agitant doucement.

Ensuite, transférez le tissu et la solution dans une boîte de Pétri peu profonde remplie d’éthanol à 100 %. Ensuite, avec précaution, tenez deux lames de rasoir très tranchantes de sorte que les plats des côtés soient en contact l’un avec l’autre, et que les bords tranchants se croisent pour former les deux côtés d’un triangle équilatéral au-dessus de l’échantillon. Maintenant, utilisez votre main dominante pour placer la deuxième lame à l’extrême gauche de l’échantillon et coupez vers la droite.

Ainsi, faites glisser les lames l’une contre l’autre dans des directions opposées pour effectuer une seule coupe lisse avec une distorsion ou une force de déchirure minimale. L’objectif est d’exposer une surface aussi grande que possible sans endommager l’échantillon. Répétez le processus jusqu’à ce que suffisamment de sections efficaces satisfaisantes soient préparées pour l’examen par MEB.

À l’aide d’une spatule ou d’une pince à épiler, transférez le tissu dans le porte-échantillon du CPD, tout en gardant le tissu immergé dans de l’éthanol à 100 %. Le tissu ne peut pas être exposé à l’air pendant plus de quelques secondes. Utilisez le CPD pour remplacer l’éthanol par du dioxyde de carbone liquide et effectuez le cycle de séchage comme indiqué par le fabricant.

Ensuite, préparez un talon d’échantillon MEB pour chaque échantillon. Collez une languette adhésive en carbone sur la surface supérieure du talon d’aluminium. Sous un stéréoscope, collez soigneusement l’échantillon à la languette adhésive avec la surface de la section transversale d’intérêt vers le haut, à l’écart de la languette et au maximum plane avec la surface du talon.

Ne sondez pas et ne touchez pas la surface d’intérêt. Pour les spécimens les plus petits et les plus difficiles, cassez le bâtonnet applicateur en bois pour l’utiliser comme une spatule. Travaillez également sur une grande feuille de papier filtre pour éviter de perdre un échantillon tombé.

Pour une meilleure adhérence, utilisez un bâtonnet applicateur cassé pour faire un pinceau effilé et appliquez de la peinture à l’argent ou au carbone sur la base et les côtés de l’échantillon. Étendez une très fine ligne de peinture jusqu’à un bord de la surface d’intérêt. Cela créera un chemin de charge de la surface d’intérêt vers le sol.

Ensuite, appliquez deux ou trois petites touches de peinture autour du périmètre de la languette de carbone pour fournir un chemin conducteur de la surface de la languette au bout de métal. Cela fonctionne comme le sol. Mettez l’échantillon de côté et laissez sécher la peinture conductrice pendant deux heures.

Une fois sec, utilisez une coucheuse par pulvérisation cathodique pour appliquer une couche relativement épaisse d’alliage d’or et de palladium ou d’or sur l’échantillon. Un revêtement de 30 à 40 nanomètres d’épaisseur est souhaité. Effectuez la microscopie électronique à balayage à une tension d’accélération relativement faible pour minimiser les problèmes associés à une mauvaise dissipation de charge dans l’échantillon.

Utilisez le mode de pression variable s’il est disponible. Tout d’abord, améliorez la distance de travail pour fournir une profondeur de champ suffisante pour faire la mise au point sur les fibres de la dimension Z. Pour ce faire, ouvrez l’onglet Navigation en haut à droite.

Ensuite, accédez à l’onglet Coordonnées à partir du menu de la scène. Entrez une valeur plus grande pour la coordonnée Z, par exemple 20 millimètres. Enfin, appuyez sur l’onglet Aller à pour exécuter la modification.

Ensuite, positionnez la surface d’intérêt orthogonalement au faisceau d’électrons. Cliquez sur le bouton droit de la souris et maintenez-le enfoncé, puis faites-le glisser vers la gauche ou la droite pour faire la mise au point de l’échantillon près de la périphérie du plan de surface d’intérêt préparé. Prenez note de la distance de travail concentrée.

Ensuite, à l’aide du joystick manuel de l’interface utilisateur, déplacez la vue vers le bord opposé et répétez la méthode de mise au point. Si la distance de travail a changé, inclinez l’éprouvette pour obtenir une concordance approximative aux deux endroits. Utilisez l’onglet Coordonnées du menu Scène et entrez une valeur d’inclinaison dans la coordonnée T.

Maintenant, faites pivoter l’échantillon de 90 degrés en entrant cette valeur dans le champ de coordonnées R. Ensuite, répétez le processus d’inclinaison jusqu’à ce que toutes les positions soient mises au point à peu près à la même distance de travail. La technique décrite a été appliquée à des tissus cardiaques provenant d’un donneur de transplantation cardiaque humaine non utilisé.

La matrice cardiaque humaine est un tissage complexe de protéines réticulées qui a un motif en nid d’abeille dans une section transversale. Chaque structure en nid d’abeille mesure environ 40 microns de large, contournant normalement un seul myocyte. Lorsqu’ils sont reliés par des disques intercalaires, plusieurs myocytes cardiaques peuvent être envisagés comme une tige courant dans le sens de la longueur à travers une forme de tunnel.

En plus de fournir des informations structurelles, un MEB de tissus décellularisés peut permettre une évaluation qualitative significative en réponse à une lésion ou à des formes non préjudiciables de cardiomyopathie, telles que des tissus cardiaques infarctus d’un porc. Dans une étude distincte, l’isoforme GGF2 de NRG-1 bêta s’est avérée être un traitement thérapeutique potentiel pour l’insuffisance cardiaque. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de traiter les tissus, le tissu cardiaque, pour le microscope électronique à balayage, y compris la technique d’exposition de la surface d’intérêt et de montage de l’échantillon.

À la suite de cette procédure, d’autres techniques telles que la spécification de masse, le séquençage de l’ARN et divers autres tests peuvent être utilisées afin de mesurer les protéines de la matrice extracellulaire et d’autres phénomènes d’observation responsables de la signalisation et d’autres phénomènes d’observation organisationnels. N’oubliez pas non plus que le tétroxyde d’osmium est un produit chimique dangereux, en raison du potentiel de fixation en vapeur des muqueuses. N’oubliez jamais de travailler dans une hotte avec des gants en nitrile, à l’aide d’un pare-éclaboussures ou d’un châssis de capot.