Name: Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Découvrez la microscopie électronique à balayage du tissu cardiaque macéré pour visualiser la matrice extracellulaire. Cette technique permet d'étudier l'organisation de la matrice et ses implications dans les maladies fibrotiques et cardiomyopathies.

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Cette étude a été financée par des subventions des National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB) : K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
L’imagerie et le traitement tissulaire (après macération au NaOH) ont été réalisés grâce à l’utilisation de la ressource partagée d’imagerie cellulaire (CISR) du Vanderbilt University Medical Center (VUMC) (soutenue par les subventions NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 et EY08126). Nous sommes particulièrement reconnaissants aux directeurs principaux du CISR de VUMC (Dr Sam Wells et Dr W. Gray (Jay) Jerome) pour leurs précieux conseils techniques et pour avoir fourni de l’espace et des ressources de base dans le but de filmer la technique mise en évidence dans ce document. 
Nous tenons à exprimer notre plus profonde gratitude au Dr Yan Ru Su et à Mme Kelsey Tomasek du Laboratoire central de cardiologie pour la recherche translationnelle et clinique de l’Université Vanderbilt pour leur expertise technique et pour la collecte des échantillons de tissus humains utilisés dans cette étude.

Déclaration d&#39; éthique: Les protocoles pour la manipulation des animaux ont été approuvés par le Vanderbilt Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC, protocoles nombre M / 10/117 (porcine) et M / 10/219 (souris) et menées conformément aux normes AAALAC-International. l&#39;utilisation de tissus cardiaques humaines en banque a été approuvé par l&#39;Université Vanderbilt Medical Center IRB (numéro de protocole 100887). 1. Exemple de collecte et de stockage <ol><li> Faire frais glutaraldéhyde 4% dans un tampon phosphate 0,1 M (PB) solution. ATTENTION: glutaraldéhyde est toxique, porter des gants et des travaux dans une hotte. <ol><li> Faire une solution 0,2 M d&#39;actions de PB, pH 7,4 en utilisant 21,8 g de Na 2 HPO 4 et 6,4 g de NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) à dH 2 O. 1000 </li><li> Ajouter 400 ul de 50% de glutaraldéhyde à 2,5 ml de solution mère PB et 2,1 ml dH 2 O. </li></ol></li><li> Immerger un morceau (pas plus de 2 cm 2) du tissu dans la solution de glutaraldéhyde à 4%. Nota: Les morceaux plus petits peuvent également être utilisés mais ils doivent être de taille suffisante (pas inférieure à 5 mm 2) pour être facilement visualisés à l&#39;oeil nu, afin de faciliter les étapes ultérieures du protocole. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1 heure, puis stocker indéfiniment à 4 ° C. </li></ol> 2. décellularisation du tissu cardiaque <ol><li> Faire une nouvelle solution aqueuse à 10% de NaOH en utilisant 10 g de NaOH pellets / dH 2 O. 100 ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures aux alcalis, des gants portent. </li><li> Rincer le tissu dans dH 2 O. </li><li> Incuber dans une solution de NaOH à 10% à la température ambiante pendant 6 - 10 jours (jusqu&#39;à ce que les changements de tissus provenant de brun rougeâtre à blanc cassé ou blanc). </li><li> Rincer à l&#39; dH 2 O jusqu&#39;à ce que le tissu devient transparent. </li><li> Immerger le tissu dans de l&#39;acide tannique à 1% pendant 4 heures à la température ambiante. Utiliser 1 ml 5% solution mère par 4 ml dH 2 O. ATTENTION: L&#39;acide tanniqueest un puissant irritant, porter des gants. </li><li> Rincer à l&#39; dH 2 O nuit. </li></ol> 3. Osmication et Déshydratation du tissu cardiaque (dans des hottes pour la sécurité) <ol><li> Faire une solution 0,2 M d&#39;actions de tampon de cacodylate de sodium en utilisant cacodylate de sodium 21,4 g, 10,0 g de chlorure de calcium et 450 ml dH 2 O. Mélanger puis ajouter de l&#39; acide chlorhydrique au besoin pour ajuster le pH à 7,4. Qs à 500 ml avec dH 2 O. ATTENTION: cacodylate de sodium et de l&#39;acide chlorhydrique sont toxiques, porter des gants et des travaux dans une hotte. </li><li> Faites solution mère aqueuse à 2% de tétroxyde d&#39;osmium dans la hotte pour la sécurité en dissolvant 1 g de tétroxyde d&#39; osmium cristal dans 50 ml dH 2 O. ATTENTION: tétroxyde Osmium est un danger d&#39;inhalation sévère; fixation vapeur de membranes muqueuses ou des globes oculaires est possible, poignée donc seulement dans la hotte avec des gants. Un garde-boue est recommandé. </li><li> Rincer le tissu dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (mélanger la solution de stock 1: 1 avec dH <sub&gt; 2 O) pendant 5 min sur la coiffe (ou agitation douce). </li><li> Répétez l&#39;étape précédente à deux reprises, pour un total de trois rinçages tampons. </li><li> Immergez tissu dans 1% de tétroxyde d&#39;osmium dans 0,1 M tampon cacodylate de sodium (mix cacodylate stock sodium et le stock tétroxyde d&#39;osmium 1: 1) sur la coiffe pendant 1 h. </li><li> Rinçage du tissu dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M 3 fois pendant 5 min à chaque fois sur la coiffe. </li><li> Rincer le tissu en utilisant des concentrations croissantes d&#39;éthanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% et enfin 100%) pendant 15 min à chaque fois sur la coiffe. </li></ol> 4. Coupe transversale Préparation de la surface pour les SEM <ol><li> Transfert tissu dans 100% d&#39;éthanol à un plat peu profond de Pétri contenant également 100% d&#39;éthanol. </li><li> Tenir deux lames de rasoir très pointus, tels que les méplats des côtés sont en contact les unes avec les autres et les arêtes de coupe transversale pour former deux côtés d&#39;un triangle équilatéral au-dessus de l&#39;échantillon. Pour ce faire, utiliser la main gauche pour placer une lame sur le côté droit de l&#39;échantillon etcoupé vers la gauche. Dans le même temps, utiliser la main droite pour placer la deuxième lame à l&#39;extrême gauche de l&#39;échantillon et la tranche droite. Ainsi, les lames seront glissés les uns contre les autres dans des directions opposées pour faire une seule coupe lisse. </li><li> Faites glisser les côtés plats de la lame contre l&#39;autre pour faire une coupe très propre de l&#39;échantillon avec un minimum de distorsion ou de force d&#39;arrachement, exposant de préférence aussi grande surface que possible sans endommager l&#39;échantillon. </li><li> Répétez l&#39;opération pour chaque échantillon afin d&#39;exposer les plus propres possibles surfaces de section transversale pour examen dans le SEM. </li></ol> 5. Point critique Séchage (DPC) du tissu cardiaque <ol><li> Utilisez une spatule ou des pinces pour transférer le tissu sur le support du sèche-point critique (CPD) de l&#39;échantillon, veiller à ce que le tissu reste dans 100% d&#39;éthanol en tout temps. Assurez-vous que le support est immergé dans de l&#39;éthanol et que le transfert est réalisé avec le tissu exposé à l&#39;air pendant pas plus de quelques secondes. </li><li> Actionner CPD par nousle manuel er pour terminer 3 purge-and-cycles de remplissage pour remplacer l&#39;éthanol avec du dioxyde de carbone liquide. </li><li> Actionner CPD par le manuel de l&#39; utilisateur pour obtenir des points critiques séchage des échantillons et les retourner à la pression atmosphérique avec ventilation contrôlée de CO 2. </li></ol> 6. Montage de Specimens Coeur de tissus pour SEM <ol><li> Préparer un échantillon MEB pour chaque échantillon, en collant une étiquette autocollante de carbone à la surface supérieure de la fusée d&#39;aluminium. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope, respecter scrupuleusement l&#39;échantillon à l&#39;onglet adhésif avec la surface de section transversale d&#39;intérêt vers le haut (loin de l&#39;onglet, visible), et aussi près que possible de parallèle avec le plan de la surface échantillon de moignon. Ne pas sonder ou de toucher la surface d&#39;intérêt. </li><li> Casser un applicateur bâton de bois pour obtenir une brosse conique, idéal pour l&#39;application de peinture. Appliquer l&#39;argent ou de la peinture de carbone à la base et les côtés de l&#39;échantillon, pour améliorer l&#39;adhérence au bout. </li><li> Prolonger une ligne très mince d&#39;argent ou de carbone peindre jusqu&#39;à un bord de la surface d&#39;intérêt, pour fournir un trajet de charge de la surface d&#39;intérêt à la terre. </li><li> Appliquer 2 ou 3 petites taches de peinture d&#39;argent ou de carbone autour du périmètre de la languette de carbone, pour fournir un chemin conducteur à partir de la surface de patte de carbone dans l&#39;embout métallique, et donc à la masse. </li><li> Laisser la peinture conductrice à sécher pendant deux heures. </li><li> Actionner pulvérisation coucheuse par le manuel de l&#39;utilisateur d&#39;appliquer un revêtement relativement lourd (plage cible de 30 - 40 nm) d&#39;un alliage or-palladium ou de l&#39;or. La chambre de pompe de l&#39;échantillon à environ 0,1 mbar; régler la minuterie à 40 sec. Ouvrir le robinet de Set à 8:00 positions (débit de gaz Argon modérée). Appuyez sur Start pour lancer revêtement par pulvérisation à 30 mA. décharge luminescente Violet doit être visible dans la chambre d&#39;échantillon. </li></ol> 7. SEM L&#39;examen des échantillons de tissus cardiaques <ol><li> Effectuer microscopie électronique à balayage à relativement basse tension d&#39;accélération pour minimiser l&#39;imagerie problèmes associés à une mauvaise dissipation de charge dans l&#39;échantillon (en charge). condition d&#39;image initiale suggérée sont: 5 kV tension d&#39;accélération, 10 mm distance de travail. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un opérateur expérimenté, emploi a augmenté la distance de travail pour étendre la profondeur de champ dans des conditions d&#39;imagerie nécessitent l&#39;attention de fibres dans de multiples plans focaux, ou des fibres prorogeant pour une longueur considérable dans la dimension z. <ol><li> Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l&#39;accès à l&#39;interface utilisateur de l&#39;onglet de navigation en haut à droite. </li><li> Accédez à l&#39;onglet Coordonnées dans le menu de la scène. Pour augmenter la distance de travail, entrez une valeur supérieure en millimètres pour la coordonnée Z puis cliquez sur le Aller à onglet pour déplacer la platine d&#39;échantillon à la distance de travail est entré. </li></ol></li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un opérateur expérimenté, employer spécimen inclinaison et rotation pour positionner la surface d&#39;intérêt orthogonale au faisceau d&#39;électrons. inclinaison supplémentaire de 10 à 30 degrees de cette position peut améliorer l&#39;observation et la documentation de la structure de la matrice. <ol><li> Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l&#39;interface utilisateur, cliquez et maintenez le bouton droit de la souris, puis faites glisser à gauche ou à droite pour concentrer l&#39;échantillon près de la périphérie du plan de surface préparée d&#39;intérêt, notant la distance de travail focalisé . </li><li> Naviguer avec le Manuel Interface utilisateur joystick pour se déplacer près du bord opposé de la surface et répétez le focus. Si la distance de travail ne sont pas à peu près égale à la première position, l&#39;échantillon d&#39;inclinaison pour parvenir à un accord approximatif aux deux endroits en utilisant l&#39;onglet Coordonnées du menu de la scène (voir 7.2) et entrez une valeur d&#39;inclinaison dans le T de coordonnées. </li><li> Tournez spécimen quatre-vingt dix degrés (entrer la valeur en R champ Coordinate) et répétez le processus jusqu&#39;à ce que tous les postes sont concentrés à environ la même distance de travail. Remarque: la pression variable SEM peut être utilisé pour améliorer la dissipation de chargesi disponible. Vide élevé est le mode de fonctionnement standard pour la microscopie électronique à balayage. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cross préparation section de surface est l&#39;étape la plus critique au cours du protocole. Afin de préserver la structure fine, les échantillons déshydratés doivent rester en éthanol à 100% en tout temps jusqu&#39;à introduit dans le processus de séchage au point critique. Par conséquent, le découpage des échantillons pour réaliser des surfaces d&#39;examen EM doivent être effectués alors que les échantillons sont immergés dans de l&#39;éthanol dans un plat peu profond. Il est également essentiel que la surface exposé...

La fibrose perturbe le réseau normal de collagène myocardique, qui est essentiel pour les fonctions mécanistes normales des cardiomyocytes 1,2 ainsi que pour la communication intercellulaire, la signalisation intracellulaire et la survie cellulaire 3. Le développement de la fibrose est un déterminant majeur de la fonction cardiaque, et le remodelage fibrotique de l’interstitium cardiaque résultant de diverses étiologies entraîne une augmentation de la rigidité ventriculaire gauche et une dysfonction diastolique 4. La fibrose myocardique peut également entraîner des arythmies, et que la progression du remodelage fibrotique soit un phénomène général ou local, elle est fortement associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de cardiomyopathie ischémique et non ischémique 5. De même, l’absence de fibrose myocardique est un puissant prédicteur de la récupération fonctionnelle ventriculaire et de la survie à long terme 6. 
La caractéristique de la fibrose est le dépôt d’un excès de collagène, qui a la résistance à la traction de l’acier 7 et peut nuire à la fonction cardiomyocytaire à plusieurs niveaux. Les forces mécaniques résultant d’une matrice trop collagénique peuvent entraîner une atrophie des cardiomyocytes 8,9, une rigidité tissulaire passive 10, une rigidité myocardique induite par la contraction tonique 11-13 et une réduction de l’apport d’oxygène à la population restante de cardiomyocytes. Le couplage des jonctions lacunaires des cardiomyocytes et des myoFbs peut également compromettre les caractéristiques électriques du cœur, créant un risque accru de développement d’arythmies 14-16. La fibrose périvasculaire altère la réactivité vasomotrice des artères coronaires intramurales et des artérioles 17 et contribue au rétrécissement luminal qui réduit l’apport d’oxygène et donc la survie des cardiomyocytes 17-22. Un remodelage fibreux et électrique pathogène, émanant d’un site initial de lésion ischémique ou de déséquilibre énergétique, évolue inévitablement vers l’insuffisance cardiaque. 
La nécrose des cardiomyocytes initie la réponse fibrotique, et un remodelage fibrotique indésirable ultérieur peut survenir indépendamment de l’étiologie. Trouver un moyen de contrôler la fibrose cardiaque serait cliniquement bénéfique pour le traitement des cardiomyopathies ischémiques et idiopathiques, des cardiopathies hypertensives, de la cardiomyopathie hypertrophique, des cardiopathies valvulaires et des dystrophinopathies 23-42. Quelle que soit la façon dont le processus de la maladie fibrotique commence, les facteurs profibrotiques solubles peuvent traverser l’espace interstitiel et provoquer l’activation des fibroblastes interstitiels et adventiciels à des sites éloignés de la cicatrice fibrotique initiale, créant un effet de cascade qui conduit finalement à l’insuffisance cardiaque. Le scénario optimal serait d’exploiter le processus fibrillogène à l’aide d’un traitement ciblé qui peut être appliqué au cours de la phase hypertrophique compensative de la cardiomyopathie avant qu’elle ne progresse vers une défaillance de la pompe systolique, une insuffisance cardiaque diastolique ou d’autres résultats terminaux. L’objectif ultime serait d’inverser la fibrose afin que les cardiomyocytes morts puissent être remplacés et que la fonction cardiaque soit complètement restaurée. 
L’importance de la matrice est largement comprise, mais les méthodes d’étude de la matrice se limitent principalement à des mesures quantitatives des principaux composants structurels, en particulier le collagène, et aux niveaux relatifs des différentes protéines matricielles et matricellulaires. Ce protocole met en évidence une technique rarement utilisée et utile pour évaluer les différences qualitatives dans la matrice cardiaque. Cette technique a été récemment utilisée pour comparer et contraster les différences fondamentales dans les matrices cardiaques de différentes étiologies de maladies cardiaques (dans les explants humains), pour examiner les cœurs de porcs post-infarctus traités avec l’isoforme du facteur de croissance gliale (GGF) de la neuréguline-1β, par rapport aux animaux non traités 43, et pour sonder les différences dans les matrices des tissus cardiaques de mdx souris (un modèle animal couramment utilisé de la dystrophie musculaire de Duchenne) à différents âges et par rapport à des témoins de type sauvage. Cette technique a été introduite pour la première fois par les Drs Caulfield et Borg en 1979 44, mais peu d’études ont depuis utilisé cette puissante technique 45-47, réintroduite ici avec seulement de légères modifications. Cette méthodologie est un outil de recherche précieux, car elle fournit des informations qualitatives sur l’ultrastructure de la matrice extracellulaire qui pourraient autrement être négligées lors de la simple mesure de la teneur en composants de la matrice et/ou du niveau de fibrose.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Adhésif au carbone</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Languettes adhésives au carbone</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>77825</td><td>à commander pour s’adapter aux talons</td></tr><tr><td>Lames de rasoir à double tranchant Acier inoxydable</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/paquet</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>électronique Microscopie Sciences</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Glutéraldéhyde, solution à 50 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16310</td><td>EM, distillation purifiée</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16760 ou 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Phosphate monosodique NaH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmium </td><td>Microscopie électronique tétroxyde Sciences</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Adhésif conducteur d’argent</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Acide tannique, 5 % Aqueux&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium trihydraté</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Alliage or-palladium ou Gold</td><td>Refining Systems, Inc.&nbsp ;</td><td>varie</td><td>selon la marque et le modèle de la machine à vervoir par pulvérisation cathodique</td></tr><tr><td>Sécheur à point critique</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs en bois ordinaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 MEB environnemental</td><td>FEI</td><td>Q250 MEB</td><td></td></tr><tr><td>Coucheuse par pulvérisation cathodique</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Modèle 108</td><td></td></tr><tr><td>Stubs d’échantillons de MEB en aluminium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>75220-12</td><td>spécifique au miscroscope</td></tr></tbody></table>

microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

La fibrose est une composante de toutes les formes de maladies cardiaques, quelle que soit leur étiologie, et bien que de nombreux progrès aient été réalisés dans le domaine de la biologie de la matrice cardiaque, il existe encore des lacunes majeures liées à la façon dont la matrice est formée, à la façon dont le remodelage physiologique et pathologique diffère et, surtout, à la façon dont la dynamique de la matrice pourrait être manipulée pour favoriser la guérison et inhiber la fibrose. Il n’existe actuellement aucune option de traitement pour contrôler, prévenir ou inverser la fibrose cardiaque. Une partie de la raison est probablement la complexité de la formation de cicatrices cardiaques, comme cela se produit après un infarctus du myocarde pour remplacer immédiatement les cardiomyocytes morts ou mourants. La matrice extracellulaire elle-même participe au remodelage en activant les cellules résidentes et aussi en aidant à guider les cellules infiltrantes vers la lésion défunte. La matrice est également une sorte de casier de stockage pour les protéines matricellulaires qui sont cruciales pour le renouvellement normal de la matrice, ainsi que pour la signalisation fibrotique. Il a également été démontré que la matrice joue un rôle électromécanique dans le tissu cardiaque. La plupart des techniques d’évaluation de la fibrose ne sont pas de nature qualitative, mais fournissent plutôt des résultats quantitatifs qui sont utiles pour comparer deux groupes, mais qui ne fournissent pas d’informations relatives à la structure matricielle sous-jacente. Une technique de visualisation de l’ultrastructure de la matrice cardiaque est mise en évidence ici. La microscopie électronique à balayage du tissu cardiaque décellularisé révèle des différences frappantes dans la structure qui pourraient autrement être manquées avec les méthodes de recherche quantitative traditionnelles.

La technique mise en évidence a été appliquée aux tissus cardiaques à partir d&#39; un donneur de greffe de cœur humain utilisé (Figure 1), les tissus explantées de receveurs de greffe, des cœurs de type sauvage et souris dystrophique (Figure 3), et post-myocardique échantillons cardiaques infarctus d&#39;un porcine modèle de lésion cardiaque (Figure 2). Comme on le voit sur ​​la figure 1, la matrice cardiaque humain est...

Voici une méthode de visualisation de l’ultrastructure de la matrice extracellulaire dans les tissus cardiaques décellularisés.

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

L'objectif général de cette méthode est de visualiser la structure de la matrice cardiaque en l'absence de cellules ou d'autres matériaux non matriciels. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la fibrose, notamment comment les différences dans la composition de la matrice peuvent influencer son organisation, et comment ces modifications pourraient affecter diverses cardiomyopathies ou autres maladies fibrotiques. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit une vue qualitative de la matrice, pouvant servir à compléter des mesures quantitatives.Les Drs Galindo et Sawyer ont eu l'idée d'utiliser cette technique après avoir constaté que le traitement habituel de porcs post-infarctus entraînait des modifications de l'expression génique similaires aux changements observés dans la composition de la matrice après traitement. Les personnes novices dans cette méthode pourraient éprouver des difficultés s'ils ne possèdent pas d'expérience préalable en préparation d'échantillons pour MEB, en raison des compétences motrices fines requises. L'échantillon de tissu doit être suffisamment grand pour être facilement visible, et conservé dans une solution de glutaraldéhyde à quatre pour cent à quatre degrés Celsius.Retirez le tissu du stockage à froid et rincez-le à l'eau distillée. Ensuite, immergez le tissu dans une solution de 10 pour cent d'hydroxyde de sodium, préparée fraîchement à partir de pastilles dans l'eau. Veillez à prendre les précautions appropriées.Gardez le tissu dans la solution d'hydroxyde de sodium pendant six à dix jours à température ambiante. Poursuivez lorsque la couleur du tissu devient ivoire ou blanche. Ensuite, rincez le tissu à l'eau distillée jusqu'à ce qu'il devienne transparent.Ensuite, mettez des gants et immergez le tissu dans de l'acide tanique à un pour cent pendant quatre heures à température ambiante. Après le bain d'acide tanique, rincez le tissu dans de l'eau distillée toute la nuit. En préparation, dans une hotte sous ventilation tout en portant des gants, préparez une solution mère tamponnée de cacodylate de sodium à 0,2 molaire et une solution mère aqueuse de tétraoxyde d'osmium à deux pour cent.Utilisez une protection contre les projections, car le tétraoxyde d'osmium est un danger sérieux en cas d'inhalation. Préparez maintenant une dilution 0,1 molaire du tampon cacodylate de sodium et incubez le tissu dedans pendant cinq minutes avec une agitation douce. Renouvelez le tampon deux fois pour laver le tissu un total de trois fois avec du cacodylate de sodium.Ensuite, préparez un mélange équivalent de cacodylate de sodium stock et de tétraoxyde d'osmium stock. Incubez le tissu dans ce nouveau mélange sur un agitateur rotatif pendant une heure. Par la suite, remettez le tissu dans du cacodylate de sodium 0,1 M et incubez-le avec agitation douce pendant cinq minutes.Changer cette solution deux fois sur une période de 15 minutes. Ensuite, déshydrater le tissu à l'aide d'une série de bains d'éthanol à concentrations croissantes. Laisser le tissu tremper 15 minutes dans chaque bain avec une agitation douce.Ensuite, transférez le tissu et la solution dans une boîte de Pétri peu profonde remplie d'éthanol à 100 pour cent. Puis, tenez soigneusement deux lames de rasoir très aiguisées de manière à ce que les faces planes des côtés soient en contact l'une avec l'autre, et que les tranchants se croisent pour former deux côtés d'un triangle équilatéral au-dessus de l'échantillon. Utilisez maintenant votre main dominante pour placer la seconde lame à l'extrême gauche de l'échantillon, et effectuez une coupe vers la droite.Ainsi, faites glisser les lames l'une contre l'autre depuis des directions opposées afin d'effectuer une coupe unique et lisse avec une distorsion ou une force de déchirement minimale. L'objectif est d'exposer une surface aussi grande que possible sans endommager l'échantillon. Répétez le processus jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de sections transversales satisfaisantes soit préparé pour être examiné par MEB.À l’aide d’une spatule ou de pinces, transférer le tissu vers le porte-échantillon du SEC, tout en maintenant le tissu immergé dans de l’éthanol à 100 pour cent. Le tissu ne doit pas être exposé à l’air plus de quelques secondes. Utiliser le SEC pour remplacer l’éthanol par du dioxyde de carbone liquide, puis effectuer le cycle de séchage conformément aux indications du fabricant.Ensuite, préparez un porte-échantillon pour MEV pour chaque spécimen. Fixez une pastille adhésive en carbone sur la surface supérieure du porte-échantillon en aluminium. Sous un stéréomicroscope, fixez soigneusement le spécimen sur la pastille adhésive de manière à ce que la surface de la coupe transversale d'intérêt soit orientée vers le haut, à l'opposé de la pastille, et aussi plane que possible par rapport à la surface du porte-échantillon.Ne sondez ni ne touchez la surface d'intérêt. Pour les spécimens les plus petits et les plus délicats, cassez le bâtonnet en bois pour l'utiliser comme une spatule. Travaillez également au-dessus d'une grande feuille de papier filtre afin d'éviter de perdre un spécimen qui tomberait.Pour une meilleure adhérence, utilisez un bâtonnet applicateur cassé pour fabriquer un pinceau effilé, puis appliquez une peinture argentée ou au carbone à la base et sur les côtés de l'échantillon. Prolongez une ligne très fine de peinture jusqu'au bord de la surface d'intérêt. Cela créera un chemin de conduction entre la surface d'intérêt et la masse.Ensuite, appliquez deux ou trois petites touches de peinture conductrice autour du périmètre de la languette en carbone afin d'assurer un chemin conducteur entre la surface de la languette et le support métallique. Ceci sert de masse. Mettez l'échantillon de côté et laissez sécher la peinture conductrice pendant deux heures.Une fois séché, utiliser un pulvérisateur cathodique pour appliquer une couche relativement épaisse d'alliage or-palladium ou d'or sur l'échantillon. Une épaisseur de revêtement de 30 à 40 nanomètres est souhaitable. Réaliser la microscopie électronique à balayage à une tension d'accélération relativement faible afin de minimiser les problèmes liés à une mauvaise dissipation de la charge dans l'échantillon.Utilisez le mode de pression variable s'il est disponible. Commencez par augmenter la distance de travail afin d'obtenir une profondeur de champ suffisante pour focaliser sur les fibres selon la dimension Z. Pour ce faire, ouvrez l'onglet Navigation en haut à droite.Ensuite, accédez à l'onglet Coordonnées depuis le menu de la platine. Saisissez alors une valeur plus élevée pour la coordonnée Z, par exemple 20 millimètres. Enfin, appuyez sur l'onglet Aller à pour exécuter la modification.Ensuite, positionnez la surface d'intérêt orthogonalement par rapport au faisceau d'électrons. Cliquez et maintenez le bouton droit de la souris enfoncé, puis déplacez-la vers la gauche ou la droite pour focaliser l'échantillon près de la périphérie du plan de surface préparé d'intérêt. Notez la distance de travail mise au point.Ensuite, à l’aide du joystick de l’interface utilisateur manuelle, déplacez la vue vers le bord opposé et répétez la méthode de mise au point. Si la distance de travail a changé, inclinez l’échantillon afin d’obtenir un accord approximatif aux deux emplacements. Utilisez l’onglet Coordonnées du menu Stage et saisissez une valeur d’inclinaison dans la coordonnée T.Maintenant, faites pivoter l'échantillon de 90 degrés en saisissant cette valeur dans le champ de coordonnée R. Ensuite, répétez le processus d'inclinaison jusqu'à ce que toutes les positions soient focalisées à une distance de travail approximativement identique. La technique décrite a été appliquée à des tissus cardiaques provenant d'un donneur de cœur humain non utilisé destiné à une greffe.La matrice cardiaque humaine est un réseau complexe de protéines réticulées présentant une structure en nid d'abeille en coupe transversale. Chaque alvéole mesure environ 40 microns de large et entoure normalement un seul myocyte. Lorsqu'elles sont reliées par des disques intercalaires, plusieurs myocytes cardiaques peuvent être perçues comme une tige s'étendant longitudinalement à travers une forme en tunnel.En plus de fournir des informations structurelles, un MEB de tissus décellularisés peut permettre une évaluation qualitative significative en réponse à une lésion ou à des formes non lésionnelles de cardiomyopathie, comme des tissus cardiaques infarcis provenant d'un porc. Dans une étude distincte, l'isoforme GGF2 de la NRG-1 bêta s'est révélée être un traitement thérapeutique potentiel de l'insuffisance cardiaque. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de préparer un tissu, un tissu cardiaque, pour le microscope électronique à balayage, y compris la technique permettant d'exposer la surface d'intérêt et de monter l'échantillon.Après cette procédure, d'autres techniques telles que la spectrométrie de masse, le séquençage de l'ARN et divers autres dosages peuvent être utilisées afin de mesurer les protéines de la matrice extracellulaire et d'autres molécules responsables des phénomènes de signalisation et d'observation organisationnelle. De plus, n'oubliez pas que l'osmium tétraoxyde est un produit chimique dangereux en raison du risque de fixation par les vapeurs sur les muqueuses. Veillez toujours à travailler sous une hotte aspirante avec des gants en nitrile, en utilisant un écran pare-éclaboussures ou le panneau de la hotte.

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JoVE Journal

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Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

La matrice extracellulaire subit un remodelage important lors de la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la tumorigenèse. Nous présentons une nouvelle approche de microscopie par immunofluorescence intravitale de visualiser la dynamique des fibrillaire ainsi que maille-comme composants de la matrice avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant épifluorescence ou la microscopie à deux photons.

À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

Ce protocole décrit une procédure d’enrichissement des protéines ECM à partir de tissus ou de tumeurs et de déglycosylation et digestion des préparations enrichies en ECM en peptides afin d’analyser leur composition protéique par spectrométrie de masse.

Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse

Nous présentons un protocole pour obtenir des matrices dérivées de cellules riches en protéines de la matrice extracellulaire, en utilisant Crowders macromoléculaires (MMC). En outre, nous présentons un protocole qui incorpore MMC dans organotypique génération de co-culture de la peau 3D, ce qui réduit le temps de la culture tout en maintenant la maturité de la construction.

Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

La matrice extracellulaire joue un rôle majeur dans la définition du microenvironnement des cellules et dans la modulation du comportement et du phénotype cellulaires. Nous décrivons une méthode rapide pour l’isolement de la matrice extracellulaire dérivée de cellules, qui peut être adaptée à différentes échelles pour des études microscopiques, biochimiques, protéomiques ou fonctionnelles.

Un rapide, méthode évolutive pour l&#39;isolement, l&#39;étude fonctionnelle, et l&#39;analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

Macrophage pièges extracellulaires sont une entité nouvellement décrite. Cet article se concentre sur les méthodes de microscopie confocale et comment elles sont visualisées in vitro et in vivo des échantillons pulmonaires.

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

Le but du présent protocole est la production de fibres de matrice extracellulaire ensemble ciblé pour la réparation de la plaie qui conviennent à l’évaluation préclinique dans le cadre d’un implant d’échafaudage régénératrice. Ces fibres sont produites par la culture de fibroblastes sur membranes fibres creuses et extraite par la dissolution des membranes.

Production des fibres de la matrice extracellulaire par Culture de cellules de Membrane fibre creuse sacrificiel

Ce protocole présente une méthode pour la décellularisation et la formation suivante d'hydrogel des garnitures de graisse mammaire murine suivant l'irradiation ex vivo.

Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Nous décrivons la préparation de rubans de sections série et leur collecte sur un grand support de transfert pour une utilisation en tant qu’échantillons de tomographie en réseau, ainsi que des procédures d’imagerie automatisées dans un microscope électronique à balayage. Le protocole permet le dépistage, la récupération et l’imagerie ciblée d’événements locaux rares, ainsi que l’acquisition de grands volumes de données.

Flux de travail de tomographie en réseau pour l’acquisition ciblée d’informations de volume à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Le protocole actuel optimise les méthodes de perfusion/décellularisation in situ du foie et de microscopie à deux photons afin d’établir une plateforme fiable pour visualiser la dynamique du remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la stéatohépatite non alcoolique (NASH).

Imagerie 3D de la matrice extracellulaire hépatique dans un modèle murin de stéatohépatite non alcoolique

Nous proposons un protocole pour évaluer la régénération osseuse à différents niveaux hiérarchiques. Cette approche multimodale permet une analyse structurelle sur différentes échelles de longueur, répondant efficacement aux défis de la préparation de l’échantillon. Il offre également un flux de travail fiable pour évaluer l’efficacité des biomatériaux dans la promotion de la régénération osseuse.

Approche multimodale pour évaluer la régénération osseuse et la performance de l’échafaudage

Découvrez la microscopie électronique à balayage du tissu cardiaque macéré pour visualiser la matrice extracellulaire. Cette technique permet d'étudier l'organisation de la matrice et ses implications dans les maladies fibrotiques et cardiomyopathies.

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

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