Name: In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Apprenez à caractériser les colonies de cellules progénitrices pancréatiques isolées de souris adultes en utilisant des milieux semi-solides à base de méthylcellulose. Ces techniques permettent d'étudier l'auto-renouvellement et la différenciation cellulaire.

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Nous remercions Lucy Brown et Alexander Spalla de l&#39;analyse de cytométrie de base à City of Hope de l&#39;aide pour le tri. Ce travail est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01DK081587 et R01DK099734 à HTK et U01DK089533 à l&#39;ADR, et par la National Science Foundation subvention NSF-DMR-1206121 et en Californie Institute for Regenerative Medicine subvention RB5-07398 à DAT Supports de l&#39;Institut J. Joseph Jacobs pour le génie moléculaire pour la médecine à Caltech à DAT, et ceux de la Fondation Oxnard et la Fondation Ella Fitzgerald à HTK sont également appréciés. Financement: Ce travail est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01DK081587 et R01DK099734 à HTK et U01DK089533 à l&#39; ADR, et par la National Science Foundation subvention NSF-DMR-1206121 et en Californie Institute for Regenerative Medicine subvention RB5-07398 à DAT Prise en charge de la Joseph J. JacobsInstitut d&#39;ingénierie moléculaire pour la médecine à Caltech à DAT, et ceux de la Fondation Oxnard et Ella Fitzgerald Foundation à HTK sont également très précieuse. La recherche rapportée dans cette publication inclus les travaux effectués dans l&#39;analyse de cytométrie de base et de microscopie optique numérique Imaging Core soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous le numéro d&#39;attribution P30CA33572. Commanditaire de l&#39; étude: Le promoteur n&#39;a pas participé à la conception de l&#39; étude, la collecte, l&#39; analyse ou l&#39; interprétation des données.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les essais de colonies pancréatiques et seule colonie analyses décrites ici ont été inspirés par les hématopoïétiques essais de colonies contenant de méthylcellulose qui ont joué un rôle majeur dans le décryptage de la biologie des cellules souches hématopoïétiques dans les dernières décennies 23. Dans ces essais (Figure 5), dissociées des cellules pancréatiques sont étalées dans des milieux semi-solides avec des facteurs de croissance appropriés et des protéines d&#39;ECM qui soutiennent la ...

Le pancréas se compose de trois principales lignées cellulaires; cellules acineuses sécrètent des enzymes digestives, les conduits sécrètent mucine pour repousser les agents pathogènes et le transport des enzymes digestives dans l&#39;intestin, et les cellules endocrines sécrètent des hormones, y compris l&#39;insuline et le glucagon, qui maintiennent l&#39;homéostasie du glucose. Au cours du développement embryonnaire du pancréas, les cellules canalaires précoces sont la source des cellules progénitrices tri-puissant capable de donner naissance aux trois lignées dans le pancréas d&#39;animaux adultes 1,2. Parce que les cellules souches et progénitrices adultes, telles que les cellules souches de la moelle osseuse, sont déjà utilisés avec succès pour traiter diverses maladies 3, il y a un intérêt intense pour trouver les cellules souches et progénitrices dans le pancréas adulte. Si l&#39;isolement et la manipulation de cellules souches et progénitrices pancréatiques adultes étaient possibles, ces cellules peuvent être utilisées pour traiter des maladies telles que le diabète de type 1, dans lequel les cellules sécrétant de l&#39;insuline sont détruites par auto-immunité. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Que les cellules progénitrices tri-puissants existent encore dans les canaux pancréatiques adultes après l&#39;achèvement du développement embryonnaire est une question qui est fortement débattue dans la communauté scientifique. Dans ce débat, et en utilisant in vivo cre-lox lignage techniques de traçage, Inada et ses collègues ont montré que les cellules canalaires murins adultes marqués avec un marqueur, l&#39; anhydrase carbonique II, pourraient donner lieu à tous les trois lignées pancréatiques 4. Cependant, l&#39; utilisation d&#39; autres marqueurs, tels que canalaires HNF1B 5 et Sox9 2, on a conclu que les cellules canalaires ne sont pas la principale source des cellules bêta chez des souris adultes. Il y a plusieurs années, nous avons proposé que la cause du débat précité peut être dû à l&#39;absence, dans le domaine de 6,7, des outils d&#39; analyse appropriés qui peuvent être utilisés pour mesurer l&#39; auto-renouvellement et de multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. La technique in vivo de la lignée de traçage cre-lox dans mentionnéci-dessus peuvent fournir des preuves de la relation progéniteur-descendants au niveau de la population. Cependant, cette technique de traçage de la lignée est limitée dans son pouvoir de discerner si les cellules progénitrices simples peuvent se renouveler et de se différencier en plusieurs lignées. analyse unicellulaire est importante, car si plusieurs progéniteurs mono puissants, chacun ayant un potentiel de lignée différente, ont été analysés ensemble, ils peuvent apparaître collectivement avoir de lignées multiples capacités de différenciation. En outre, les cellules souches sont habituellement une population mineure d&#39;un organe adulte. Les activités d&#39;une population de cellules mineures pourraient être masqués par la population majeure. Par conséquent, un résultat négatif à partir d&#39;une étude de population ne signifie pas nécessairement l&#39;absence de cellules souches. Enfin, cre-lox lignée traçage ne permet pas actuellement la mesure de l&#39;auto-renouvellement. Pour commencer à répondre à l&#39;écart technique dans le domaine de la biologie du pancréas de cellules progénitrices, colonie 7-11 ou 12-15 organoide </sup&gt; essais utilisant des systèmes de culture 3D ont été conçus. Deux essais de colonies pour progéniteurs pancréatiques ont été développés dans notre laboratoire: l&#39; un contient une préparation commerciale de murins protéines de la matrice extracellulaire (ECM) (voir Méthodes et Tableau équipement), et l&#39;autre contient la laminine hydrogel, une artificielle protéine ECM définie 7-11. Les cellules progénitrices sont mélangés dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Methylcellulose est un matériau biologiquement inerte et visqueux préparé à partir de fibres de bois et a été utilisée en routine dans des essais de colonies hématopoïétiques 16. La méthylcellulose contenant un milieu semi-solide limite le mouvement de cellules souches individuelles de sorte qu&#39;elles ne peuvent pas re-agrégat. Pourtant, le milieu est suffisamment souple pour permettre une cellule progénitrice de croître et de se différencier en une colonie de cellules dans l&#39;espace 3D. Suivant la tradition des hématologues, une cellule pancréatique progénitrices qui a été capable de donner naissance à une colonie de cellules était named une unité formant colonie pancréatique (PCFU). PCFUs, lorsqu&#39;il est cultivé dans l&#39;essai de colonie contenant ECM-murin, donnent naissance à des colonies kystiques qui sont nommés colonies &quot;Ring&quot; 7. Lors de l&#39; addition d&#39;un agoniste Wnt, R-spondin1, dans la culture contenant de l&#39; ECM-murin, certaines colonies Anneau transformer en colonies &quot;denses&quot; 7. Dans cet article, ces deux types de colonies cultivées dans la culture de l&#39;ECM murin sont collectivement appelés «anneaux / denses&quot; colonies. Lorsque Ring / colonies denses sont dissociées en suspension cellulaire unique et re-plaqué dans les cultures qui contiennent laminine hydrogel, colonies &quot;Endocrine / acineuses&quot; sont formés 7. En utilisant une seule colonie analyses, il a été constaté que la majorité des colonies Ring / denses et Endocrine / acineuses, soit à partir des adultes (2-4 month-old) 7,11 ou jeune (1 week-old) 9 pancréas de souris, d&#39; exprimer tous les trois marqueurs de la lignée. Cela suggère que la plupart des PCFUs originaires sont tri-puissant. Dans l&#39;essai de colonies contenant ECM-murin, PCFUs murin adulte robuste auto-renouvellement et l&#39; expansion d&#39; environ 500.000 fois plus de 11 semaines dans la culture 7. ECM murine supporte de préférence la différenciation des cellules canalaires sur le système endocrinien et acineuses lignées, tandis qu&#39;en présence de laminine hydrogel PCFUs murins sont encouragés à se différencier préférentiellement dans les cellules endocrines et acineuses et moins à la lignée canalaire 7,9,11. Surtout, Insuline Glucagon + - Les cellules mono-hormonal sont générés dans la culture d&#39;hydrogel de la laminine et de sécréter de l&#39; insuline en réponse au glucose in vitro de stimulation de 7,9, ce qui suggère la maturité fonctionnelle. La différenciation potentielle 7,9 tri-lignée et l&#39; auto-renouvellement de 11 PCFUs individuels sont confirmés par micromanipulation une seule cellule, à savoir, la mise en culture d&#39; une cellule par puits pour la formation de colonies. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves qu&#39;il existe des auto-renouvellement, le tri-potenT, des cellules souches, comme dans le pancréas de souris post-natale qui montrent des activités dans la culture 3D. Les essais de PCFU murins décrits dans cet article sont issus d&#39;un essai de colonie avant conçu pour les cellules progénitrices différenciées à partir de cellules murines embryonnaires souches (mESCs) 17. Ce protocole est documenté en détail dans une autre publication JoVE 18. Les composants et les techniques nécessaires pour réaliser le dosage de la colonie de souris contenant ECM pour adultes PCFUs culture sont les mêmes que pour les progéniteurs MESC dérivées 17,18. Par conséquent, ces aspects de l&#39;essai ne seront pas répétées ici; place les procédures suivantes seront abordées: 1) la dissociation du pancréas adulte et de tri CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires, qui enrichissent PCFUs de souris adultes 7, 2) la manipulation de cellules isolées des cellules triées, 3) une seule colonie analyses utilisant microfluidique qRT-PCR et l&#39;ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation de colonies en suspension à cellule unique et re-placage dans ECM murin ou laminine essais hydrogel de colonies.

<table><tbody><tr><td>Protéines ECM murines (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>354230</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Laminin Hydrogel</td><td>fourni par David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td><td></td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japon)</td><td></td><td>1 500 centipoises (unité de viscosité dynamique égale à 15 g/cm/sec) (viscosité élevée)</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Conical flacon</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, États-Unis)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture en suspension de 100 mm x 20 mm</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, États-Unis)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma (St. Louis, MO, États-Unis)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco (Grand Island, NY, États-Unis)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Allemagne)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase B</td><td>Roche (CH-4070, Bâle, Suisse)</td><td>11088831001</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, États-Unis)</td><td>101310</td><td>faible endotoxine, sans azoture</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a &kappa ; Isotype Control</td><td>Biolegend (San Diego, CA, États-Unis)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>rat IgG1 &kappa ; Isotype Control</td><td>eBioscience (San Diego, CA, États-Unis)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotine</td><td>eBioscience (San Diego, CA, États-Unis)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr>Biolegend<td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>(San Diego, CA, USA)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Biolegend de streptavidine-allophycocyanine</td><td>(San Diego, CA, USA)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole</td><td>Invitrogen ( Waltham, MA,&nbsp ; USA)</td><td>3571</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Anti-mucine 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Chèvre anti-hamster arménien</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Tris Ethylènediamineacide tétraacétique</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec Reverse Transcription Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic</td><td>acid Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp ; États-Unis)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, États-Unis)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile</td><td>Gibco (Grand Island, NY, États-Unis)</td><td>15230-147</td><td>Biologie moléculaire Pipette</td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , États-Unis)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; m Filtre à mailles</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m maille filtrante</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 Well Suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (Anciennement 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Seringue</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 cc</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, États-Unis)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Échantillon de réseau dynamique & Kit de réactifs de chargement de dosage</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, États-Unis)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, États-Unis)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurate de sorbitan de polyéthylène glycol</td><td>Sigma (St. Louis, MO, États-Unis)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre</td><td>MatTek (Ashland, MA, États-Unis)</td><td>P35G-1.5-14-C Boîte de</td><td>Pétri 35 mm avec fond</td></tr> <tr><td>en verreEmbout buccal/Tube en caoutchouc</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>N0636</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>Stock maintenu à -80 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Activin B</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>659-AB</td><td>Stock maintenu à -80 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>E7144</td><td>Stock maintenu à -20 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Rspondin-1</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>3474-RS</td><td>Stock maintenu à -80 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Tube en polystyrène à fond rond</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, États-Unis)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 18 g x1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, États-Unis)</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 16 g x 1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, États-Unis)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate&nbsp ;</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, États-Unis)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 Plaque à puits noir</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, États-Unis)</td><td>3603</td><td>Fond plat et transparent avec couvercle. Microplaques en polystyrène noir traité TC</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Microscope inversé</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Allemagne)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp ;</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, États-Unis)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, États-Unis)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1 % (poids/vol) BSA 
PenStrep (49 unités/ml Pénicilline, 49 &mu ; g/ml Streptomycine)</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnase1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1 % (poids/vol) BSA 
PenStrep (49 unités/ml Pénicilline, 49 &mu ; g/ml Streptomycine) 
Dnase 1 (2 400 unités/ml par pancréas)</td></tr></tbody></table>

in vitro colony assays pour caractériser les cellules progénitrices tri-puissants isolée des adultes murins pancréas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Souches et les cellules progénitrices du pancréas adultes pourraient être une source potentielle de cellules bêta comme thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de diabète de type 1. Cependant, il est encore impossible de savoir si les cellules souches et progénitrices existent dans le pancréas adulte. Les stratégies de recherche à l&#39;aide de cre-lox lignée-tracing chez les souris adultes ont donné des résultats qui soutiennent ou réfutent l&#39;idée que les cellules bêta peuvent être générées à partir des canaux, l&#39;emplacement présumé où adultes progéniteurs pancréatiques peuvent résider. Ces méthodes de lignage-tracing in vivo cre-lox, cependant, ne peuvent pas répondre aux questions de l&#39; auto-renouvellement et multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. Pour commencer à répondre à cette lacune technique, nous avons conçu des essais de colonies en 3 dimensions pour progéniteurs pancréatiques. Peu après notre publication initiale, d&#39;autres laboratoires développés indépendamment un similaire, mais pas identique, méthode appelée le test organoide. Par rapport à l&#39;essai organoide, notre méthode emploieméthylcellulose, qui forme des solutions visqueuses qui permettent l&#39;inclusion de protéines de matrice extracellulaire à faibles concentrations. Les essais contenant méthylcellulose-permettent la détection et l&#39;analyse de cellules progénitrices au niveau d&#39;une seule cellule, qui sont critiques quand progéniteurs constituent un petit sous-population plus facile, comme cela est le cas pour de nombreuses cellules souches d&#39;organes adultes. Ensemble, les résultats de plusieurs laboratoires démontrent dans la différenciation in vitro auto-renouvellement et multi-lignée de cellules progénitrices comme pancréatiques de souris. Les protocoles actuels décrivent deux colonies des essais à base de méthylcellulose à caractériser les progéniteurs pancréatiques de souris; une contient une préparation commerciale de protéines de la matrice extracellulaire de souris et l&#39;autre une protéine de matrice extracellulaire artificielle connue sous le nom d&#39;un hydrogel de la laminine. Les techniques présentées ici sont 1) la dissociation du pancréas et le tri des CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires de souris adultes, 2) la manipulation de la cellule unique des scellules SOUTENUS, 3) analyse seule colonie en utilisant microfluidique qRT-PCR et l&#39;ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation des colonies primaires dans une seule cellule suspensions et re-placage dans des essais de colonies secondaires pour évaluer l&#39;auto-renouvellement ou de la différenciation.

Cellules progénitrices pancréatiques adultes peuvent être enrichis par fluorescence activée par tri cellulaire (Figure 1). La lignée de souris transgéniques Sox9 / EGFP utilisé ici d&#39; abord été généré à la suite du projet GENSAT Brain Atlas 19, et le rapporteur de l&#39; EGFP est sous le contrôle d&#39;un chromosome bactérien artificiel contenant ~ 75 kb en amont et ~ 150 kb des séquences en aval de Sox9 20 . Chez ces souris, EGFP étiquettes can...

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l&#39; auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

L'objectif général de ces protocoles est de caractériser les colonies cellulaires issues de cellules progénitrices pancréatiques isolées de souris adultes, en utilisant des tests de culture qui emploient un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Nos méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules progénitrices pancréatiques, telles que : quelles sont les capacités d'auto-renouvellement et de différenciation des cellules progénitrices dans le pancréas adulte ? Le principal avantage de ces techniques réside dans leur capacité à permettre l'étude de cellules progénitrices individuelles, ce qui est essentiel pour déterminer leurs véritables potentiels biologiques.Nous avons eu pour la première fois l'idée de ces méthodes lorsque nous avons réalisé que les tests de colonies destinés à l'étude des cellules souches hématopoïétiques pouvaient également être appliqués à des populations cellulaires pancréatiques. Les procédures seront démontrées par Jacob Tremblay, étudiant diplômé, le Dr Janine Quijano, postdoctorante, et Mlle Angela Luo, technicienne, tous membres de mon laboratoire. Dès que possible après l'euthanasie, utilisez des ciseaux pour pratiquer une incision verticale sur la ligne médiane de la paroi abdominale, puis ouvrez la cavité abdominale.À l’aide de pinces, soulevez délicatement la rate et coupez le tissu conjonctif entre la rate et le lobe splénique du pancréas avec des ciseaux. Sectionnez de la même manière les tissus conjonctifs des lobes duodénal et gastrique, puis placez les tissus pancréatiques dans une boîte de Pétri contenant du DPBS supplémenté avec 0,1 % de BSA et des antibiotiques, placée sur de la glace. Ensuite, sous un microscope stéréoscopique, utilisez des pinces à pointe fine pour retirer le tissu adipeux.Transférez maintenant les pancréas dans une hotte de culture tissulaire et rincez le tissu dans trois boîtes de Pétri de 100 millimètres contenant chacune 10 millilitres de PBS froid plus BSA. Après le dernier lavage, placez les pancréas dans une boîte de Pétri stérile sèche afin d'éliminer autant que possible le PBS plus BSA, puis transférez les tissus dans une autre boîte de Pétri sèche placée sur de la glace. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort pour hacher les pancréas pendant deux à trois minutes jusqu'à l'obtention de fragments tissulaires fins, et suspendez les fragments de tissu dans deux à trois millilitres de solution fraîchement préparée de PBS BSA DNase I froide.À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, transférez les morceaux dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez suffisamment de PBS BSA DNase I pour amener le volume total à 10 millilitres. Ajoutez ensuite 350 à 450 microlitres de collagénase B aux tissus. Placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant huit minutes, en agitant doucement toutes les trois à quatre minutes.À la fin de l'incubation, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille de calibre 16 et demi pour prélever puis pulvériser la solution tissulaire le long de la paroi du tube de 50 millilitres à température ambiante, sept fois. Replacez ensuite les tissus dans le bain-marie pendant huit minutes supplémentaires, en les agitant occasionnellement, suivis de sept passages à travers la seringue comme vient de l'être démontré. Après la dernière disruption mécanique, transférez un aliquot de 10 microlitres de la suspension cellulaire sur une boîte de Pétri sèche et vérifiez la présence de cellules isolées et d'agrégats cellulaires de petite taille au microscope inversé à contraste de phase équipé d'un objectif 10x.Ensuite, placez le tube sur de la glace et complétez le volume total à 50 millilitres avec du PBS BSA DNase I. Centrifugez les cellules et utilisez une pipette P1000 pour re-suspendre le culot dans cinq millilitres de PBS BSA DNase I froid. Filtrez ensuite les cellules à travers un filtre en nylon de 70 microns, suivi d'un filtre en nylon de 40 microns, dans un nouveau tube conique polypropylène de 50 millilitres. Ajustez le volume à 5 millilitres de PBS BSA DNase I et comptez les cellules. Diluez alors la suspension monocellulaire à une concentration finale de deux fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre dans du PBS BSA DNase I froid, en gardant le tout sur de la glace.Pour réaliser une immunomarquage sur des colonies pancréatiques cultivées dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose, préparez d'abord une pipette en verre de type Pasteur avec une ouverture fine à l'aide d'un bec Bunsen. Ensuite, fixez l'extrémité étroite d'une pipette d'un millilitre à l'une des extrémités d'un tube en caoutchouc à paroi mince et un embout buccal à l'autre extrémité. Fixez la pipette en verre de type Pasteur à l'extrémité large de la pipette.Ensuite, aspirez 10 à 50 microlitres de milieu DMEM/F12 contenant 1 % de méthylcellulose dans la pipette buccale. Placez ensuite la boîte contenant les colonies sur la platine d'un microscope inversé à contraste de phase et utilisez l'objectif 10x pour repérer les colonies appropriées à sélectionner. Puis, placez l'extrémité de la pipette à côté de la colonie d'intérêt et appliquez lentement une aspiration par la bouche afin de prélever une colonie unique.Pour une collecte efficace, il est important de s'assurer que la colonie d'intérêt est bien au foyer avant de placer l'ouverture de la pipette en verre à côté de l'agrégat cellulaire. Une fois la colonie récoltée, placer la pointe de la pipette dans une cavité d'une plaque 96 puits contenant du paraformaldéhyde à 4 % et déposer la colonie dans la cavité. Après avoir collecté toutes les colonies, fixer les colonies toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation douce.Le lendemain matin, laver les colonies deux fois dans du PBS pendant 10 à 30 minutes à température ambiante. À partir de ce moment, prélever les colonies à l’aide d’une pipette plastique P10 à embout courbé. Après le deuxième lavage, conserver les colonies fixées toute la nuit dans des tubes de 1,5 millilitre remplis de paraffine à quatre degrés Celsius.Transférez ensuite les colonies dans des puits individuels d'une plaque noire de 96 puits à fond transparent contenant 200 microlitres de tampon de blocage par puit. Incubez la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation douce. Le lendemain matin, transférez les colonies dans de nouveaux puits contenant 200 microlitres de l'anticorps primaire d'intérêt pour une autre culture nocturne à quatre degrés Celsius avec agitation douce.Le lendemain matin, transférez les colonies dans trois puits consécutifs contenant 200 microlitres de PBS additionné de 0,1 % de Tween 20, pour des lavages de 10 minutes à température ambiante. Après le troisième lavage, transférez les colonies dans des puits propres contenant 200 microlitres d'anticorps secondaire approprié, puis incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, lavez les colonies trois fois dans du PBS Tween comme indiqué précédemment, puis transférez-les dans de nouveaux puits contenant du DAPI pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, regrouper les colonies immunomarquées dans une boîte de Pétri de 35 millimètres à fond en verre et les recouvrir d'une lame couvre-objet. Enfin, observer les colonies au microscope confocal. Les cellules progénitrices pancréatiques adultes peuvent être enrichies par tri cellulaire activé par fluorescence en utilisant des paramètres de sélection appropriés, car la capacité de formation de colonies se trouve uniquement au sein des cellules ductales CD133 Sox9/EGFP positives.Les colonies pancréatiques peuvent ensuite être classées selon leur morphologie par microscopie optique en contraste de phase inversée. Après sélection manuelle, les colonies peuvent également être analysées par qRT-PCR microfluidique pour l'expression génique, ou par immunomarquage sur coupe entière pour l'expression protéique. En effet, de nombreuses colonies individuelles expriment des marqueurs de lignage pour les cellules ductales, endocrines et acinaires, par exemple, ce qui indique que la majorité des progéniteurs pancréatiques initiateurs formant ces colonies sont tri-potents.Une fois maîtrisées, les étapes de dissection, de dissociation, de marquage et de tri cellulaire, ainsi que la mise en culture cellulaire dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose, peuvent être réalisées en six à sept heures si elles sont effectuées correctement. Après la formation des colonies, d'autres méthodes telles que la RT-PCR quantitative, le western blot ou des tests de sécrétion d'insuline peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant l'expression génique ou les fonctions des colonies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la dissociation d'un pancréas de souris adulte et de la caractérisation des colonies de cellules progénitrices pancréatiques obtenues en cultures semi-solides contenant de la méthylcellulose.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Un test en trois dimensions qui permet clonogénique pancréatique comme géniteurs à se différencier en insuline exprimer colonies est décrite. Cette méthode tire parti des milieux semi-solides contenant des facteurs de la méthylcellulose, Matrigel et la croissance, dans lequel seule progéniteurs prolifèrent et se...

Un dosage quantitatif de l&#39;insuline exprimer formant colonie Progéniteurs

La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l'induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D'une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.

Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l&#39;homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d&#39;insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée

Un protocole d'isoler, les grappes de la culture, et de l'image cellules des îlots (CCI) dérivées de cellules pancréatiques fœtales humaines est décrite. La méthode décrit les étapes nécessaires pour générer CCI du tissu, de la culture en monocouche ou en suspension sous forme d'agrégats, et l'image des marqueurs de prolifération et les décisions du destin cellulaire du pancréas.

L&#39;isolement, la culture, et de l&#39;imagerie de l&#39;homme causés par des amas de cellules pancréatiques

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Ce protocole présente une comparaison entre deux protocoles d’induction différents pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) vers des lignées pancréatiques in vitro: le protocole intégratif et le protocole non intégratif. Le protocole intégratif génère plus de cellules productrices d’insuline (PI).

In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

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Apprenez à caractériser les colonies de cellules progénitrices pancréatiques isolées de souris adultes en utilisant des milieux semi-solides à base de méthylcellulose. Ces techniques permettent d'étudier l'auto-renouvellement et la différenciation cellulaire.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

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