Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

L’objectif général de cette procédure est de décrire comment effectuer des enregistrements patch-clamp de cellules entières dans des tranches de cerveau fraîchement disséquées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme la façon dont les manipulations de contrôle expérimentales modifient l’activité de neurones spécifiques dans des régions cérébrales spécifiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit le moyen d’identifier une préparation X vivo des changements durables dans les fonctions neuronales qui se sont développées chez des animaux intacts et éveillés.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des fonctions neuronales dans les tranches de cerveau, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les cellules en culture et les neurones in vivo. La démonstration de la procédure sera faite par Francisco Garcia-Oscos, un étudiant de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, prélevez doucement une tranche de cerveau de la chambre de récupération.

Placez la pipette de transfert dans la chambre d’enregistrement et pressez doucement la tranche de la pipette sur la doublure de la housse au fond de la chambre. Ensuite, à l’aide de l’objectif du microscope 4x, positionnez la tranche de manière à ce que la zone souhaitée soit placée exactement au centre de la chambre d’enregistrement. Une fois la position souhaitée atteinte, sécurisez la position de la tranche de cerveau avec la mainte de tranche vers le bas, également connue sous le nom de harpe.

Après cela, passez à l’objectif 40x et abaissez doucement l’objectif jusqu’à ce qu’il entre en contact avec l’ACSF dans la chambre. Ensuite, utilisez la molette de réglage fin pour faire la mise au point sur le tissu. Lorsque l’accent est mis sur le tissu, observez les cellules de la région ciblée.

Maintenant, recherchez une cellule cible. Marquez-le sur l’écran de l’ordinateur afin d’aider à guider la micropipette d’enregistrement. Soulevez la lentille de l’objectif pour laisser suffisamment d’espace pour le placement de la micropipette enregistreuse.

Dans cette étape, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, d’une aiguille de microseringue non métallique et d’un filtre dédié, remplissez une micropipette avec la solution interne préparée à l’avance. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la micropipette. Placez ensuite la micropipette dans un porte-électrode, de sorte que la solution entre en contact avec le fil-électrode enrobé de chlorure d’argent.

Serrez le capuchon de la pipette, de sorte que la rondelle du cône forme un joint autour de la micropipette. Ensuite, appliquez une pression positive avec la seringue remplie d’air connectée au porte-pipette avant d’immerger la micropipette dans l’ACSF pour éviter que des débris n’y pénètrent. À l’aide du micro-manipulateur, guidez la pipette vers le bas jusqu’à la chambre de manière à ce qu’elle se trouve à peu près sous le centre de l’objectif immergé.

Tout en déplaçant la micropipette avec le micromanipulateur à vitesse moyenne à élevée, localisez la micropipette sur l’écran de l’ordinateur et guidez-la vers l’emplacement de la cellule sur l’axe XY. Pendant ce temps, mesurez la résistance de la micropipette en appliquant un pas de tension. Appliquez une pression positive afin d’éliminer les bulles d’air ou autres objets étrangers qui bloquent la micropipette.

Après avoir nettoyé la micropipette, effectuez un décalage de tension pour réduire le courant de la pipette à zéro. À l’aide de la molette de mise au point fine du microscope, commencez à faire la mise au point tout en abaissant progressivement la micropipette. Faites toujours la mise au point en premier, puis abaissez la micropipette dans le plan de mise au point pour vous assurer que la pointe de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche.

Lorsque la micropipette entre en contact avec la surface de la tranche, ralentissez la vitesse du micromanipulateur jusqu’au mode moyennement bas. Appliquez doucement une légère pression positive pour éliminer tous les débris sur le chemin. Ensuite, approchez-vous de la cellule, soit en alternant avec les boutons de commande XYZ, soit en vous approchant en diagonale où les deux axes XZ sont modifiés avec la rotation du bouton de l’axe Z.

Lorsque la micropipette est suffisamment proche de la cellule, une fossette apparaît à la surface de la cellule. Appliquez maintenant une aspiration faible et brève à travers le tube relié au tube d’aspiration du porte-pipette afin de créer une étanchéité. Pendant qu’un giga-seal se forme, utilisez le contrôleur d’amplification contrôlé par ordinateur pour amener les cellules détenant le potentiel au potentiel de repos physiologique afin d’éviter les changements soudains, une fois la membrane rompue.

Une fois que le giga-seal s’est formé, compensez les capasitons rapides ou lents. Ici, il est très important que l’aspiration appliquée ne soit pas trop forte. Sinon, la membrane peut se rompre avant d’établir l’étanchéité.

Si le joint reste stable et supérieur à un gigaom, appliquez une aspiration brève et forte pour rompre la membrane plasmique. L’aspiration doit être brève et plus forte que la pression appliquée lors de l’établissement d’un joint. Afin de rompre correctement la membrane et d’obtenir une configuration stable de cellules entières.

En passant en mode cellule dans le test de membrane, affichez différents paramètres de la cellule, tels que la résistance d’entrée, la résistance série et les capacités de membrane. Une fois la configuration de la cellule entière, continuez à surveiller ces paramètres pendant l’enregistrement. Voici un exemple de la pente évoquée de l’EPSC à partir d’une seule coquille de noyau accumbens, MSN.

L’augmentation de la température de 24 à 28 et à 32 degrés Celsius augmente la pente des EPSC évoqués. Ici, l’amplitude de l’EPSC évoquée est évaluée en mode pince de tension à moins 80 millivolts. Lorsque la résistance en série augmente, l’amplitude de l’EPSCS évoqué diminue.

Et voici, un exemple des traces de deux neurones montrant l’effet de la résistance d’entrée sur la capacité du neurone à générer des pointes. Les neurones sont limités et maintenus à moins 80 millivolts. Lorsque la résistance d’entrée augmente, le nombre de potentiels d’action augmente également.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il est essentiel de générer des tranches de cerveau saines. Il est également important de surveiller les paramètres qui peuvent influencer la forme d’onde du signal électrique, tels que la résistance en série, la résistance d’entrée et la température. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’aspect de base de la technique d’enregistrement de cellules entières dans des tranches de cerveau.