Name: Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Apprenez la technique de patch-clamp en cellules entières sur tranches cérébrales fraîches pour étudier l'activité électrique des neurones. Cette méthode permet d'explorer les fonctions neuronales dans des circuits cérébraux intacts.

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Cette recherche a été soutenue par des fonds de démarrage UT Southwestern (SK).

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Aucun des auteurs ont des intérêts concurrents ou des intérêts contradictoires.

Ce protocole décrit la procédure de base pour effectuer des cellules entières expériences de patch-clamp sur les neurones dans des tranches de cerveau. Cependant, la complexité, le potentiel et la sensibilité de cette technique ne peuvent pas être décrits en détail dans cet article. Ici, nous avons essayé de définir les étapes les plus élémentaires et de souligner les paramètres importants qui doivent être contrôlés pour réaliser des enregistrements de cellules entières avec succès et rigoureux. Pour plus d&#39; apprent...

La technique de patch-clamp, une technique électrophysiologique qui a été développé à la fin des années 1970 1,2, est un outil essentiel pour l&#39; étude des fonctions simples ou multiples canaux ioniques dans les tissus vivants. Parmi les différentes configurations de raccordement qui peuvent être atteints, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp permettent l&#39;étude du comportement électrique d&#39;une partie substantielle du neurone. Classiquement, cette technique est réalisée in vitro , soit sur ​​des coupes de cerveau, les neurones fraîchement dissociées, ou sur des modèles de culture cellulaire 3. Quand elle est réalisée sur des neurones dans des tranches de cerveau, cette technique présente plusieurs avantages. En particulier: (i) neurones sont enregistrés dans les circuits du cerveau relativement conservées que dans une certaine mesure, et comparées à des préparations de culture cellulaire, fournissent un environnement qui est physiologiquement pertinente 3. Ceci permet la capture précoce, ou même le suivi en temps réel, les événements cellulaires et moléculaires qui sont déclenchées par tout type de pharmacolog aiguëmanipulations iques - une résolution temporelle qui ne peut être réalisé en utilisant classique dans des conditions in vivo; (ii) la capacité d&#39;identifier visuellement les régions du cerveau dans des tranches de cerveau permet une haute spécificité régionale 3 fois pour la région du cerveau étudié et pour les neurones spécifiques quand ils expriment des marqueurs fluorescents; (iii) l&#39; accès à l&#39;espace intracellulaire de la cellule par l&#39; ouverture d&#39; une partie importante de la membrane du plasma (contrairement à la perforation de la membrane avec une micropipette forte pour les enregistrements intracellulaires) 4. À son tour, cela permet à la teneur ou la concentration en ions spécifiques qui composent la solution interne à modifier les cibles moléculaires ou si les mécanismes cellulaires peuvent être étudiés dans des conditions différentes. Par exemple, lors de l&#39; établissement configuration cellule entière, tout agent pharmacologique spécifique (par exemple, des antagonistes) que l&#39; on peut ajouter à la micropipette d&#39;enregistrement (patch pipette) solution directement diffuse dans le cytoplasme et agir en son putative cibles intracellulaires, sans altérer la fonction cible dans les cellules voisines. En outre, par rapport à l&#39; enregistrement de micropipette forte, la grande ouverture à la pointe de l&#39;électrode de patch-clamp offre une résistance plus faible, moins de bruit en concurrence, et donc un meilleur accès électrique à l&#39;intérieur de la cellule 4. Toutefois, notez que la grande ouverture à la pointe de la pipette peut conduire à une dialyse cellulaire, et donc la perte de machinerie moléculaire intracellulaire qui peut être critique pour l&#39;expression des phénomènes biologiques qui sont à l&#39;étude 5,6. Dans ce cas, les enregistrements d&#39;électrodes pointus peuvent être plus appropriés. Ce type d&#39;enregistrement nécessite des micropipettes avec des pores qui est beaucoup plus petite que celles utilisées pour l&#39;enregistrement de cellules entières, empêchant ainsi la majeure partie de l&#39;échange d&#39;ions entre l&#39;espace intracellulaire et la solution de pipette interne. Toute forme d&#39;expérience (aiguë ou chronique), y compris l&#39; apprentissage 7-10, l&#39; exposition aux drogues 11,12, le stress 13,14, etc., peuvent modifier divers aspects de la fonction neuronale dans des régions spécifiques du cerveau. Parce que ces modifications nécessitent souvent le temps de développer (heures à quelques jours), des enregistrements de cellules entières dans des tranches de cerveau provenant d&#39;animaux qui ont subi une expérience spécifique permettent aux chercheurs d&#39;identifier ces changements. Fondamentalement, beaucoup (sinon la totalité) des composants qui participent à des fonctions neuronales (par exemple, les canaux ioniques activés par des ligands, des canaux ioniques voltage-dépendants, les transporteurs de neurotransmetteurs), et ainsi l&#39; activité des circuits cérébraux et de comportement, peuvent être modifiés par l&#39; expérience (dépendant de l&#39; expérience plasticité) 10,15-17. Au niveau neuronal, l&#39; activité des circuits cérébraux émerge des interactions constantes entre synaptique (par exemple, la transmission du glutamate) et les facteurs intrinsèques de l&#39; excitabilité cellulaire (par exemple, les canaux ioniques axosomato-dendritique: sodium, Na +, potassium, K +, et de calcium, Ca 2+ ). Dans des conditions spécifiques en utilisant whole-cell patch-clamp techniques électrophysiologiques, des altérations de signaux provenant spécifiquement des changements de rapport synaptique excitabilité intrinsèque peut être isolé. Dans la plupart des cas, l&#39; excitabilité synaptique est évaluée en utilisant la technique de voltage-clamp à cellules entières. Ce mode d&#39;enregistrement permet la mesure des courants ioniques [par exemple, médiée par des récepteurs d&#39;acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique ( récepteurs AMPA) et des récepteurs N-méthyl-D-aspartique (récepteurs NMDA)] à travers la membrane plasmique des neurones tout en maintenant le potentiel de membrane à une tension de consigne. Ici, les expérimentateurs utilisent les solutions internes de micropipette qui contiennent du césium (Cs +), un large bloqueur des canaux K + (facteurs clés de l&#39; excitabilité intrinsèques). Lors de l&#39; établissement de la configuration de cellule entière, la diffusion de Cs + dans l&#39; espace intracellulaire , bloque les canaux K +, et ainsi permettra à la fois un espace de serrage et de pré relativement efficacevent influence des facteurs d&#39;excitabilité intrinsèques sur d&#39;autres mesures. Questions Espace-clamp, à savoir la difficulté de voltage-clamp toute la cellule, se posent lors de l&#39; enregistrement des cellules de forme irrégulière (par exemple, les neurones), et en particulier les neurones avec un dendritique vaste et complexe tonnelle 18,19. Parce que somatique de verrouillage de tension de contrôle mal la tension dans l&#39;arbre dendritique des neurones, les divers aspects de signaux électriques dendritiques à l&#39;étude sont déformées d&#39;une manière dépendant de la distance dendritique. Combinés avec des outils pharmacologiques telles que la picrotoxine (acide gamma-aminobutyrique, le GABA Un antagoniste des récepteurs) ou de l&#39; acide kynurénique (large bloqueur des récepteurs du glutamate) dissous dans la solution extracellulaire (liquide céphalo-rachidien artificiel, ACSF), cette technique permet la mesure du glutamate et un récepteur - GABA R-médiée courants , respectivement. En revanche, l&#39;excitabilité intrinsèque est généralement évaluée en mode d&#39;enregistrement en cours-clamp.Par opposition à l&#39;enregistrement voltage-clamp, ce mode d&#39;enregistrement permet de mesurer les variations de potentiel de membrane induite par des courants d&#39;ions circulant à travers la membrane plasmique des neurones. En règle générale, la modification de l&#39;excitabilité intrinsèque est évaluée par des changements dans la capacité des neurones à générer des potentiels d&#39;action, ce qui nécessite à la fois Na + et K canaux +. Par conséquent, lors de l&#39; exécution des enregistrements de courant de serrage, les micropipettes sont remplies avec une solution interne qui contient K + au lieu de Cs +. Combinés avec des agents pharmacologiques qui bloquent le glutamate et le GABA A courants médiés par les récepteurs dissous dans le ACSF, ce modèle expérimental permet la mesure de la contribution des facteurs intrinsèques (par exemple, des canaux K +) à la décharge neuronale sans être contaminé par des changements potentiels de l&#39; excitabilité synaptique facteurs. Cet article décrit les étapes de la procédure de base nécessaires to (i) préparer des tranches de cerveau en bonne santé; (Ii) réaliser la configuration de cellule entière, et (iii) de surveiller les paramètres de base pour évaluer synaptique et excitabilité intrinsèque.

<table><tbody><tr><td>Générateur de stimulus d’impulsions isolé</td> Unité d’isolation <td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>(ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur contrôlé par ordinateur&nbsp ;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition numérique</td><td>Molecular Devices</td><td>Microscope Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Micromanipulateur Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage à chambre et en ligne</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Q Imaging</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipettes Narishige PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down (harpe)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Slice Chambre</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de seringue non métallique</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtres de seringue</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet à colle</td><td>Home Depot</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dispersion de gaz</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de décapitation</td> Home <td>Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Petits ciseaux à pointes droites et pointues</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Pince à canulation de récipient&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>Pince hémostatique incurvée</td><td>World Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler économique #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>Spatule à godets</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td>Boîte de</tr><tr><td>Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-Gluconate solution interne (pH 7,2&ndash ; 7,3, 280 et 280 ; 290 mOsm)</fort></td></tr><tr><td>Acide D-gluconique 50 %&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Césium-OH (CsOH) 50 %&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2,8 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,4 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>tétraéthylammonium-Cl, 5 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">K-Gluconate solution interne (pH 7,2&ndash ; 7,3, 280 et 280 ; 290 mOsm)</td></tr>K <tr><td>D-gluconate, 120 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Liquide céphalo-rachidien artificiel standard (ACSF, osmolarité et asymp ; 300-310 mOsm)</td></tr><tr><td>KCl, 2,5 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/ divers</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226 ; H2O, 1 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 26,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O, 1,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2- 2H2O, 2,5 mM</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Composés supplémentaires utilisés pour la préparation des solutions</td></tr><tr><td>KOH</td><td>divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide kynurénique</td><td>Sigma Aldrich/divers</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

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Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell enregistrement patch-clamp est une technique électrophysiologique qui permet l&#39;étude des propriétés électriques d&#39;une partie substantielle du neurone. Dans cette configuration, la micropipette est en contact étroit avec la membrane cellulaire, ce qui empêche les fuites de courant et fournit ainsi des mesures de courant ionique plus précis que la méthode d&#39;enregistrement de l&#39;électrode utilisée précédemment intracellulaire forte. Classiquement, l&#39;enregistrement de cellules entières peut être effectuée sur des neurones dans divers types de préparations, y compris les modèles de culture cellulaire, les neurones, les neurones dissociés dans des tranches de cerveau, et chez des animaux anesthésiés éveillés ou intacts. En résumé, cette technique a grandement contribué à la compréhension des propriétés biophysiques passives et actives de cellules excitables. Un avantage majeur de cette technique est qu&#39;elle fournit des informations sur la façon spécifique manipulations (par exemple, pharmacologique, expérimentateur induite par la plasticité) peuvent altérer les fonctions ou c neuronales spécifiqueshannels en temps réel. En outre, l&#39; ouverture importante de la membrane plasmique permet à la solution de pipette interne de se diffuser librement dans le cytoplasme, en fournissant des moyens pour médicaments en introduisant, par exemple, des agonistes ou des antagonistes des protéines intracellulaires spécifiques, et la manipulation de ces cibles , sans altérer leurs fonctions dans les cellules voisines. Cet article se concentrera sur l&#39; enregistrement de cellules entières effectuées sur les neurones dans des tranches de cerveau, une préparation qui présente l&#39;avantage d&#39;enregistrer les neurones dans les circuits du cerveau relativement bien conservés, à savoir, dans un contexte physiologique pertinent. En particulier, lorsqu&#39;il est combiné avec la pharmacologie appropriée, cette technique est un outil puissant permettant d&#39;identifier neuroadaptations spécifiques qui se sont produits après tout type d&#39;expériences, telles que l&#39;apprentissage, l&#39;exposition aux drogues d&#39;abus, et le stress. En résumé, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp en tranches de cerveau fournissent des moyens pour mesurer des changements durables ex vivo préparationdans les fonctions neuronales qui ont développé chez les animaux éveillés intacts.

La température, un facteur qui est facilement contrôlée par l&#39;expérimentateur, influe sur les propriétés biophysiques des canaux ioniques et des récepteurs, et ainsi la forme d&#39; onde des courants postsynaptiques (PSC) (RPEC et CISP) et la capacité des neurones à susciter des pics. Figure 3 et la figure 4 montrent l&#39;effet de la température sur la décharge neuronale et la pente de EPSCs évoqués (les eEPSCs) , respectivement. Le motif de tir <st...

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l&#39;étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu&#39;elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d&#39;évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

L'objectif général de cette procédure est de décrire comment effectuer des enregistrements en configuration whole-cell par la technique du patch-clamp sur des tranches cérébrales fraîchement disséquées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la manière dont des manipulations de contrôle expérimental modifient l'activité de neurones spécifiques dans des régions cérébrales précises. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre la possibilité d'identifier, dans une préparation ex vivo, des modifications durables des fonctions neuronales qui se sont développées chez des animaux intacts et éveillés.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les fonctions neuronales dans des tranches de cerveau, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cellules en culture et les neurones in vivo. La procédure sera démontrée par Francisco Garcia-Oscos, un étudiant de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, à l'aide d'une pipette de transfert en plastique à embout effilé, aspirez délicatement une tranche de cerveau à partir de la chambre de récupération.Placez la pipette de tra

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Cette vidéo illustre la technique de patch clamp de cellules entières dans une tranche de cerveau de souris. Cette technique établit une connexion stable entre la micropipette et la membrane neuronale, qui est ensuite perturbée pour établir une configuration de cellule entière afin d'étudier la santé et les réponses physiologiques du neurone.

Établissement d’une configuration de cellule entière grâce à la méthode du patch clamp

Cette vidéo montre une technique d’enregistrement par patch-clamp à partir de la surface de la membrane dendritique. Cela permet d’examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux ioniques voltage-dépendants sous-jacents dans les neurones dopaminergiques.

Enregistrements patch-clamp de la dendrite d’un neurone dopaminergique dans une tranche de cerveau

Cette vidéo montre le positionnement d’une pipette à pointe fine près de tranches de cerveau, formant un sceau avec une cellule neuronale. L’aspiration brise la membrane cellulaire, créant ainsi une pince patch pour cellules entières qui permet des mesures de courant pour les expériences d’électrophysiologie.

Etablissement d’une configuration de tension de cellule entière pour les enregistrements électrophysiologiques dans des tranches de cerveau

Cette vidéo montre la procédure d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques dans les neurones de la substance gélatinosa (SG) de coupes de moelle épinière, en utilisant des techniques de patch-clamp de cellules entières pour analyser les modèles de décharge des neurones. Cette méthode permet d’étudier les réponses neuronales aux stimuli dans les neurones SG de la moelle épinière.

Enregistrement par patch clamp de cellules entières dans un neurone de la substance gélatinosa d’une coupe de moelle épinière

Cette vidéo montre la procédure de cartographie des connexions synaptiques en sécurisant une tranche de cerveau, en positionnant des pipettes pour obtenir des configurations de cellules entières et en stimulant les neurones présynaptiques pour enregistrer les réponses postsynaptiques, élucidant ainsi la connectivité neuronale.

Enregistrement par patch clamp apparié des connexions neuronales dans des coupes cérébrales aiguës

Les enregistrements patch-clamp et le remplissage simultané de neurones couplés synaptiquement dans des tranches cérébrales aiguës permettent une analyse corrélée de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles. L’objectif de ce protocole est de décrire les étapes techniques essentielles de l’enregistrement électrophysiologique des microcircuits neuronaux et de leur analyse morphologique ultérieure.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Ce protocole illustre l’implémentation d’un optimisé N-méthyl-D-glucamine (NMDG) méthode de recouvrement protecteur de préparation de tranches de cerveau. Une formulation unique de médias est utilisée pour obtenir fiable des tranches de cerveau sain provenant d’animaux de tout âge et pour diverses applications expérimentales.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

Les enregistrements de patch-clamp subcellulaires offrent la possibilité d’étudier les propriétés fonctionnelles des dendrites. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles en raison de leur petit diamètre. Le protocole décrit ici vise à faciliter la collecte d’enregistrements stables et fiables à partir des dendrites des neurones dopaminergiques en tranches in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

La technique du patch clamp tranche est une méthode efficace pour analyser les changements induits par l’apprentissage dans les propriétés intrinsèques et la plasticité des synapses excitatrices ou inhibitrices.

Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

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Apprenez la technique de patch-clamp en cellules entières sur tranches cérébrales fraîches pour étudier l'activité électrique des neurones. Cette méthode permet d'explorer les fonctions neuronales dans des circuits cérébraux intacts.

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