Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

L’objectif général de ce protocole est de démontrer les modifications apportées au protocole CLARITY original, qui donnent des résultats plus cohérents et plus rentables. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences, telles que la morphologie 3D et la connectivité dans le système nerveux central. Le principal avantage de cette technique est qu’elle améliore la cohérence de la clairance optique et de la microscopie dans le système nerveux central de la souris.

De manière rentable et reproductible. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme la construction de la chambre d’imagerie est compliquée et ne se voit pas facilement à la description écrite.

Obtenez du tissu cérébral et de la moelle épinière fixé au paraformaldéhyde à partir de souris exprimant des protéines fluorescentes. Émissez le cerveau en le plaçant dans une matrice de cerveau de souris en plastique et en coupant le long de la ligne médiane avec une lame matricielle. Ajoutez chaque hémisphère et chaque moelle épinière pour séparer les tubes de centrifugeuse de 50 millilitres.

Chacun contenant 40 millilitres de solution d’hydrogel. Couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium pour protéger les fluorophores. Et incubez les tubes contenant des échantillons et de l’hydrogel à quatre degrés Celsius en secouant doucement pendant sept jours.

Après la période d’incubation, jetez 25 millilitres d’hydrogel hors de l’échantillon et environ 25 millilitres d’hydrogel dans le tube de centrifugation. Ensuite, désoxygénez l’échantillon en retirant le bouchon, en plaçant le tube de centrifugation dans un bocal à dessiccateur et en connectant le bocal à un vide. Appliquez l’aspirateur pendant au moins 10 minutes.

Secouez doucement pour déloger les bulles d’oxygène émises. Après 10 minutes, remplacez le vide dans le bocal du dessiccateur par de l’azote gazeux à 100 % pendant deux à trois minutes. Une fois que la pression s’équilibre et que le haut du bocal de dessiccateur peut être ouvert, bouchez rapidement le tube pour éviter la réintroduction d’oxygène.

Ensuite, polymérisez l’hydrogel en plaçant le tube avec l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois heures jusqu’à ce que la polymérisation soit terminée. Après trois heures, l’hydrogel polymérisé prendra une consistance semblable à celle d’un gel. À l’aide d’une spatule, retirez l’échantillon polymérisé du tube à centrifuger, puis coupez l’excès d’hydrogel de l’échantillon.

Enfin, retirez l’hydrogel restant en plaçant l’échantillon sur une lingette non pelucheuse, puis en frottant et en roulant doucement le tissu dessus, ne laissant qu’une fine couche d’hydrogel polymérisé sur l’échantillon. Pour commencer le processus d’élimination des lipides, transférez l’échantillon polymérisé dans un tube à centrifuger propre de 50 millilitres avec 45 millilitres de tampon de clarification, et incubez à 45 degrés Celsius en secouant doucement pendant sept jours. Changez le tampon tous les jours pendant cette période initiale de sept jours en versant le tampon de nettoyage utilisé dans un conteneur de déchets chimiques.

Et l’ajout de 45 millilitres de tampon de nettoyage frais. Une fois que tous les lipides sont solubilisés et que le tissu atteint la transparence, transférez l’échantillon dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres rempli de 45 millilitres de PBST, et lavez-le quatre fois à 40 degrés Celsius en secouant doucement au cours des prochaines 24 heures, pour éliminer les résidus de SDS. Après le lavage final du PBST, transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger propre de 15 millilitres rempli d’un microgramme par millilitre de DAPI et de 1xPBST.

Envelopper de papier d’aluminium et incuber à température ambiante pendant 24 heures. Le lendemain, laver trois fois au PBST à température ambiante pendant au moins six heures par lavage. Et puis procédez à l’appariement de l’indice de réfraction.

Pour commencer cette partie de la procédure, transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger propre de 15 millilitres rempli de 2-2 thiodiéthanol et de 1xPBS à PH 7,5 et incubez comme indiqué à l’écran. Vers la fin de la deuxième incubation, créez une chambre d’imagerie en enroulant un morceau d’adhésif réutilisable dans un cylindre de diamètre uniforme à peine supérieur à l’épaisseur de l’échantillon. Posez le cylindre en un cercle ouvert sur un plat à fond en verre de 40 millimètres.

Utilisez ensuite une pointe de pipette P1000 pour créer un joint entre l’adhésif réutilisable et le verre en l’enroulant autour du bord extérieur du cylindre. Pipetez environ 100 microlitres de TDE à 63 % sur le plat en verre et étalez-le pour couvrir la surface du verre dans le cercle de l’adhésif réutilisable. Ensuite, à l’aide d’une spatule, placez soigneusement l’échantillon au milieu du cercle en prenant soin de ne pas former de bulles.

Ensuite, pipetez 100 microlitres supplémentaires de TDE à 63 % directement sur l’échantillon et placez immédiatement un verre de couverture circulaire de 40 millimètres sur l’adhésif réutilisable. Utilisez l’index, le majeur et l’annulaire des deux mains pour appuyer soigneusement sur le périmètre du cercle jusqu’à ce que le verre de protection entre en contact avec l’échantillon. Maintenant, amenez lentement le plat à fond de verre en position verticale reposant contre une surface, puis ajoutez 63 % TDE avec une pipette jusqu’à ce que la solution atteigne la petite ouverture en haut.

Utilisez une lingette non pelucheuse pour sécher la pointe de la pipette afin que la solution ne coule pas sur le verre. Enfin, ajoutez de l’élastomère de silicium dans la petite ouverture pour enfermer le cercle et créer une chambre fermée. Attendez cinq minutes pour sécher, puis passez à l’imagerie.

Placez la chambre d’imagerie avec l’échantillon à l’intérieur sur la platine d’un microscope confocal à balayage laser. Ouvrez le logiciel d’imagerie, pour activer le laser d’excitation à argon, cliquez sur l’onglet de configuration en haut du programme, puis sur l’icône laser. Cochez la case à côté de l’argon pour alimenter le laser et déplacez l’échelle de la diapositive à 30 %Revenez à l’onglet d’acquisition en haut.

Dans la boîte de paramètres de trajectoire de faisceau, accédez à la boîte de configuration d’économie de charge et sélectionnez le menu déroulant pour sélectionner le canal de longueur d’onde approprié pour émettre YFP. Dans la zone des paramètres de canal, sélectionnez les objectifs appropriés pour l’imagerie en cliquant sur le lien hypertexte rouge intitulé objectif current object. Utilisez des objectifs avec une distance de travail supérieure à l’épaisseur du tissu.

Et une grande ouverture numérique pour maximiser la résolution de l’image dans le plan et pour minimiser l’épaisseur de la section optique. Dans la colonne de gauche des menus déroulants, ouvrez la fenêtre de résolution XY pour définir la matrice d’acquisition, appelée format à 1024x1024 ou une valeur appropriée à la limite de résolution latérale de l’objectif. Réglez le facteur de zoom aussi bas que possible.

1.7 est utilisé ici. Dans la même fenêtre, définissez les paramètres de moyenne de huitième ligne et de moyenne d’une image en déroulant les menus étiquetés individuellement en conséquence. Localisez l’échantillon à l’aide des commandes de la platine.

Une fois qu’un champ représentatif est visible, réglez le gain entre 760 et 780 et le décalage entre 1,0 et 1,5 pour YFP. Sélectionnez l’analyse des tuiles. Et puis fixez les limites supérieure et inférieure de la pile Z à acquérir.

Définissez l’épaisseur de la section optique en fonction de la limite de résolution de la section optique des objectifs, puis lancez l’acquisition. Cette image montre des neurones YFP positifs dans le cortex cérébral et l’hippocampe imagés avec un grossissement de 5x et reconstruits en 3D. La barre d’échelle représente un millimètre.

Cette projection d’intensité maximale d’une pile d’images 10x du cortex cérébral démontre l’aborisation dendritique des neurones pyramidaux de la couche corticale cinq. Ici, la barre d’échelle représente 100 microns. Ici, l’expression de THY-1YFP est montrée dans une moelle épinière cervicale et thoracique intacte, imagée à un grossissement de 5x et reconstruite en 3D.

La barre d’échelle représente deux millimètres. Enfin, cette projection d’intensité maximale d’un empilement imagé 10x de la moelle épinière, démontre les axones individuels, les barres d’échelle représentent 100 microns. Si elle est correctement appliquée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre semaines pour les moelles épinières entières et en quatre à six semaines pour les cerveaux hémisectés.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la chimie immunohistique peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions nécessitant un phénotypage biochimique plus complexe. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effacer optiquement et d’imager le système nerveux central d’une souris. Utilisation de la clarté passive et de la microscopie confocale laser.