Name: Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Découvrez l'imagerie de bioluminescence pour suivre les infections tardives de trypanosomiase africaine chez la souris. Cette méthode réduit l'évaluation des médicaments de 180 à 90 jours.

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Nous remercions John Kelly et Martin Taylor (London School of Hygiene and Tropical Medicine) pour fournir T. b. brucei GVR35-VSL-2 et le Dr Andrea Zelmer (LSHTM) pour obtenir des conseils sur l&#39; imagerie in vivo. Ce travail a été soutenu par le Programme Bill et Melinda Gates Fondation mondiale de la santé (nombre subvention OPPGH5337).

Éthique Tous les travaux ont été effectués en vertu de l&#39;approbation du Royaume-Uni Home Office Animaux (Procédures scientifiques) de la Loi de 1986 et la London School of Hygiene and Tropical Medicine Bien-être des animaux et Comité d&#39;éthique. ARRIVÉE directive sont suivies dans le présent rapport. 1. In Vivo Passage de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei <ol><li> Retirer un stock cryoconservés (stabilat appelé) de T. b. souche brucei GVR35-VSL-2 (disponible chez le professeur John Kelly à la London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine par MTA) 9 à partir de l&#39; azote liquide et laisser équilibrer à la température ambiante. Diluer stabilat à 2 x 10 4 trypanosomes / ml dans du tampon phosphate stérile de glucose (PBS-G) pH 8,0 (1 litre de PBS + 15 g de glucose) 10. Note: T. b. brucei GVR35-VSL-2 est non-infectieux pour l&#39; homme et exige SAPO autorisé des installations pour mener à bien des expériences. </li><li> Inject 20-25 g femelle CD1 souris avec 0,2 ml dilué trypanosomes par voie intrapéritonéale (IP) avec une aiguille de 25 G. Ceci est la &quot;souris donneuse&quot;. Placez la souris infectée dans un spécifique Pathogen gratuit (SPF) -cage et alimentation ad libitum. Remarque: les souris CD1 sont une souche consanguine et T. b. infections brucei GVR35 sont bien caractérisés dans cette souche. Cependant, ce protocole est également applicable aux souches consanguines ou génétiquement modifiés, mais il est important de noter que la couleur de la fourrure peut avoir un impact sur ​​la sensibilité de l&#39; imagerie 6,9. </li><li> Surveiller parasitémie périphérique par prélèvement de sang. Placez la souris dans un restrainer plastique et prendre 5 pi de sang de la queue par ponction veineuse avec 21 aiguilles G ou saignées et mélanger 1/10 avec 0,85% de chlorure d&#39;ammonium stérile pour lyser les globules rouges et de permettre un meilleur comptage. </li><li> Comptez le sang dilué dans un Neubauer hémocytomètre. <ol><li> Chargez le sang dilué dans les deux chambres. Comptez tout le gr centralid d&#39;une chambre pour donner n trypanosomes. Concentration de trypanosomes dans le sang = n x 10 4 trypanosomes / ml, ajuster pour tout facteur de dilution et de calculer la moyenne des deux chambres. Remarque: Après environ 5-7 jours après l&#39;infection, la parasitémie périphérique devrait augmenter suffisamment pour mener à bien une infection à une concentration de 2 x 10 4 trypanosomes / ml. </li></ol></li><li> Lorsque les niveaux de trypanosomes sont suffisants pour le nombre de souris nécessaires élevé, passer à l&#39;étape 1.6. Un niveau de parasitémie de 6 x 10 4 trypanosomes / ml dans une souris donneuse est suffisante pour l&#39; infection de 10 souris. Remarque: Pour des tailles de groupes statistiquement significatifs, n = 6 pour chaque groupe de souris de traitement sont nécessaires 8. Pour les autres modèles d&#39;infection, il faudrait appliquer pour déterminer la taille des groupes appropriés calculs de puissance. </li><li> Placez la souris dans une boîte de chaleur (à 28-30 ° C pendant environ 5-10 min) pour permettre aux veines de la queue à se dilater.Pour induire une anesthésie terminale, administrer 20 mg / kg iv pentobarbital avec une aiguille 25 G. Confirmer la souris est anesthésiée en appuyant doucement les coussinets pour assurer qu&#39;il n&#39;y a aucun retrait réflexe. </li><li> Hépariner une aiguille 21 G par aliquotage 5 ml d&#39;héparine à 5000 unités USP / ml dans un tube bijou et sucer deux fois dans et hors de l&#39;aiguille reliée à une seringue de 1 ml. </li><li> Prenez le héparinisé 21 G aiguille et seringue de 1 ml, et d&#39;effectuer une ponction cardiaque sur la souris de passage anesthésié par l&#39;insertion de l&#39;aiguille centrale en dessous de la cage thoracique (un cordon de sang commun dans la base de l&#39;aiguille) et tirez doucement sur le piston afin de ne pas replier l&#39;enceinte du coeur. Recueillir un minimum de 0,7 ml de sang. </li><li> Diluer sang infecté pour produire un inoculum de 2 x 10 4 trypanosomes / ml dans du PBS-G pH 8,0 que l&#39; étape 1.1 ci - dessus. Remarque: À ce stade, le sang restant peut être cryoconservés pour produire stabilat par mélange avec 8% de glycérol, 20% inactivé par la chaleur foetal casérum lf (salut-FCS) et du sang infecté 72%. geler lentement à -80 ° C en utilisant un lent gel gel récipient pour atteindre une vitesse de refroidissement de -1 ° C / min, avant le transfert à l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. L&#39;infection des souris expérimentales <ol><li> Placez CD1 souris femelles (~ 21-25 g) dans une boîte de chauffage pour réchauffer doucement pour dilater les veines. Placez les souris réchauffés dans un dispositif de retenue en plastique et injecter 0,2 ml inoculum dilué par voie intraveineuse avec une aiguille G 25 dans la veine de la queue, ce qui équivaut à 4.000 trypanosomes par souris. Placez la pression au niveau du site d&#39;injection après pour endiguer l&#39;hémorragie. Remarque: l&#39; infection intrapéritonéale est un itinéraire valide de l&#39; infection et a été utilisé dans les études précédentes 10, mais nous avons trouvé cela moins reproductible que la voie intraveineuse. </li><li> Randomize souris et cage infectées par groupes de 3 dans des cages SPF-ventilés. En tant que témoin, injecter CD1 souris femelles de type sauvage parasite non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3). </li><li> Surveiller l&#39;infection par le biais du sang Film Microscopie <ol><li> Spot 5 ul sang de venepuncture ou saignées sur une lame de verre et d&#39;effectuer un frottis sanguin (en utilisant une deuxième lame de verre pousser doucement la goutte de sang à travers la diapositive pour produire un film mince). Autoriser les diapositives à l&#39;air sec. </li><li> Fixer le frottis sanguin avec 100% de méthanol et tache avec Giemsa pendant 10 min avant de rincer avec dH 2 O et laisser sécher à l&#39; air. Sous l&#39;objectif 100X compter le nombre de trypanosomes dans 10 champs de vision (FOV). Remarque: le tournage de sang est effectué aux côtés de l&#39;animal entier imagerie non invasive dès après l&#39;infection d&#39;un jour. Lors du traitement d&#39;un certain nombre d&#39;animaux, cette méthode de détermination quantitative du trypanosome est préféré au comptage hémocytomètre que les échantillons peuvent être conservés à la température ambiante et on les compte plus tard. </li></ol></li></ol> 3. bioluminescence Imaging to Track Infection Remarque: Pour surveiller l&#39;infection, toute animal imagerie non invasive peut être utilisée. <ol><li> Préparer une solution mère de D-luciférine, le substrat de la luciférase de luciole, dans Phosphate Buffered Saline de Dulbecco (DPBS) à 30 mg / ml. Filtre stériliser et congeler à -20 ° C. Remarque: D-luciférine est sensible à la lumière, donc la protéger de la lumière en enveloppant aliquotes dans du papier. Ne pas la congélation-décongélation répétée luciférine car il peut affecter l&#39; activité 11. </li><li> Chauffer une partie aliquote de la D-luciférine à la température ambiante. Retirez chaque souris de la cage (y compris les souris témoins infectées par la souche nonbioluminescent parasite de type sauvage) et injecter 150 mg / kg de la D-luciférine réchauffé (dilué dans du DPBS) intrapéritonéale avec une aiguille 25 G. Placer la souris dans une chambre isofluorane pendant environ 5 min pour induire une anesthésie avec 2% d&#39; isofluorane / O 2 au mélange de 2,5 L / min. Note: Les souris deviennent immobiles quand ils sont sous anesthésie. Pour l&#39;imageur utilisé ici, 3 souris peuvent être traitées à la fois. Si les souris sont anesthettérisé pendant plus de 30 min, une pommade ophtalmique artificielle déchirure peut être appliquée pour prévenir les yeux des souris contre le dessèchement. </li><li> Pour l&#39;imageur décrit ici, ouvrez le logiciel et initialiser la machine en utilisant le logiciel selon les instructions du fabricant. Acquérir les images une fois caméra et plaque chauffante ont atteint la température. Remarque: Cet instrument est généralement pas éteint, permettant à la machine d&#39;effectuer des étalonnages de fond pendant la nuit. Dans le cas où il a besoin de redémarrer, il doit exécuter une vérification d&#39;étalonnage en premier. </li><li> Placer les souris anesthésiés dans l&#39;imageur (voir 3.5). Utilisez de grands séparateurs noirs entre les souris pour minimiser saigner à travers de tout signal bioluminescent lumineux. souris de l&#39;image en utilisant un ensemble de temps d&#39;exposition; 1, 3, 10, 30, 60 et 180 secondes, avec binning moyenne, 1 f / arrêt et un filtre ouvert, et le champ de vision E (12,5 x 12,5 cm 2). Remarque: Les souris témoins infectées par le type sauvage parasites GVR35 nonbioluminescent fournissent un backgrvaleur de bioluminescence ound. À partir d&#39; un essai de cinétique de luciférine (figure 6) avec ce modèle, nous avons constaté que les crêtes du signal de bioluminescence à 10 minutes après l&#39; administration et de l&#39; imagerie dure environ 5 minutes pour 3 souris. Prenez ce délai en considération lors de l&#39;anesthésie et l&#39;imagerie des souris. </li><li> Pour assurer l&#39;imagerie approfondie des souris, tourner pour obtenir une ventrale, dorsale et vue latérale. Maintenir la cohérence dans l&#39;ordre d&#39;orientation pour l&#39;imagerie entre les animaux séquentielles. </li><li> Après l&#39;imagerie, permettent la souris pour récupérer de l&#39;anesthésie sous observation avant de revenir au SPF-cage. </li><li> Continuer imagerie souris tous les 7 jours jusqu&#39;au jour 21 post-infection. Il devrait y avoir une augmentation constante du signal de bioluminescence sur l&#39;animal entier. </li><li> A D21, l&#39;image et le film de sang des souris comme décrit ci-dessus et la dose souris avec 40 mg / kg par voie intrapéritonéale acéturate de diminazène. Ce médicament va effacer la parasitémie périphérique, mais ne sera pas traverser la barrière hémato-brain barrière, et permet donc une meilleure visualisation de l&#39;infection du système nerveux central. Remarque: Diminazène diminazène est un médicament bien établie utilisée pour traiter la trypanosomiase animale à un stade précoce. </li><li> Continuer l&#39;imagerie et la surveillance à J28 et J35. </li></ol> 4. Confirmation CNS Infection <ol><li> A D35, les souris d&#39;image indiqués ci-dessus (étapes 3.1-3.4). </li><li> Après l&#39;exposition, les souris permettent de récupérer à partir de souris d&#39;anesthésie et exsangue comme décrit à l&#39;étape de 1,6 à 1,8, la collecte de sang pour une analyse ultérieure. </li><li> Suite à une ponction cardiaque, perfuse des souris avec 20 ml de PBS (en option: ajouter 3 mg / ml de luciférine à une solution de perfusion), par l&#39;intermédiaire du coeur pour effacer le sang provenant des organes et à réintroduire l&#39;étiquette de luciférine qui aurait effacé de la région du cerveau au cours de l&#39;intervalle de temps de l&#39;étape 4.1. </li><li> Retirez délicatement le cerveau, en utilisant des ciseaux courbes, coupe de la base autour de la circonférence du crâne, et soulevant la partie supérieure du crâne, pour permettre au cerveauà soulever délicatement avec une pince incurvées. </li><li> Placer excisés du cerveau sur une section de matière plastique noire et la pipette 50 ul de 15 mg / ml de luciférine sur l&#39;organe avant l&#39;imagerie, afin d&#39;assurer la luciférine adéquate a été ajoutée au cerveau excisée. L&#39;image en utilisant les paramètres ci-dessus. Cela démontrera la localisation de l&#39;infection aux hémisphères cérébraux. Remarque: la quantification de la parasitémie en aval sur le cerveau excisé peut être effectuée par qPCR 8 comme décrit précédemment. D&#39;autres applications en aval alternatives peuvent inclure histologie ou immuno-histochimie afin d&#39;identifier des parasites dans le tissu cérébral après fixation. </li></ol> 5. Quantification de la bioluminescence Imaging Note: bioluminescence peut être quantifiée en utilisant la région d&#39;intérêt (ROI) avec le logiciel d&#39;imagerie et corrigé pour le fond bioluminescence. <ol><li> Utilisation de l&#39;outil de retour sur investissement, créer un ROI rectangulaire pour l&#39;animal entier une quantificationnd positionner sur l&#39;image de la souris pour couvrir la pointe du nez à la base de la queue de la souris. Utilisez la même boîte de taille pour chaque animal et chaque point de temps. Lorsque l&#39;on regarde le retour sur investissement pour le cerveau, utilisez un ROI circulaire de la même manière, en le positionnant sur la région de la tête de la souris dans l&#39;image. </li><li> Si vous le souhaitez, d&#39;ajuster les images apparaissent sur le même spectre pour une représentation visuelle de l&#39;infection. Remarque: Le logiciel utilisé ici génère une carte de couleur pour chaque image réglée automatiquement pour le comptage de photons minimum et maximum. Pour permettre une comparaison visuelle entre une série d&#39;images, l&#39;échelle de couleurs doit être réglé sur les mêmes valeurs pour toutes les images. <ol><li> Utilisation de l&#39;image la plus bioluminescence et l&#39;onglet «Réglage d&#39;image» sur la palette d&#39;outils, sélectionnez une échelle logarithmique et une échelle minimale de couleur appropriée et maximale (à déterminer empiriquement). Appliquer cette échelle à toutes les images tout au long de l&#39;expérience. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le développement d&#39;un T. bioluminescente b. souche brucei GVR35 permet la visualisation d&#39;une infection trypanosomienne du début à la fin de l&#39; étape. Modèles d&#39;infection antérieurs ont été incapables de détecter la phase tardive, lorsque les parasites sont dans le cerveau, en temps réel de la microscopie de frottis sanguin, et nécessitaient l&#39;abattage et l&#39; élimination des cerveaux de souris infectées afin de déterminer la charge parasitaire 12. La biolumine...

La trypanosomiase humaine africaine (THA), ou maladie du sommeil, est causée par les parasites protozoaires à transmission vectorielle de Trypanosoma brucei spp1. Le nombre de cas actuels est estimé à moins de 7 mille chaque année, avec près de 70 millions de personnes exposées au risque d’infection parasitaire sur le continent africain. La maladie, qui est le plus souvent mortelle si elle n’est pas traitée, comprend un stade hémolymphatique précoce où les parasites sont présents dans le sang, progressant vers un stade tardif lorsque les parasites envahissent le système nerveux central (SNC) et ne sont plus sensibles au traitement par des médicaments trypanosomales à un stade précoce2. Les traitements médicamenteux actuels pour la THA à un stade avancé ont à la fois des schémas thérapeutiques complexes et prolongés et des effets indésirables graves, ainsi qu’une résistance signalée, de sorte que la recherche de nouveaux traitements médicamenteux est impérative3,4. 
L’étude de la trypanosomiase humaine africaine (HAT) à un stade avancé dans des modèles murins traditionnels est longue et complexe, l’ablation de tissu cérébral étant nécessaire pour surveiller la charge parasitaire5. La souche infectieuse animale T. b. brucei est utilisée comme modèle d’étude de la trypanosomiase, le stade avancé apparaissant 21 jours après l’infection (dpi). Pour surveiller l’infection parasitaire non bioluminescente de type sauvage dans le modèle murin, les frottis sanguins périphériques ou la PCR quantitative sont les seules méthodes pour déterminer la charge parasitaire. Pour la charge parasitaire dans le cerveau, la souris doit être éliminée, le cerveau excisé et la qPCR effectuée sur les tissus, ce qui rend impossible le suivi des parasites à plusieurs moments de l’infection au stade avancé. Cela se traduit par l’incapacité de suivre en temps réel les infections dans le système nerveux central (SNC). 
L’imagerie de bioluminescence in vivo (BLI) peut fournir une détection très sensible et non invasive de la dissémination du parasite et de la progression de la maladie dans un modèle murin qui peut être suivi chez un seul animal pendant toute la durée de l’expérience6. BLI est basé sur l’émission de lumière dans le spectre visible produite par une réaction catalysée par la luciférase. Les photons émis sont ensuite détectés par une caméra CCD (dispositif à couplage de charge)7. À cette fin, l’agent pathogène est génétiquement modifié pour exprimer une protéine de luciférase et le substrat, la luciférine, est introduit à des points temporels d’intérêt par injection. Le principal avantage de cette méthode est la possibilité de réaliser des études longitudinales, dans lesquelles le même animal peut être imagé plusieurs fois avec un minimum d’effets indésirables. Le signal de bioluminescence acquis peut être quantifié, indiquant ainsi la charge pathogène.
L’optimisation et la validation d’un T. b. brucei bioluminescent décalé vers le rouge ont permis d’étudier l’infection à un stade avancé grâce à des procédures non invasives, détectant les parasites plus tôt que la microscopie à film sanguin et réduisant considérablement le temps, le coût et le nombre d’animaux nécessaires pour étudier l’infection du SNC et le dépistage de médicaments dans la trypanosomiase à un stade avancé8,9. Dans ce protocole, nous démontrons l’infection de souris avec des trypanosomes bioluminescents et comment visualiser ensuite les parasites in vivo pour quantifier la progression de la maladie et la pénétration du SNC.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>P4417</td><td>comprimés pH 7,4</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>G8270</td><td>99,5 % (moléculaire) Chlorure</td></tr><tr><td>d’ammonium</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>A9434</td><td>99,5 % (moléculaire)</td></tr><tr><td>Héparine (sel de lithium)</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, Royaume-Uni</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>D4031</td><td>Filtré stérile</td></tr><tr><td>M. Frosty</td><td>Nalgene, Royaume-Uni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer, Royaume-Uni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma,</td><td>Royaume-Uni 115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acéturate de diminazène</td><td>Sigma, Royaume-Uni</td><td>D7770</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer, Royaume-Uni</td><td></td><td>autres bioimageurs disponibles par exemple de Bruker, Kodak</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer, Royaume-Uni</td><td></td><td>Logiciel propriétaire pour les instruments Perkin Elmer IVIS ; d’autres instruments peuvent avoir leur propre</td></tr><tr><td>seringue de 1 ml</td><td>Fisher Scientific, Royaume-Uni</td><td>10142104</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 20 ml</td><td>Fisher Scientific, Royaume-Uni</td><td>10743785</td><td></td></tr><tr><td>aiguilles</td> <td>de 25 gGreiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G Aiguilles</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope double dépolie</td><td>VWR, UK</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tube de microcentrifugation</td><td>StarLab, UK</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Tube Bijou</td><td>StarLab, UK</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de contention de souris</td><td>Sigma, UK</td><td>Z756903</td><td>Notre dispositif de contention a été fabriqué en interne, il s’agit d’un modèle similaire</td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging pour détecter late stage infection de la trypanosomiase africaine

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

La trypanosomiase humaine africaine (HAT) est une maladie à plusieurs stades qui se manifeste en deux stades : un stade sanguin précoce et un stade tardif lorsque le parasite envahit le système nerveux central (SNC). L’étude in vivo du stade avancé a été limitée, car les méthodologies traditionnelles nécessitent l’ablation du cerveau pour déterminer la présence des parasites.
L’imagerie par bioluminescence est une forme d’imagerie optique non invasive et très sensible qui permet de visualiser en temps réel un agent pathogène transfecté par la luciférase. En utilisant une souche de trypanosome transfectée qui a la capacité de produire une maladie à un stade avancé chez la souris, nous sommes en mesure d’étudier la cinétique d’une infection du SNC chez un seul animal tout au long de l’infection, ainsi que d’observer le mouvement et la dissémination d’une infection systémique.
Nous décrivons ici un protocole robuste pour étudier les infections du SNC à l’aide d’un modèle de bioluminescence de la trypanosomiase africaine, fournissant des observations non invasives en temps réel qui peuvent être analysées plus en détail avec des approches optionnelles en aval.

Ce protocole démontre comment suivre la progression de la maladie après infection de souris avec T. b. brucei, un modèle pour la trypanosomiase humaine africaine. La figure 1 montre la chronologie du protocole expérimental, ce qui démontre le calendrier de traitement et d&#39; imagerie étapes. La figure 2 montre un champ de vue typique dans un Giemsa teinté frottis sanguin fixe utilisé pour quantifier la parasitémie périphérique, avec des trypan...

Ce manuscrit décrit l’utilisation d’une souche bioluminescente de trypanosomes africains pour permettre le suivi de l’infection à un stade avancé et démontre comment l’imagerie en direct in vivo peut être utilisée pour visualiser les infections au sein du système nerveux central en temps réel.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser l'imagerie dynamique in vivo pour suivre en temps réel une infection par des trypanosomes, en visualisant les stades initiaux de l'infection sanguine jusqu'aux stades avancés d'infection cérébrale chez la souris, ce qui reproduit la progression clinique de la maladie du sommeil. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des trypanosomes, en identifiant de nouveaux traitements thérapeutiques potentiels et en évaluant leur efficacité contre l'infection. Le principal avantage de cette technique est que l'évaluation des médicaments peut être réalisée en 90 jours, contre 180 jours nécessaires pour le modèle de référence précédent.Ce protocole peut fournir des informations sur la trypanosomiase africaine humaine, mais s'applique également à d'autres modèles de maladies infectieuses telles que la tuberculose ou la maladie de Chagas. Commencez par placer des souris femelles CD1 de 21 à 25 grammes dans une boîte chauffante afin de dilater les veines de la queue. Ensuite, placez individuellement les souris réchauffées dans un dispositif de contention en plastique et utilisez une aiguille de calibre 25 pour injecter 0,2 millilitre d'inoculum dilué de Trypanosoma brucei GVR35VSL2 par voie intraveineuse dans la veine de la queue, en appliquant immédiatement une pression sur le site d'injection pour arrêter le saignement.Pour surveiller l'infection par microscopie sur frottis sanguin, déposez cinq microlitres de sang sur une lame en verre. Utilisez une seconde lame en verre pour étaler doucement la goutte sur la première lame, afin d'obtenir un film mince. Laissez sécher les lames à l'air, puis fixez le sang dans du méthanol à 100 %, suivi de 10 minutes dans le colorant de Giemsa.À la fin de l'incubation, rincez les lames avec de l'eau distillée et laissez-les sécher à l'air libre. Ensuite, comptez le nombre de trypanosomes dans 10 champs observés au microscope avec un objectif de 100x. Pour suivre l'infection par imagerie bioluminescente, portez un aliquot de D-luciférine à température ambiante.Ensuite, utilisez une aiguille de 25 g pour injecter par voie intrapéritonéale 150 milligrammes par kilogramme de luciférine réchauffée par animal. Puis, initialisez l'appareil à l'aide du logiciel de l'imagerie conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, lorsque la caméra et la plaque chauffante ont atteint les températures appropriées, placez des séparateurs noirs de grande taille entre les animaux anesthésiés afin de minimiser le phénomène de recouvrement de tout signal bioluminescent intense.Imager les souris en utilisant une série de temps d'exposition avec un regroupement moyen, un diaphragme ouvert d'un cran et un filtre ouvert, et un champ de vision E de 12,5 fois 12,5 centimètres. Pour garantir un examen d'imagerie complet des souris, faire pivoter les animaux afin d'obtenir des vues ventrales, dorsales et latérales. Au jour 21, imager et réaliser des frottis sanguins des souris comme indiqué.Ensuite, administrer aux animaux 40 milligrammes par kilogramme de diminazine acéture par voie intrapéritonéale afin d'éliminer la parasitémie périphérique. Après l'imagerie des animaux au jour 35, placer les cerveaux prélevés sur un morceau de plastique noir et déposer 50 microlitres de 15 milligrammes par millilitre de luciférine sur les tissus. Puis, réaliser l'imagerie du cerveau en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour l'imagerie de l'animal entier.Pour quantifier le degré de bioluminescence dans des régions d'intérêt spécifiques, ou ROI, sélectionnez l'outil ROI dans le logiciel d'imagerie et créez un ROI rectangulaire pour la quantification de l'animal entier. Positionnez le ROI sur l'image de la souris, du bout du nez jusqu'à la base de la queue, et, en utilisant une boîte de même taille pour chaque animal et à chaque point temporel, mesurez le flux total. Pour évaluer le ROI du cerveau uniquement, créez un ROI circulaire et placez-le sur la région de la tête de l'animal.Répétez pour chaque animal et mesurez le flux total. Ensuite, à l’aide de l’image présentant la bioluminescence la plus élevée et de l’onglet ajustement d’image dans la palette d’outils, sélectionnez une échelle logarithmique ainsi qu’un minimum et un maximum appropriés pour l’échelle de couleurs, puis appliquez cette échelle à toutes les images de l’expérience. Le développement de l’infection peut être suivi in vivo par des mesures successives de la bioluminescence afin de déterminer le degré d’infection chez les animaux au cours de l’expérience.Au fur et à mesure que l'infection progresse, une augmentation de la bioluminescence peut être observée chez tous les animaux au cours des 21 premiers jours, le signal devenant plus diffus et plus intense, les régions de bioluminescence les plus marquées étant visibles au niveau de la rate. Le jour 21, les souris sont traitées par l'acéturate de diminazine après l'imagerie, comme vient de l'être démontré, ce qui entraîne la présence de faibles niveaux de bioluminescence uniquement dans le cerveau au jour 28, l'infection périphérique étant éliminée. Au jour 35, le signal est non seulement encore présent dans la région de la tête, mais il est également devenu plus intense, indiquant une possible infection cérébrale.La quantification de la parasitémie périphérique et de la bioluminescence permet l'évaluation de la cinétique de la maladie. Par exemple, dans cette expérience, au jour 7, un signal de bioluminescence élevé de 1 × 10⁸ photons par seconde a été observé, tandis que la parasitémie observée était très faible dans les frottis sanguins réalisés le même jour. Au jour 28, la parasitémie est devenue indétectable dans les frottis sanguins en raison du traitement par acéturate de diminazène administré au jour 21, tandis que la bioluminescence est restée au-dessus des niveaux de fond jusqu'au jour 35, correspondant à la bioluminescence observée dans la région de la tête et confirmant la sensibilité supérieure de l'analyse par bioluminescence par rapport au frottis sanguin.L'imagerie par bioluminescence du cerveau elle-même révèle des différences dans la charge infectieuse entre les animaux, qui ne semble pas se localiser à des régions anatomiques spécifiques du tissu. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir une gamme adéquate de temps d'exposition afin d'obtenir des données d'imagerie de qualité, car une surexposition, par exemple, nuit aux détails essentiels de localisation. Après cette procédure, d'autres méthodes complémentaires telles que la PCR quantitative et l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la charge parasitaire cérébrale et la localisation du parasite.Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs spécialisés en biologie des trypanosomes d'effectuer des évaluations de médicaments dans les 90 jours suivant l'infection, grâce à une sensibilité améliorée dans la détection des rechutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser l'imagerie par bioluminescence de l'infection à TB brucei pour suivre l'évolution de la maladie, depuis le sang jusqu'à l'infection du cerveau au stade avancé.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Bioluminescent imagerie bactérienne<em&gt; In Vivo</em

En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d'imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d'identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l'invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d'identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antiviraux et des vaccins plus rapidement que les modèles...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Source : de Vries, C. R., et al., Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie par Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo présente une technique d’imagerie bioluminescente pour surveiller la progression de l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. Des bactéries pathogènes conçues avec le système rapporteur luxABCDE émettent de la lumière au site d’infection, permettant la visualisation des bactéries métaboliquement actives. En imageant la...

Imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez la souris

La dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains est difficile à étudier par les techniques traditionnelles de biologie cellulaire telles que la microscopie électronique et la microscopie à fluorescence.  Comme moyen d’observer le comportement dynamique des organites, un système rapporteur d’organites fluorescents a été utilisé en conjonction avec la cytométrie en flux pour surveiller la dynamique des glycosomes en temps réel chez les parasites vivants.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Ce protocole décrit l'établissement d'un modèle de souris tumeur-portant pour surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse en temps réel par la formation image double de bioluminescence.

Double imagerie de bioluminescence de la progression tumorale et de l'angiogenèse

Le protocole fourni ici décrit en détail les étapes détaillées de la réalisation d’études d’efficacité médicamenteuse dans un modèle bioluminescent d’infection à Trypanosoma cruzi , en mettant l’accent sur l’acquisition, l’analyse et l’interprétation des données. Des procédures de dépannage et de contrôle de la qualité visant à minimiser les problèmes techniques sont également fournies.

Démystifier l’imagerie par bioluminescence in vivo d’un modèle murin de la maladie de Chagas pour des études d’efficacité de médicaments

Nous présentons ici une évaluation longitudinale de hamsters dorés infectés par voie intrapéritonéale (IP) ou intragingivale (IG) par L. infantum-Luc par imagerie bioluminescente et par PCR. Les hamsters ont été évalués 1 jour après l’infection (1 dpi), 1 semaine après l’infection (8 dpi) et 3 semaines après l’infection (22 dpi) et euthanasiés à la 50e dpi et 8 mois après l’infection.

In vivo Imagerie de hamsters infectés par Leishmania infantum par inoculation gingivale d’amastigotes axéniques exprimant la luciférase

La thérapie antirétrovirale pour traiter le VIH / SIDA est surveillé en Afrique du Sud sur une grande échelle. La cytométrie en flux est combiné pour l'hématologie (CD45), de l'immunologie (CD4) et la charge virale liée CD38 dosage. Enregistré à NHLS-SA laboratoires, à Johannesburg, ces méthodes modernes sont rentables avec contrôle de la qualité accrue locaux internes, servant de modèles de rôle pour les ressources limitées de diagnostic.

Coût global de surveillance et de laboratoire efficace du VIH / sida: un modèle en Afrique

NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

Imagerie par bioluminescence de l&#39;activité de la NADPH oxydase dans différents modèles animaux

Découvrez l'imagerie de bioluminescence pour suivre les infections tardives de trypanosomiase africaine chez la souris. Cette méthode réduit l'évaluation des médicaments de 180 à 90 jours.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

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