Name: le Ex Vivo Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Apprenez la culture ex vivo d'organoides intestinaux de souris et leur stimulation par PAMPs et Listeria monocytogenes. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène et l'expression génique.

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Les auteurs tiennent à remercier Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel et Bettina Heid pour les discussions techniques. Les auteurs remercient le Dr Nanda Nanthakumar d’avoir fourni les cellules Caco-2. Les auteurs remercient également le Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) de Virginia Tech. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (à l’I.C.A.). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La culture et l&#39;entretien des organites intestinale est une procédure qui peut être maîtrisé par un individu avec la technique de culture de tissu adéquat. Il existe des nuances dans des passages par rapport aux cellules cultivées dans un monocouche plus classique, mais ces nuances ne sont pas difficiles à surmonter. Les étapes essentielles de cette méthode impliquent d&#39;être en mesure de cultiver les organites à une densité suffisante pour l&#39;ensemencement optimal. Les expériences doivent être revus à la bais...

La capacité de récolte et organites culture primaires ont été décrits pour l&#39; intestin grêle, du côlon, du pancréas, du foie et du cerveau et sont avancées intéressantes germane à la compréhension d&#39; un phénomène plus physiologiquement représentant pour la biologie des tissus 1-5. Les premières méthodes décrivant la culture et l&#39; entretien des petits organites intestinale a été signalée par Sato et al. Du laboratoire de Hans Clevers 1. Avant cette méthode, la récolte et la culture des cellules épithéliales intestinales primaires se sont révélées être limitée et inefficace pour soutenir la croissance des cellules épithéliales. Ces méthodes comprennent la dissociation du tissu par incubation avec des enzymes telles que la collagénase et de la dispase, ce qui conduirait finalement à l&#39;excroissance de cellules de fibroblastes primaires entremêlées 6. Ces conditions seraient également limitée dans le temps dans le maintien de la culture cellulaire épithéliale. Minimal à aucune niche de cellules épithéliales formeraient, comme les cellules épithéliales entreraient en raison de l&#39;apoptosel&#39;absence de facteurs ou de perte d&#39;intégrité de contact croissance appropriés, appelé anokis 7. L&#39;avènement du système de culture en 3D organoïde a fourni une méthode pour la culture des cellules intestinales primaires contenant un spectre de types de cellules intestinales en culture prolongée 1. Ces organites epitheliales ont des avantages sur les lignées de cellules étant qu&#39;elles sont composées de plusieurs cellules différenciées, et mieux mimer l&#39;organe qu&#39;ils dérivent de 8 in vivo. Le processus pour finalement &quot;pousser un mini intestin dans un plat&quot; est avéré être un outil précieux pour évaluer la réponse de l&#39;épithélium intestinal sous différents stimuli. Étude de l&#39;interaction des cellules intestinales primaires avec des motifs microbiens pathogènes associés moléculaires (PAMP) est pertinente pour le domaine de l&#39; immunologie que ces motifs moléculaires peuvent réguler les réponses diverses à la fois hôte et microbe 9. Non seulement les chercheurs peuvent explorer maintenant ces interactions avec les organites de la souris, mais ilspeut être cultivé à partir de l&#39; homme ainsi 2. Cette technologie a le potentiel de modifier radicalement la médecine personnalisée et il est tentant de spéculer sur les progrès que cette technique rendra possible dans un avenir proche. Le but global de ce procédé est de fournir un protocole pour la culture, l&#39;expansion et le traitement des organites intestinaux avec une variété de stimuli. Ces stimuli peuvent finalement aller de vaccins, PAMP bactériens, des agents pathogènes vivants, gastro-intestinal (GI) et la thérapeutique du cancer. L&#39;isolement et la culture des organites intestinale de souris a été adapté de Sato et al. Bien qu&#39;il existe de légères déviations par rapport à la méthode originale, le produit final étant organoide culture est toujours atteint en suivant ce protocole. Cette méthode se concentre sur la description d&#39;une technique adéquate pour la normalisation appropriée lorsque l&#39;on travaille avec des structures de cellules non-homogènes, qui doivent être prises en considération lors de la conduite d&#39;un essai basé sur la cellule nombre.

<table><tbody><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td><td>(Section 1,3,6) Ou marque équivalente</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td><td>(Section 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td><td>(Section 1,6) Pour les cellules Caco-2 et HEK293 Rsactin1</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 sécrétant la lignée</td><td></td><td></td> <td>cellulaire(Chapitre 1) Décrit et modifié d’après Kim, K.A. et al. Les particules lentivirales contenaient de l’ADNc RSPO1(NM_138683) ORF cloné dans un squelette pReceiver-Lv105 commandé et acheté sur mesure auprès de GeneCopoeia.</td></tr><tr><td>Tube conique de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(Section 1) Ou marque équivalente</td></tr><tr><td>T-175 Flacon</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>(Section 1) Ou marque équivalente&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matrice protéique</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Section 2,3,4,5,6) Facteur de croissance du matrigel réduit&nbsp ;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco’s (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Section 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>(Section 2,3) Advanced DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24 Well TC Plates</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>N2 Supplément 100x&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>B27 sans vitamine A 50x&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp ;</td><td>(Chapitre 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>Supplément de glutamine (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(Section 2) Peut se combiner avec Advanced DMEM/ F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(Section 2) Peut combiner avec Advanced DMEM/ F12&nbsp ;</td></tr><tr><td>10ml Pipette sérologique</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(Section 2) Ou marque équivalente</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(Section 2) Stock = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Acétyl-L-cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(Section 2) Stock = 1M</td></tr><tr><td>Souris recombinante EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Section 2) Stock = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>ciseaux</td><td></td><td></td> de dissection<td>(Section 3)</td></tr><tr><td>pince</td><td></td><td></td>(<td>Section 3)</td></tr><tr><td>lames</td><td></td><td></td> de verre<td>(Section 3)</td></tr><tr><td>pince</td><td></td><td></td> à épiler<td>(Section 3)</td></tr><tr><td>25 ml Pipette Sérologique</td><td>Faucon</td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>(Section 3) 0,5M ou alternative Boîte</td></tr> de <tr><td>Pétri stérile EDTA de qualité TC 100mm x 15mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>(Section 3) Ou boîte TC de taille égale</td></tr><tr><td>Seringue 1ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>(Section 4)</td></tr><tr><td>Aiguille de glissement de précision</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td><td>(Section 4) 23G x 1 1/4 (0,6mm x 30mm)</td></tr><tr><td>Flagelline de Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp ;</td><td>(Sections 5 et 6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Section 5,6)&nbsp ;( Murray&nbsp ; et&nbsp ;al.)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(Section 5,6)Ou marque équivalente</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>Trypsine&nbsp ;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>(section 6)</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>(section 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecuar Devices</td><td></td><td>(section 6)</td></tr><tr><td>96 Well Assay Plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>(section 6) Plaque noire, fond transparent TC traité</td></tr><tr><td>Nuclear Staine</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>(section 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Section 6) Ou tube</td></tr><tr><td>conique de 15 ml</td> de marque <td>équivalente Falcon</td><td>352096</td><td>(Section1,3) Ou</td></tr><tr><td>tube en polypropylène de 1,7 ml</td> de marque équivalente <td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>Ou de marque équivalente</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>Ou de marque équivalente</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman kit de dosage de l’expression génique</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman kit de test d’expression</td></tr> génique <tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman kit de test d’expression génique</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman kit de test d’expression génique</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman kit de test d’expression génique</td></tr><tr><td>7500 Système PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de réaction optique rapide à 96 puits, 0,1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Protéine R-Spondin 1 de souris recombinante R</td><td>& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>de chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

le<em&gt; ex vivo</em&gt; culture et pattern recognition receptor stimulation de la souris intestinal organites

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

organites intestinales primaires sont un système modèle précieux qui a le potentiel d&#39;impact significatif sur le domaine de l&#39;immunologie des muqueuses. Cependant, la complexité des caractéristiques de croissance organoïdes portent des mises en garde importantes pour l&#39;enquêteur. Plus précisément, les motifs de chaque individu organoïde de croissance sont très variables et à créer une population hétérogène de cellules épithéliales en culture. Avec de telles mises en garde, les pratiques de culture de tissu commun ne peuvent pas être simplement appliquées au système organoide en raison de la complexité de la structure cellulaire. Comptage et placage basée uniquement sur le nombre de cellules, ce qui est courant pour les cellules séparées individuellement, telles que des lignées cellulaires, ne sont pas une méthode fiable pour organites sauf si une technique de normalisation est appliquée. Normaliser à teneur totale en protéines est rendue complexe en raison de la matrice protéique résident. Ces caractéristiques en termes de nombre de cellules, la forme et le type de cellules devraient être prises en considération lors de l&#39;évaluation con sécrétéetentes de la masse organoide. Ce protocole a été généré pour décrire une procédure simple pour la culture et de traiter les petites organites intestinales avec des agents pathogènes microbiens et des modèles moléculaires de pathogènes associés (PAMP). Il souligne également les techniques de normalisation qui devraient être appliquées lorsque l&#39;analyse des protéines sont effectuées après un tel défi.

En suivant ce protocole pour cultiver organites intestinale, en forme de sphère organites caractéristiques seront présents après la récolte. L&#39;addition de R-spondin1 milieu conditionné par jour va initier la croissance et le bourgeonnement des organites. La croissance des organites est représentée sur la figure 1A - F et est représentative de l&#39; intestin organites les jours 1, 2, 4, 5, 6 et le jour 14. La figure 1E</stron...

Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l&#39; accent sur ​​l&#39; expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les effets d'une infection pathogène sur des organoïdes de l'intestin grêle, en mettant l'accent sur les techniques de normalisation par rapport au nombre total de cellules. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie innée ainsi que de l'immunologie muqueuse, en offrant un moyen d'étudier in vitro les interactions hôte-pathogène entre des bactéries et des cellules épithéliales intestinales. Une étape essentielle de cette procédure est la méthode de normalisation par rapport au nombre total de cellules, une nécessité lors de la mesure de protéines sécrétées par les organoïdes à l’aide de techniques telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA). Pour récolter les cryptes intestinales de souris destinées à la culture d’organoïdes, commencez par utiliser une lame de verre stérile pour gratter doucement les villosités à la surface luminaire de l’intestin grêle. Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection pour découper le tissu en bandes de 1 à 2 centimètres de longueur. Placez les bandes dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PBS glacé. Mélangez le contenu par retournement doux et laissez le tissu se déposer au fond du tube. Aspirez ensuite le PBS et lavez les bandes trois fois supplémentaires avec 10 millilitres de PBS frais, chaque fois de la même manière. À la fin du dernier lavage, placez le tube sur de la glace pendant dix minutes. Remplacez ensuite le PBS par 25 millilitres de PBS supplémenté avec 2 millimolaire de EDTA, dans un bac à glace placé sur une plateforme agitée, pendant 45 minutes. À la fin de l'incubation, laissez les bandes de tissu se déposer au fond du tube, puis remplacez le PBS-EDTA par 10 millilitres de PBS supplémenté avec 10 % de FBS. Agitez vigoureusement le tube à la main dix fois. Laissez ensuite le tissu se déposer au fond du tube et transférez le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté « Fraction 1 ». Agitez le tissu dans le PBS-FBS cinq fois supplémentaires, en transférant à chaque fois le surnageant dans un nouveau tube de fraction. Après la dernière agitation, centrifugez tous les échantillons et remettez en suspension les culots dans cinq millilitres de DMEM/F12 préchauffé, sans facteurs de croissance ajoutés. Faites ensuite une nouvelle centrifugation et aspirez quatre millilitres du surnageant de chaque tube. Remettez les culots en suspension dans le dernier millilitre de milieu restant et utilisez des aliquotes de 20 microlitres provenant de chaque fraction pour visualiser les cryptes et les débris sur des lames en verre. Après avoir regroupé les fractions appropriées afin d’obtenir le rapport le plus élevé possible entre cryptes et débris, centrifugez les fractions regroupées et aspirez tout le surnageant sauf les 50 à 100 microlitres restants. En gardant les tubes sur la glace, ajoutez 1 millilitre de matrice protéique aux fractions regroupées, en pipetant lentement de haut en bas pour éviter d’introduire des bulles d’air. Ajoutez ensuite 50 microlitres de la suspension matrice protéique/cryptes au centre de chaque puits de 37

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Une méthode simple pour établir murin colon organoïde de la tumeur primitive est décrite. Cette méthode utilise la fonction que les cellules tumorales du côlon survivre et se développer dans organites dans un milieu contenant des facteurs de croissance limitées, alors côlon normal épithéliale n'en ont pas.

In vitro Organoid Culture des primaires tumeurs du côlon de souris

La technologie d’imagerie améliorée permet l’imagerie tridimensionnelle des organes au cours du développement. Nous décrivons ici un système complet de culture d’organes qui permet l’imagerie en direct des villosités en développement dans l’intestin fœtal de la souris.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Les petits organites des cryptes intestinales en culture ex vivo de fournir un système de culture de tissu qui récapitule croissance des cryptes charge sur les cellules souches et leur niche. Nous avons établi une méthode pour analyser le profil métabolique en temps réel organites de la crypte de la souris primaire. Nous avons trouvé organites maintenir les propriétés physiologiques définis par leur source.

Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

La culture d’organes ex vivo permet d’étudier les processus biologiques dans le contexte de l’architecture tissulaire intacte. Ici, nous présentons une méthode de culture ex vivo du côlon de souris, qui peut être utilisée pour étudier l’immunité innée et la défense antimicrobienne de l’hôte dans l’intestin.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture et son utilisation dans l&#39;hôte antimicrobienne études de la défense

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.

Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

Nous décrivons un protocole pour isoler les cryptes de l’intestin grêle murin et cultiver des organoïdes intestinaux 3D à partir des cryptes. De plus, nous décrivons une méthode pour générer des organoïdes à partir d’une seule cellule souche intestinale en l’absence d’une niche cellulaire sous-épithéliale.

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

Apprenez la culture ex vivo d'organoides intestinaux de souris et leur stimulation par PAMPs et Listeria monocytogenes. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène et l'expression génique.

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