le Ex Vivo Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les effets de la provocation pathogène sur les organoïdes de l’intestin grêle, en mettant l’accent sur les techniques de normalisation par rapport au nombre total de cellules. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie innée et muqueuse en fournissant un moyen d’étudier les interactions hôte-pathogène des bactéries avec les cellules épithéliales intestinales in vitro. La méthode de normalisation par rapport au nombre total de cellules est essentielle à cette procédure, une nécessité lors de la mesure des protéines sécrétées par des organoïdes via des techniques telles que ELISA.To moissonner les cryptes de l’intestin grêle de souris pour la culture d’organoïdes, commencer par utiliser une lame de verre stérile pour gratter doucement les villosités de la surface luminale de l’intestin grêle. Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection pour couper le tissu en bandes de 1 à 2 centimètres de long. Et placez les bandelettes dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PBS glacé. Mélangez le contenu par inversion douce et laissez le contenu du tissu se déposer au fond du tube. Ensuite, aspirez le PBS et lavez les bandes trois fois de plus dans 10 millilitres de PBS frais, chaque fois de la même manière. À la fin du lavage final, placez le tube sur de la glace pendant dix minutes. Ensuite, remplacez le PBS par 25 millilitres de PBS complété par 2 millimolaires d’EDTA, dans un seau à glace sur une plate-forme à bascule pendant 45 minutes. À la fin de l’incubation, laissez les bandelettes de tissu se déposer au fond du tube et remplacez le PBS-EDTA par 10 millilitres de PBS complété par 10 % de FBS. Secouez vigoureusement le tube à la main dix fois. Ensuite, laissez le tissu se déposer au fond du tube et transférez le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté, Fraction 1.Agitez les tissus dans PBS FBS cinq fois de plus. Transfert du surnageant dans un nouveau tube de fraction à chaque fois. Après la dernière agitation, centrifugez tous les échantillons et remettez les granulés en suspension dans cinq millilitres de DMEM/F12 préchauffé sans facteurs de croissance ajoutés. Maintenant, faites tourner à nouveau les échantillons et aspirez quatre millilitres de surnageant de chaque tube. Remettez les granulés en suspension dans le dernier millilitre de milieu restant et utilisez des aliquotes de 20 microlitres de chaque fraction pour visualiser les cryptes et les débris sur des lames de verre. Après avoir regroupé les fractions appropriées pour obtenir le plus grand pourcentage de rapport crypte/débris, centrifugez les fractions regroupées et aspirez toutes les fractions sauf les 50 à 100 derniers microlitres des surnageants. En gardant les tubes sur de la glace, ajoutez 1 millilitre de matrice protéique aux fractions regroupées, en pipetant lentement de haut en bas pour éviter l’ajout de bulles d’air. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la matrice protéique/suspension de crypte au milieu de chaque puits de 37