L'isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

L'objectif général de cette méthode est d'isoler des exosomes à partir de bile humaine en vue d'analyses ultérieures, notamment le profilage des microARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies hépatiques, telles que la détection d'un marqueur biliaire spécifique pour les cholangiocarcinomes ou d'autres affections biliaires. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est robuste et reproductible.

Pour réaliser une cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique, ou CPRE, commencez par placer le patient en position supine. Après l'intubation et le passage d'un duodénoscope par la bouche du patient, insérez-le dans la deuxième portion du duodénum et identifiez la papille duodénale majeure. Canulez sélectivement le cholédoque en insérant un sphinctérotome à triple lumière préchargé avec un fil-guide hydrophile de 0,35 pouce ou de 0,9 millimètre.

Sous contrôle fluoroscopique, avancer le fil-guide jusqu'au canal hépatique gauche, puis introduire le sphinctérotome de cinq centimètres dans le canal biliaire afin d'obtenir une position stable. Après retrait du fil-guide, fixer une seringue de 10 millilitres au port du fil-guide par le verrou inférieur et appliquer une pression négative de 10 millilitres pour aspirer la bile. Retirer la seringue contenant la bile, puis, après réinsertion du fil-guide, injecter un agent de contraste par le port d'injection afin d'opacifier l'arbre biliaire.

Ensuite, transférez la bile recueillie dans un tube de 15 millilitres placé sur de la glace et, si vous devez la conserver pour une utilisation ultérieure, centrifugez l'échantillon à 500 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes avant de le congeler à −80 °C. Pour procéder immédiatement à l'isolement des exosomes, transférez 400 µL de bile dans un tube de microcentrifugation et centrifugez à 300 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes afin de recueillir les cellules et les débris cellulaires. Pour éliminer davantage les particules présentes dans le surnageant, transférez la solution dans des tubes de microcentrifugation neufs et centrifugez les échantillons à 16 500 ×g et à 4 °C pendant 20 minutes.

Ensuite, dans une cabine de sécurité biologique, recueillir le surnageant dans une seringue et le filtrer à l’aide d’un filtre membranaire en polyéthersulfone de 0,2 micromètre afin d’éliminer toute particule résiduelle de plus de 200 nanomètres. Transférer le surnageant filtré dans des tubes d’ultracentrifugation et utiliser du PBS pour compléter les tubes jusqu’à au moins deux tiers de leur capacité afin d’éviter qu’ils ne s’effondrent durant la centrifugation. Précipiter les exosomes par ultracentrifugation à 120 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant 70 minutes.

Un petit culot jaune contiendra les exosomes. Jeter le surnageant en le versant soigneusement et désinfecter les déchets en ajoutant de l'eau de Javel pour obtenir une concentration finale de 10 % volume par volume. Laisser agir ensuite pendant 20 minutes.

Pour les expériences ultérieures, traitez les culots dans un petit volume de solution appropriée ou remettez-les en suspension dans 50 à 100 microlitres de PBS et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Après avoir préparé les grilles de vésicules extracellulaires, ou EV, colorées au contraste selon le protocole décrit, acquérez des images avec un microscope électronique en utilisant une tension d'accélération de 80 kilovolts, en commençant par des grossissements de 20 000 X et en augmentant jusqu'à 100 000 X, lors de la détermination de la taille des particules. Les exosomes sont trop petits pour être détectés par microscopie classique ou cytométrie en flux ; toutefois, cette figure montre les résultats d'une analyse typique de suivi de nanoparticules, ou NTA, d'exosomes, qui mesure la concentration et la distribution de taille, avec une taille moyenne de 97 nanomètres dans cet échantillon de bile humaine isolé.

La microscopie électronique peut également être utilisée pour confirmer la taille des particules isolées dans la bile humaine, et cette image montre un résultat typique de microscopie électronique en transmission. Ces immunoblottings ont été analysés pour détecter des protéines enrichies dans les exosomes, telles que la tétraspanine CD63 et Tsg101. Ce tracé d'amplification en temps réel montre une variété d'espèces de microARN extraits d'exosomes de bile humaine.

Étant donné que les exosomes ne possèdent pas de normes fiables telles que l'ARN ribosomique 18S ou 28S ou des gènes ménagers, l'ajout d'un microARN synthétique est important pour la normalisation. La technique d'isolement des exosomes peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir et de traiter la bile provenant de patients ou d'animaux afin d'isoler et d'analyser les vésicules extracellulaires.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de centrifuger l'échantillon à 500 G et à quatre degrés avant de le congeler à moins 80, si vous ne pouvez pas procéder à l'ultracentrifugation. Après cette étape, d'autres méthodes, telles que des études sur les microARN, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les profils de microARN. N'oubliez pas que travailler avec de la bile peut être extrêmement dangereux, car elle pourrait contenir des agents responsables de l'hépatite, et des précautions telles que le port de gants et de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

Après son développement, la technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine du cholangiocarcinome afin d'explorer les vésicules extracellulaires comme biomarqueurs potentiels dans la bile de patients présentant des troubles biliaires, tels qu'une obstruction du PSA.