L'isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

L’objectif global de cette méthode est d’isoler les exosomes de la bile humaine pour des analyses plus approfondies, y compris le profilage des microARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies du foie, telles que la détection d’un marqueur biliaire particulier pour les cholangiocarcinomes ou d’autres maladies biliaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est robuste et reproductible.

Pour effectuer une cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique, ou CPRE, commencez par placer le patient en position couchée. Après avoir intubé et passé un duodénoscope dans la bouche du patient, insérez-le dans la deuxième partie du duodénum et identifiez la papille majeure. Canuler sélectivement le canal cholédoque en insérant un sphinctérotome à triple lumière préchargé avec un fil-guide hydrophile de 0,35 pouce ou de 0,9 millimètre.

Sous guidage fluoroscopique, avancez le fil-guide vers le canal hépatique gauche, puis avancez le sphinctérotome de cinq centimètres dans le canal biliaire pour acquérir une position stable. Après avoir retiré le fil-guide, fixez une seringue de 10 millimètres à l’orifice du fil-guide à travers le verrou inférieur et utilisez 10 millilitres de pression négative pour aspirer la bile. Retirez la seringue contenant la bile et, après avoir réinséré le fil-guide, injectez un produit de contraste par l’orifice d’injection pour opacifier l’arbre biliaire.

Ensuite, transférez la bile collectée dans un tube de 15 millilitres sur de la glace et, si vous le stockez pour plus tard, centrifugez l’échantillon à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avant de le congeler à moins 80 degrés Celsius. Pour procéder immédiatement à l’isolement des exosomes, transférez 400 microlitres de bile dans un tube de microcentrifugation et centrifugez à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour collecter les cellules et les débris cellulaires. Pour éliminer davantage le surnageant, transférez la solution dans des tubes de microcentrifugation frais et centrifugez les échantillons à 16 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, dans une enceinte de biosécurité, collectez le surnageant dans une seringue et filtrez-le à travers un filtre à membrane en polyéthersulfone de 0,2 micromètre pour éliminer toutes les particules restantes de plus de 200 nanomètres. Transférez le surnageant filtré dans des tubes d’ultracentrifugation et utilisez du PBS pour amener les tubes à au moins deux tiers pleins afin d’éviter que les tubes ne s’effondrent pendant la centrifugation. Granulez les exosomes par ultracentrifugation à 120 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 70 minutes.

Une petite pastille jaune contiendra les exosomes. Jetez le surnageant en le décantant soigneusement et désinfectez les déchets en ajoutant de l’eau de Javel à une concentration finale de 10 % volume par volume. Laissez ensuite reposer pendant 20 minutes.

Pour les expériences en aval, soit traiter les granulés dans un petit volume de solution appropriée, soit les remettre en suspension dans 50 à 100 microlitres de PBS et les stocker à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Après avoir préparé des grilles de vésicules extracellulaires colorées par contraste, ou EV, selon le protocole textuel, acquérez des images au microscope électronique en utilisant une tension d’accélération de 80 kilovolts commençant à des grossissements de 20 000 X et augmentant jusqu’à 100 000 X, lors de la détermination de la taille des particules. Les exosomes sont trop petits pour être détectés par la microscopie régulière ou la cytométrie en flux ; cependant, cette figure montre les résultats d’une analyse typique de suivi des nanoparticules, ou NTA, des exosomes qui mesurent la concentration et la distribution de la taille, qui était en moyenne de 97 nanomètres dans cet échantillon de bile humaine isolé.

La microscopie électronique peut également être utilisée pour confirmer la taille des particules isolées dans la bile humaine et cette figure montre un résultat EM de transmission typique. Ces transferts Western ont été sondés à la recherche de protéines enrichies en exosomes tels que la tétraspanine CD63 et Tsg101. Ce graphique d’amplification en temps réel montre une variété d’espèces de microARN extraites d’exosomes de bile humaine.

Étant donné que les exosomes ne disposent pas de normes fiables telles que l’ARN ribosomique 18S ou 28S ou les gènes de nettoyage, le dopage d’un microARN synthétique est important pour la normalisation. La technique d’isolement de l’exos peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir et de traiter la bile de patients ou d’animaux pour isoler et analyser les vésicules extracellulaires.

Lors de la rétractation de cette procédure, il est important de ne pas oublier de centrifuger l’échantillon à 500 G et quatre degrés avant de le congeler à moins 80, si vous ne pouvez pas procéder à l’ultracentrifugation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que des études de microARN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les profils de microARN. N’oubliez pas que travailler avec de la bile peut être extrêmement dangereux car il peut contenir de l’hépatite, et des précautions telles que le port de gants et de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de cette procédure.

Après son développement, la technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine du cholangiocarcinome pour explorer les vésicules extracellulaires comme biomarqueur potentiel dans la bile de patients souffrant de problèmes biliaires tels que l’obstruction du PSA.