Name: Expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Apprenez à purifier des particules pseudo-virales exprimées dans des systèmes de cellules mammifères ou d'insectes. Cette méthode simplifiée par ultracentrifugation facilite l'identification d'antigènes viraux pour le développement vaccinal.

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Nous tenons à remercier les membres antérieurs du laboratoire Ross qui ont permis d&#39;optimiser le protocole pour l&#39;efficacité et le rendement maximal.

1. Système d&#39;expression mammalien pour la génération de la grippe H3N2 VLP <ol><li> Le sous - clone viral structurel glycoprotéines hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA) et le virus de l&#39; immunodéficience humaine (VIH) , Gag p55 dans des vecteurs d&#39;expression eucaryotes, tels que décrits précédemment pTR600. 7 </li><li> Amplifier l&#39; ADN dans Escherichia coli chimiquement compétentes (par exemple, DH5a) et isoler le plasmide transfection de qualité en utilisant un kit de purification plasmidique selon les instructions du fabricant. Montant de l&#39;ADN dépend sur le rendement et les besoins des utilisateurs. </li><li> Maintenir une lignée cellulaire de mammifère, 293T, dans des milieux de croissance contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 ° C avec 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. </li><li> Cultiver des cellules telles que T-150 culture de tissus flacon contient 45-75 x 10 6 cellules par flacon de telle sorte que ballon obtient l&#39; adhérence des cellules complètes et 85-95% de confluence des cellules par le lendemain. Inspecter les cellules sous le microscope pour Conflu désiréence. Remarque: haute densité cellulaire est généralement recommandé pour obtenir une expression optimale de protéine avec une cytotoxicité minimale lors de l&#39;utilisation des réactifs de transfection commerciaux mais sur-confluence peut entraîner l&#39;accumulation de déchets cellulaires sous-produits et de réduire la viabilité cellulaire. </li><li> Le jour de la transfection, on prépare des liposomes et le mélange d&#39;ADN selon les recommandations du fabricant et transfecter des cellules d&#39;ADN avec une composition d&#39;ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag avec une quantité d&#39;ADN total de 40 pg par T-150 flacon. Des solutions diluées d&#39;ADN et de liposomes dans le milieu de transfection sans sérum, sans antibiotiques, de telle sorte que chaque flacon contient un volume total de 20-30 ml. Remarque: Ratio des constructions de gènes peut nécessiter l&#39;optimisation de l&#39;utilisateur. Bien que non montré ici, une procédure de transfection similaire a été réalisée avec le virus respiratoire syncytial (VRS) F et Gag du VIH dans un rapport de 1: 1. Pour DENV et CHIKV plasmides d&#39;expression unique, un total de 20 pg d&#39;ADN par T-150 flacon sont utilisés pour optimiser eXpression. ADN: transfection des rapports de réactif sont optimisés utilisateur. Utilisation recommandée milieu de transfection selon la méthode de transfection, à savoir, transfections lipidiques polycationiques recommandent la réduction ou l&#39; absence de sérum fœtal bovin ainsi les médias peuvent être complétées avec des hormones de croissance et d&#39; oligo - éléments pour soutenir la croissance en l&#39;absence de sérum. </li><li> Flacons revenir à 37 ° C avec 5% de CO 2 incubateur. Pour un volume de 200 ml, utiliser 9 T-150 flacons. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture de transfection jusqu&#39;au jour de la récolte de la VLP. </li><li> Récolte surnageant de culture de cellules après 72-96 heures après la transfection en fonction de l&#39;antigène, ou lorsque la viabilité cellulaire a diminué à 70-80%, selon les estimations de l&#39;inspection microscopique. Transférer le surnageant dans des tubes coniques de 50 ml et de faire tourner les cellules vers le bas à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires. Remarque: Le remplacement de 3 jour surnageant avec préchauffée, transfection du milieu frais sans sérum pour les cellules adhérentes se yielda second lot de VLP avec un rendement et similaire ou légèrement réduite doit être optimisée par l&#39;utilisateur. </li><li> Piscine surnageant et filtre à travers une membrane de 0,22 um des pores avant la sédimentation par ultracentrifugation. </li><li> Testez l&#39;activité d&#39;hémagglutination des VLP HA exprimant par hémagglutination norme 14 en utilisant 0,8% de dinde ou de globules rouges de mammifères ou de procéder à spécifique de l&#39; antigène ELISA. Voir Figure 2 pour des résultats représentatifs. </li></ol> 2. CHIK VLP Expression Utilisation du système cellulaire baculovirus / Insecte <ol><li> Générer baculovirus recombinants exprimant capside du virus du chikungunya et de protéines d&#39;enveloppe (C-E3-E2-6K-E1) de S-27 souche en utilisant un système d&#39;expression baculovirus commerciale. </li><li> Culture Spodoptera frugiperda cellules Sf9 dans du milieu de croissance Sf9 sans sérum avec 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 28 ° C. Utilisez 3-5 x 10 5 c / ml pour initier des cultures spinner flacon pour suspensla croissance cellulaire ionique. Passage régulièrement quand ils atteignent des densités de cellules de 2-4 x 10 6 c / ml (tous les 3-4 jours). </li><li> cellules Culture Sf9 en suspension dans des flacons spinner avec agitation à 130 rpm sur un système multipoint de plaque d&#39;agitateur. Pour une bonne aération, de maintenir des volumes de culture à pas plus de la moitié du volume de la fiole centrifuge. </li><li> Pour l&#39; expression de VLP CHIK, infecter des cellules Sf9 à une densité de 2 x 10 6 cellules / ml avec un baculovirus recombinant à une multiplicité d&#39;infection de 1 et retour à 28 ° C incubateur. Typiquement, infecter un ou deux flacons rotatifs, contenant 250 ml de cellules Sf9. Note: Bien que nous ne pas utiliser cette méthode, les cellules Sf9 peuvent être cultivées dans des flacons secoueurs à 28 ° C en utilisant une plate-forme de shaker. </li><li> Récolte des cultures après 72-96 heures après l&#39;infection, ou lorsque la viabilité des cellules a diminué de 70 à 80% tel que déterminé par exclusion au bleu Trypan selon le protocole du fabricant. Remarque: Les cellules continuent de proliférer tout en étant infecté et il y aa ~ 80% de viabilité dans les cultures Sf9 infectées par le baculovirus CHIK VLP recombinantes à 3 jours post-infection (dpi). les cellules infectées par un baculovirus sont plus grandes en apparence. Morphologie peut aussi changer de rond à oblong. Dans la fin des étapes de baculovirus infections, les cellules ont commencé à lyser. </li><li> cultures de transfert directement à partir de la culture en suspension dans 50 ml tubes coniques et tourner les cellules vers le bas à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir surnageants et filtrer à travers une membrane de 0,22 um des pores avant la sédimentation par ultracentrifugation. </li></ol> 3. Sédimentation / Purification de VLP / des SVP <ol><li> Stériliser 25 mm x 89 mm à toit ouvert tubes d&#39;ultracentrifugation avec de l&#39;éthanol à 70% dans la biosécurité capot. Vérifiez que l&#39;éthanol a séché avant de l&#39;utilisation. </li><li> Chargez jusqu&#39;à 32 ml de surnageant dans un tube propre. Un volume minimal de 25 ml est recommandée pour éviter l&#39;effondrement et l&#39;endommagement des tubes d&#39;ultracentrifugation insuffisamment remplis. </li><li> underlay soigneusement surnageants with stérile de 3 ml de glycerol à 20% dans du PBS (v / v). Assurez-vous que les tubes sont équilibrés. </li><li> Spin à 135.000 xg pendant 4 heures à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant, assurant la pastille ne se déloge pas de tube. </li><li> Remettre en suspension les VLP sédimenté au fond des tubes avec du PBS stérile par pipetage vigoureusement vers le haut et vers le bas. La quantité de PBS nécessaire pour remettre en suspension les VLP dépend de VLP rendement de protéines totales et des applications en aval. Typiquement, resuspendre chaque culot de VLP dans au moins 100 pi. </li><li> Conserver les échantillons à 4 ° C pour le stockage à court terme et -80 ° C de stockage pour le stockage à long terme. </li></ol> 4. Déterminer les rendements de protéines et rendements d&#39;antigènes spécifiques <ol><li> Déterminer la teneur en protéines totales en utilisant une méthode de quantification de protéine du commerce, tel que le dosage BCA selon le protocole du fabricant. </li><li> Pour évaluer le contenu spécifique de l&#39;antigène, effectuer de dosage immuno-enzymatique directe (ELISA) par enrobage des dilutions en série d&#39;antigène standard et 2-51; g de l&#39;échantillon de protéine totale à une plaque à 96 puits à fond plat ELISA. <ol><li> Suivez avec des anticorps spécifiques de l&#39;antigène pour sonder la présence des antigènes sur la plaque et utiliser des substrats de développement ELISA classiques pour produire absorbance détectable pour lecteur de microplaques. Voir la figure 2 pour obtenir des résultats représentatifs de HA et ELISA pour un échantillon VLP HA exprimant; de nombreuses combinaisons de HA et NA sont peut - être , mais les rendements peuvent différer de la compatibilité HA-NA 15. Note: les anticorps spécifiques de l&#39;antigène ont des affinités variables et il est recommandé que endpoint-titrage de dilution d&#39;anticorps déterminée avant d&#39;effectuer la quantification VLP. anticorps commerciaux auront concentration ou de dilution gammes suggérés pour une utilisation dans ELISA, ainsi que les protocoles proposés. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Nous avons utilisé les techniques décrites ci-dessus pour exprimer et purifier avec succès et les VLP composées des SVP de protéines structurales multiples pour différents agents pathogènes. En général, nous utilisons des systèmes d&#39;expression de mammifères pour générer nos VLP. Cependant, dans nos mains, de cellules de mammifères dérivé CHIK rendements VLP étaient faibles. rendement VLP CHIK était plus robuste lors de l&#39;utilisation Un système de cellules baculovirus-insecte recombinant. En général, baculovirus-...

Les particules virales (VLP) sont une technologie approuvée pour la vaccination humaine. En fait, certains des vaccins plus contemporarily sous licence, y compris le virus du papillome humain (VPH) et l&#39;hépatite Β (HepΒ) vaccins utilisent cette approche. Les VLP sont formées à partir des protéines structurales capables d&#39;auto-assemblage. Les particules assemblées imitent morphologies virales, mais ne peuvent pas infecter ou de reproduire parce qu&#39;ils manquent de génomes viraux. Les VLP peuvent être exprimés et purifiés à partir d&#39;un certain nombre de systèmes procaryotes et eucaryotes. Une revue de la littérature a révélé que différents systèmes d&#39;expression sont employés aux taux suivants: bactéries - 28%, de la levure - 20%, plante - 9%, insecte - 28%, et de mammifères - 15% 1. Il faut noter que les vaccins HPV à base de protéine de capside L1 sont produites dans la levure (Gardasil) ou dans un système de cellules d&#39;insecte (Cervarix) 2. Vaccins HepΒ, Recombivax et Engerix-Β, sont également produites dans la levure, et sont composés de HepΒ antigène de surface 3, 4. Nous utilisons des systèmes d&#39;expression de cellules d&#39;insectes et de mammifères pour produire des VLP nécessitant une co-expression de plusieurs protéines structurales pour l&#39;assemblage. Notre travail se concentre sur la conception, la production et les vaccins à base de VLP-purifiantes contre les agents pathogènes humains: virus de la grippe, le virus respiratoire syncytial (RSV), le virus de la dengue (DENV), et le virus du chikungunya (CHIKV). Nos méthodes sont suffisamment souples pour permettre la co-expression des protéines structurales multiples à partir de plusieurs plasmides d&#39;expression ou un plasmide d&#39;expression (figure 1). Auparavant, nous avons produit et purifié H5N1 VLP assemblé à partir de la co-expression de plasmides codant pour la grippe hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), et de la matrice (M1) dans des cellules de rein embryonnaire humain 293T 5,6. Les gènes ont été codons optimisés pour l&#39;expression dans des cellules de mammifères et clones dans pTR600, un vecteur d&#39;expression eucaryote contenant le cytomégalovirus promoteur immédiat-précoce, plus Intron A pour initier transcription d&#39;inserts eucaryotes et le signal de polyadénylation de l&#39; hormone de croissance bovine pour la terminaison de la transcription 7. Une approche similaire en utilisant la co-expression de trois plasmides de HA, NA (figure 1A) et une protéine de matrice du virus de remplacement, le VIH Gag p55, a été utilisé pour la production du sous - type de grippe humaine saisonnière H3N2 VLP dans cette étude et a été montré pour générer VLP de taille similaire à celle des particules de la grippe 8. Bien que les vaccins contre la grippe provoquent principalement des anticorps anti-HA, l&#39;addition de neuraminidase de la grippe médie l&#39; activité de la sialidase pour permettre le bourgeonnement des VLP à partir des cellules transfectées et 9 présentent également des cibles immunogènes supplémentaires. RSV pour produire des VLP, nous avons choisi le noyau non lié du VIH Gag pour concevoir des vaccins prototypes qui présentent des glycoprotéines de surface RSV exclusivement pour démontrer davantage la flexibilité de la formation de VLP en utilisant Gag du VIH, comme décrit précédemment et caractérisé par microscopie électronique à 6,10. Autresont précédemment montré que les VLP présentant glycoprotéines de RSV peuvent être assemblés en utilisant différents composants viraux du virus de la maladie de Newcastle (NDV) 11 et la matrice 12 de la grippe. Pleine longueur surface des séquences de glycoprotéine ont été utilisées dans cette étude pour conserver des conformations natives qui peuvent être nécessaires pour le récepteur fonctionnel de liaison et le dosage de reconnaissance d&#39;anticorps par dosage immuno-enzymatique (ELISA). Nos exemples d&#39;utilisation de systèmes d&#39;expression de plasmides individuels pour générer des particules sont MENV et CHIKV. Dans le cas de DENV, nous pouvons produire des particules sous - virales (de SSVP) sans capside dans des cellules 293T à partir d&#39; un seul plasmide contenant un prM / E gène de structure cassette d&#39; expression 13. Le terme SVP est utilisé pour désigner l&#39;absence d&#39;une protéine de noyau ou capside dans l&#39;assemblage des protéines structurales virales. CHIK VLP peut également être produite en utilisant un seul plasmide contenant une cassette CHIKV gène de structure codant pour les protéines de capside et d&#39;enveloppe, ou insect cellules par infection avec un baculovirus recombinant codant pour la même cassette de gène structural optimisé pour l&#39; expression de cellules d&#39; insecte (figure 1B - C). Le résultat de l&#39;expression approches discutées ci-dessus final est la libération de VLP dans le milieu de culture cellulaire qui peut ensuite être purifié par une ultracentrifugation à travers un coussin de glycerol à 20%. Dans ce rapport, nous présentons les méthodes pour exprimer et purifier ces VLP à partir de systèmes cellulaires de mammifères et d&#39;insectes.

<table><tbody><tr><td>Plasmide Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 plaque d’agitation multipoint</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td> Tubes d’ultracentrifugation <td></td></tr><tr><td>Polyclear</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Confirmer les tubes appropriés pour l’ultracentrifugeuse et la taille du godet</td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de dosage des protéines</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de citrate de phosphate</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-phénylènediamine dichlorhydrate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu ; m Filtre à vide (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Les particules virales (VLP) et des particules sous-virales (de SSVP) sont une approche alternative à la conception de vaccins viraux qui offre les avantages de l&#39;augmentation de la biosécurité et de la stabilité sur l&#39;utilisation d&#39;agents pathogènes vivants. Non-infectieuses et auto-assemblage, les VLP sont utilisés pour présenter les protéines structurales comme immunogènes, en contournant la nécessité d&#39;agents pathogènes vivants ou des vecteurs viraux recombinants pour la livraison de l&#39;antigène. Dans cet article, nous démontrons les différentes étapes de la conception et le développement VLP pour des applications futures dans l&#39;expérimentation animale préclinique. La procédure comprend les étapes suivantes: la sélection de l&#39;antigène, l&#39;expression de l&#39;antigène dans la lignée cellulaire de choix, la purification des VLP / des SVP, et la quantification de l&#39;antigène dosage. Nous démontrons l&#39;utilisation des deux lignées cellulaires de mammifères et d&#39;insectes pour l&#39;expression de nos antigènes et de démontrer comment les méthodologies diffèrent du rendement. La méthodologie présentée peut demander à une variété d&#39;agents pathogènes et peut être obtenue en substituant les antigènes avec str immunogèneuctural protéines de la micro-organisme de l&#39;utilisateur d&#39;intérêt. VLP et aider avec l&#39;antigène des SVP caractérisation et sélection des meilleurs candidats vaccins.

les rendements des VLP étaient variables par virale conception antigène construction. Dans ce protocole, nous avons démontré l&#39;utilisation de cellules insectes et de mammifères pour la production de VLP UDC ou dans le surnageant et la purification par ultracentrifugation. Quatre sous - types de DENV prM / E gène structurel des cassettes d&#39;expression ont été utilisés pour construire les versions de DENV (délimitées comme des SVP 1-4) dans le tableau 1 et démontrer...

Ici, nous présentons un protocole pour la synthèse de particules de type viral en utilisant soit baculovirus ou systèmes d&#39;expression de mammifères, et la purification de l&#39;ultracentrifugation. Cette approche hautement personnalisable est utilisée pour identifier des antigènes viraux comme cibles de vaccins d&#39;une manière sûre et flexible.

Expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

L'objectif général de cette procédure est de purifier des particules de type viral, ou VLP, exprimées et sécrétées par des systèmes d'expression à base de cellules de mammifères ou d'insectes. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la vaccinologie, telles que la manière d'exprimer et de purifier des antigènes viraux conformellement pertinents de façon sûre et souple. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite ni la précipitation des protéines à l'aide de polyéthylène glycol ni la préparation de plusieurs couches de densité pour concentrer les VLP.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'identification d'antigènes viraux comme cibles vaccinales, les particules pseudovirales (VLP) peuvent également être utilisées comme outils pour le diagnostic des maladies et la sérologie. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'utilisation d'une couche intermédiaire de glycérol lors des étapes de resuspension des VLP est difficile à maîtriser, les débutants pouvant ne pas appliquer la technique adéquate. Le jour de la transfection, préparez les solutions de liposomes et d'ADN selon les recommandations du fabricant.Transfecter les cellules ADN avec une composition d'ADN en rapport de un à un à deux de HA à NA à Gag, et une quantité totale d'ADN de 40 microgrammes par flacon T150. Répéter cette étape afin de préparer neuf flacons T150, pour un volume total de 200 millilitres. Ensuite, diluer les solutions d'ADN et de liposomes dans un milieu de transfection sans sérum et sans antibiotiques, de sorte que chaque flacon contienne un volume total de 24 millilitres.Replacer les flacons dans l'incubateur et maintenir les cellules dans le milieu de culture de transfection jusqu'au jour de la récolte de particules pseudo-virales, ou VLP. Transférer le surnageant dans des tubes coniques de 50 millilitres pour récolter la culture après les cellules, 72 à 96 heures après la transfection. Centrifuger les cellules afin de former un culot contenant les débris cellulaires.Recueillir les surnageants et les filtrer à travers une membrane d'écoulement de 0,22 micron. Cultiver les cellules de *Spodoptera frugiperda*, ou cellules Sf9, préparées au préalable, en suspension dans des flacons agitateurs, en agitant continuellement à 130 tr/min sur un système de plaque agitatrice multipoint. Maintenir les volumes de culture à pas plus de la moitié du volume du flacon agitateur pour une aération adéquate.Ensuite, exprimez les VLP de CHIK en infectant 250 millilitres de cellules Sf9 dans un flacon agité à une densité de deux fois dix puissance six cellules par millilitre avec un baculovirus recombinant préparé au préalable, puis remettez les cellules dans un incubateur à 28 °C. Utilisez l'exclusion au bleu de trypan pour déterminer si la viabilité cellulaire a diminué à 70-80 %. Une fois cela confirmé, transférez les cultures directement en suspension dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez les cellules. Récupérez les surnageants et filtrez-les à travers une membrane de 0,22 µm avant la sédimentation.Stérilisez six tubes d'ultracentrifugation ouverts de 25 millimètres sur 89 millimètres avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, assurez-vous que l'éthanol est complètement évaporé. Chargez 32 millilitres de surnageants dans les tubes propres.Ensuite, superposez soigneusement les surnageants avec trois millilitres de solution stérile de glycérol 20 % dans le PBS. Effectuez la superposition du glycérol lentement afin d'éviter toute perturbation de la fine couche de densité située entre le glycérol et la solution de particules pseudovirales (VLP). Un ajout trop rapide du glycérol entraînerait un mélange entre les solutions de glycérol et de VLP, réduisant ainsi la sédimentation des VLP.Veillez à équilibrer les tubes, puis démarrez la centrifugation. Après quatre heures, retirez les tubes de la centrifugeuse. Aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas déloger le culot du tube.Resuspendre les VLP sédimentés dans au moins 100 microlitres au fond des tubes avec du PBS stérile en pipetant doucement et lentement de haut en bas. La resuspension du culot de VLP doit être effectuée par des aspirations et des expulsions répétées douces et lentes de PBS à l’aide d’une pipette. Éviter la formation de bulles afin de limiter la perte de VLP.Enfin, conserver les VLP resuspendus. Les volumes de VLP et les rendements totaux en protéines obtenus à partir d'un dosage BCA conventionnel ont été déterminés à partir d'une variété de constructions de SVP et de VLP. Les rendements de SVP CHIK à partir de cellules Sf9 varient entre 0,008 et 0,016 milligrammes de protéine totale par millilitre de volume de surnageant.Alors que la production par des cellules mammaires 293 T entraîne une réduction dix fois moindre du niveau de protéine. Cette image de microscopie électronique montre que les particules pseudovirales (VLP) de la grippe contenant le noyau HA Gag sont correctement exprimées, assemblées et purifiées sous forme de VLP. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de transfecter et d'infecter uniquement des cultures cellulaires saines et viables, car cela influencera les niveaux globaux d'expression protéique.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que le dosage BCA, les tests ELISA et Hémagglutination peuvent être réalisés afin de mesurer la teneur totale en protéines, la teneur en antigène spécifique et l'expression de l'hémagglutinine fonctionnelle. N'oubliez pas que le travail avec un ultracentrifugeuse peut être dangereux et que des précautions telles que l'équilibrage des tubes, l'utilisation exclusive des rotors et vitesses recommandés, ainsi qu'une surveillance adéquate du personnel nouveau en laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Cette vidéo montre la génération de particules pseudo-virales de la grippe (VLP) dans un système de mammifères. Lors de l’expression de trois vecteurs d’expression eucaryotes – codant pour différentes protéines structurelles virales – dans des cellules hôtes de mammifères appropriées, les protéines virales exprimées s’auto-assemblent en VLP sur la membrane plasmique de l’hôte et se libèrent par bourgeonnement à partir de la surface cellulaire.

Technique de génération de particules semblables à un virus de la grippe par l’intermédiaire d’un système de mammifère

Cette vidéo montre comment des particules pseudo-virales, les VLP sont générées en infectant des cellules d’insectes avec un baculovirus recombinant portant la cassette de gènes du virus chikungunya. Le virus recombinant infecte les cellules, entraînant la formation, l’assemblage et la libération de VLP dans le milieu de culture pour une utilisation potentielle dans la production de vaccins.

Génération de particules semblables au virus Chikungunya à l’aide d’un système d’expression de baculovirus dans des cellules d’insectes

Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Ici, nous présentons un protocole pour générer un type bivalent adénovirus 5 (Ad5) vecteur preuve-de-principe Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 en utilisant la stratégie Antigène capside-Incorporation. Ce vecteur a été démontrée à exposer remise en forme qualitative, la capacité d'échapper sérums Ad5 positif in vitro, et l'antigénicité ainsi que l'immunogénicité des antigènes incorporés.

Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d&#39;approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

virus de la vaccine (VV) a été largement utilisé dans la recherche biomédicale et l'amélioration de la santé humaine. Cet article décrit une méthode simple, très efficace pour modifier le génome de VV en utilisant un système CRISPR-cas9.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

Une méthode détaillée est fournie ici décrivant la purification, le repliement et la caractérisation des nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) pour le développement de vaccins.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

Ici, un protocole simple est présenté pour produire des nanoparticules d’ARNm à base de polymères poly(bêta aminoesster), faciles à adapter en changeant l’ARNm encapsulé. Le flux de travail de synthèse des polymères, des nanoparticules et de leur caractérisation essentielle in vitro est également décrit. Une preuve de concept concernant la vaccination est également ajoutée.

Synthèse et caractérisation de nanoparticules poly(bêta-aminoesters) chargées d’ARNm à des fins de vaccination

Nous présentons ici un protocole pour détecter les épitopes de neutralisation sur les particules virales (VLP) présentant des antigènes. L’immunoprécipitation des VLP dérivés du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est réalisée à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques aux glycoprotéines d’enveloppe couplés à des billes magnétiques conjuguées à la protéine G. Les VLP capturés sont ensuite soumis à une analyse SDS-PAGE et Western blot utilisant des anticorps spécifiques de la protéine de...

Détection d’épitopes sensibles à la neutralisation dans les antigènes affichés sur les vaccins à base de particules virales (VLP) à l’aide d’un test de capture

Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

Apprenez à purifier des particules pseudo-virales exprimées dans des systèmes de cellules mammifères ou d'insectes. Cette méthode simplifiée par ultracentrifugation facilite l'identification d'antigènes viraux pour le développement vaccinal.

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