Une étape négative de purification chromatographique

L'objectif général de cette purification est d'obtenir une protéine fonctionnelle de type neutrophile-activante de Helicobacter pylori, ou HP-NAP, sous sa forme native, avec une forte pureté et un rendement élevé, en utilisant une chromatographie par lots en mode négatif avec une résine échangeuse d'ions diéthylaminoéthyle. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'HP-NAP peut être purifiée sous sa forme native en une seule étape, avec une pureté et un rendement élevés. La purification négative de l'HP-NAP commence par une procédure de fixation par lots, au cours de laquelle la fraction protéique soluble provenant des lysats bactériens est ajoutée à la résine DEAE.

Le mélange est incubé afin de permettre aux protéines totales de se lier à la résine. L'HP-NAP présente dans la fraction non liée est ensuite récupérée par centrifugation ou par écoulement gravitationnel. Les implications de cette technique sont une prévention, un traitement et un pronostic des maladies associées à Helicobacter pylori, ainsi qu'une thérapie anticancéreuse, dans un rapport de 10:1.

En raison des propriétés immunogènes et immunomodulatrices de HP-NAP. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés. Parce que HP-NAP s'agrège facilement lors de la stérilisation.

La procédure sera démontrée par Zhi-Wei Hong, un étudiant diplômé de notre laboratoire. En travaillant à quatre degrés Celsius, nous suspendons 50 millilitres du culot cellulaire préparé comme décrit dans le protocole écrit dans 20 millilitres de tampon tris à faible teneur en sel, à un pH de 9,0, contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases. Il est essentiel de maintenir l'échantillon à quatre degrés Celsius afin de permettre à la procédure d'empêcher l'agrégation des protéines.

Disrupter les cellules bactériennes en faisant passer la suspension bactérienne dans un homogénéisateur à haute pression fonctionnant à une pression comprise entre 15 000 et 20 000 PSI, pendant sept passages à quatre degrés Celsius. Après la lyse bactérienne, la solution doit être centrifugée immédiatement. Transférer les échantillons homogénéisés dans un tube de centrifugation.

Centrifuger immédiatement le lysat cellulaire à 30 000 × g à quatre degrés Celsius pendant une heure pour séparer les fractions protéiques solubles et insolubles à l'aide d'une ultracentrifugeuse. Après la centrifugation, transférer le surnageant, correspondant à la fraction protéique soluble, dans un bécher. Mesurer la concentration en protéines de la fraction protéique soluble par la méthode de Bradford en utilisant un kit commercial avec l'albumine sérique bovine comme standard, conformément aux instructions du fabricant.

Ensuite, ajouter 177,6 microlitres d'acide chlorhydrique 1 N à 20 millilitres de la fraction protéique soluble afin d'ajuster son pH de 9,0 à 8,0. Ajouter du Tris-HCl 20 millimolaire, pH 8,0, et 50 millilitres de chlorure de sodium à la solution protéique pour obtenir une concentration finale en protéines de 0,5 milligramme par millilitre. Pour préparer 15 millilitres de résine DEAE, suspendre 0,6 gramme de poudre sèche de résine DEAE dans 30 millilitres de tampon Tris-HCl à température ambiante pendant au moins un jour.

Centrifuger la résine à 10 000 × g à quatre degrés Celsius pendant une minute, puis retirer et jeter le surnageant. Ajouter ensuite 15 millilitres de tampon Tris-HCl. Après avoir répété les étapes de centrifugation et de resuspension quatre fois supplémentaires, conserver les 15 millilitres de résine sédimentée à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

À quatre degrés Celsius, ajoutez 45 millilitres des protéines solubles préparées à des millilitres de la résine et transférez le mélange dans un bécher de 100 millilitres muni d’un barreau aimanté. Agitez la suspension de protéines-résine à l’aide d’un agitateur magnétique à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, versez la suspension de protéines-résine dans une colonne en plastique ou en verre équipée d’un robinet et laissez la résine se tasser par gravité.

Ouvrir le robinet pour laisser la solution protéique s'écouler à travers la colonne par gravité, jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement comme la fraction non liée, qui contient la protéine activant les neutrophiles purifiée. Ajouter 15 millilitres du tampon Tris-HCl glacé dans la colonne.

Ouvrir à nouveau le robinet pour permettre au tampon de lavage de traverser la colonne par écoulement gravitationnel jusqu'à ce que le niveau du liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement comme fraction de lavage. Répéter le lavage avec le tampon glacé quatre fois supplémentaires pour recueillir les fractions de lavage additionnelles.

Ensuite, ajoutez 15 millilitres de Tris-HCl à 20 millimolar, pH 8,0, à 1 molaire en chlorure de sodium, glacé, dans la colonne. Récupérez le liquide qui s'écoule comme les fractions d'élution, comme précédemment. Répétez les étapes d'élution quatre fois supplémentaires pour recueillir des fractions d'élution additionnelles.

L'effet du pH sur la solubilité de HP-NAP dans un lysat d'E.coli est illustré ici. La quantité de HP-NAP détectée dans cette fraction soluble a fortement augmenté entre pH 7,5 et 9,5. La protéine recombinante HP-NAP a été presque entièrement récupérée dans la fraction soluble après lyse cellulaire à pH 9,0.

Ici, l'effet du pH sur la purification négative de l'HP-NAP recombinant exprimé dans E.coli à l'aide de résines DEAE en mode discontinu est présenté. À un pH de 8,0, seulement une petite quantité d'HP-NAP était présente dans la fraction éluée. La quantité d'HP-NAP présente dans les fractions non liées était maximale à pH 8,0.

La quantité optimisée de protéines chargée sur la résine DEAE est de 1,5 milligramme de protéine par millilitre de résine afin d'atteindre la capacité maximale de la résine pour absorber les impuretés provenant d'E.coli. À un pH de 8,0, très peu de protéines autres que HP-NAP sous sa forme native sont récupérées dans la fraction non liée en utilisant des résines DEAE en mode discontinu. La pureté de HP-NAP était supérieure à 95 pour cent.

HP-NAP purifié se replie en un multimère présentant une structure secondaire en hélice alpha, comme le révèlent le chromatogramme de filtration sur gel et le spectre de dichroïsme circulaire dans l'ultraviolet lointain. Un dosage chimiluminescent dépendant du lumen révèle que HP-NAP purifié est capable de déclencher la production d'espèces réactives de l'oxygène par les neutrophiles. Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en moins de cinq heures si elles sont effectuées correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la purification de la HP-NAP fonctionnelle sous sa forme native, avec un rendement et une pureté élevés, en utilisant une chromatographie par lots en mode négatif avec une résine échangeuse d'anions DEAE. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des tampons au pH approprié lors de l'étape de stérilisation dans la chromatographie par lots. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons essayé d'appliquer d'autres approches chromatographiques à la place de la filtration pour purifier la HP-NAP sous sa forme native.

Bien que cette méthode soit conçue pour s'appliquer à la HP-NAP recombinante exprimée dans E.coli, elle peut également être utilisée avec d'autres systèmes d'expression bactérienne, tels que per-sida sep-tidas. La démonstration visuelle de cette mesure est un code rapide.

De plus, les étapes de stérilisation et de chromatographie par lots sont difficiles à maîtriser, car elles doivent être réalisées à quatre degrés Celsius sans aucun retard. Si une protéine destinée à la purification convient à notre chromatographie d'échange en mode négatif, cette procédure pourrait également servir de point de départ pour l'élaboration d'un processus de purification.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche clinique pour explorer la possibilité d'utiliser la HP-NAP dans le traitement du cancer ainsi que dans le développement de vaccins, de médicaments et de diagnostics pour les maladies associées à Helicobacter pylori.