Name: Une étape négative de purification chromatographique Helicobacter pylori Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans Escherichia coli En mode batch (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez la purification négative de la protéine HP-NAP d'Helicobacter pylori par chromatographie en mode batch avec résine DEAE. Cette méthode efficace en une étape permet d'obtenir une haute pureté pour le développement de vaccins et de diagnostics.

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Nous remercions le Dr Chao-Sheng Cheng de l’Université nationale Tsing Hua, à Taïwan, d’avoir effectué la mesure du dichroïsme circulaire. Nous remercions également les Drs Evanthia Galanis et Ianko D. Iankov de la Mayo Clinic, aux États-Unis, pour avoir fourni l’anticorps monoclonal anti-HP-NAP. Nous remercions les Drs Han-Wen Chang et Chung-Chu Chen, de l’Hôpital Mackay Memorial, Hsinchu, Taïwan, pour avoir fourni des conseils sur la demande d’IRB, M. Te-Lung Tsai de l’Hôpital Mackay Memorial, Hsinchu, Taïwan, pour avoir supervisé l’analyse des neutrophiles isolés, et Mme Ju-Chen Weng de l’Université nationale Tsing Hua, Taïwan, pour son assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 et NSC98-2311-B-007-006-MY3), du programme de recherche conjoint de l’Université nationale Tsing Hua et de l’hôpital Mackay Memorial (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), et du programme de recherche de l’Université nationale Tsing Hua (104N2052E1).

Le sang humain a été recueilli chez des volontaires sains avec le consentement écrit préalable éclairé et l&#39;approbation du Conseil institutionnel d&#39;examen de la National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan. 1. Expression du recombinant HP-NAP dans E. coli <ol><li> Préparer le plasmide pET42a-PNA contenant la séquence d&#39;ADN de la HP-NAP de H. pylori 26695 souche comme décrit précédemment 16. Préparer les plasmides contenant la séquence d&#39;ADN de la HP-NAP avec les mutations ponctuelles souhaitées telles que décrites (voir protocole, étape 8). </li><li> Transformer 10 ng des plasmides d&#39;ADN ci - dessus dans E. coli BL21 (DE3) des cellules compétentes par choc thermique pendant 45 secondes à 42 ° C, strie les cellules sur le bouillon de lysogénie (LB) des plaques de gélose contenant 50 pg / ml de kanamycine, et incuber les plaques à 37 ° C pendant 16 heures. </li><li> Inoculer des colonies isolées dans des tubes individuels contenant 5 ml de bouillon LB avec 50 ug / ml de kanamycine et de croître comme des précultures à 37 ° C pendant 16 heures avec agitation à 170 tours par minute. </li><li> Inoculer 2 ml des cellules pré-culture ci-dessus dans 200 ml de bouillon LB contenant 50 pg / ml de kanamycine dans un flacon de 1 litre. Incuber le flacon de culture inoculé à 37 ° C pendant 2 heures sous agitation à 170 tours par minute jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance à 600 nm atteint environ 0,4 à 0,5 détectée par un spectrophotomètre UV / VIS. </li><li> Ajouter 80 ul de 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) à la culture ci-dessus à une concentration finale de 0,4 mM pour induire l&#39;expression de la HP-NAP. Incuber la culture pendant 3 heures jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance à 600 nm atteint environ 1/6 à 1/7. </li><li> Centrifuger les cellules à 6000 x g à 4 ° C pendant 15 min pour éliminer le surnageant. Stocker le culot cellulaire à -70 ° C jusqu&#39;à la purification. </li></ol> 2. Préparation de la protéine de la fraction soluble contenant de HP-NAP Remarque: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 ° C. <ol><li> Remettre en suspension 50 ml de la cellule pEllet préparé dans le protocole étape 1.6 dans 20 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 9,0, NaCl 50 mM contenant 0,13 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,03 mM de N-alpha-tosyl-L-lysinyle-chlorométhylcétone (TLCK) et 0,03 mM de N-tosyl-L-phénylalaninyle-chlorométhylcétone (TPCK) à 4 ° C comme décrit précédemment 16. </li><li> Rompre les cellules bactériennes en faisant passer la suspension bactérienne à travers un homogénéiseur à haute pression fonctionnant à une gamme de 15 000 à 20 000 psi pendant 7 heures à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le lysat cellulaire à 30 000 x g à 4 ° C pendant 1 heure pour séparer les fractions de protéines solubles et insolubles à l&#39;aide d&#39;une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant comme la fraction protéique soluble dans un bêcher. </li><li> Mesurer la concentration en protéine de la fraction de protéine soluble par la méthode de Bradford en utilisant un kit commercial avec de l&#39;albumine de sérum bovin (BSA) comme étalon, selon les instructions du fabricant. </li><li> Ajouter 177,6 ul de HCl 1 N dans 20 ml d&#39;ee soluble dans la fraction protéique obtenue à partir de l&#39;étape 2.3 Protocole pour ajuster sa valeur de pH allant de pH 9,0 à pH 8,0. </li><li> Ajouter 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la solution de protéine ci-dessus pour obtenir une concentration finale en protéine soit 0,5 mg / ml. </li></ol> 3. La purification du recombinant HP-NAP à partir de E. coli par Chromatographie négative mode batch avec DEAE résines échangeuses d&#39; ions <ol><li> Préparer 15 ml de résines DEAE. <ol><li> Peser 0,6 g de poudre sèche de résine DEAE et de le suspendre dans 30 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la température ambiante pendant au moins 1 jour. </li><li> Centrifuger la résine à 10.000 x g à 4 ° C pendant 1 min. </li><li> Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 15 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM. </li><li> Répéter les étapes 3.1.2 Protocole à 3.1.4 quatre fois plus. </li><li> Stocker les 15 ml réglées résine (50% suspension dans 30 ml de tampon Tris) à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Note: Toutes les étapes suivantess sont effectuées à 4 ° C. </li></ol></li><li> Ajouter 45 ml de protéines solubles préparés dans l&#39;étape Protocole de 2,6 à 15 ml de la résine et on agite la suspension de protéine / résine avec un agitateur magnétique à 4 ° C pendant 1 h. </li><li> Verser la suspension de protéines / résine dans une colonne en matière plastique ou en verre muni d&#39;un robinet d&#39;arrêt. Laisser la résine régler par gravité. </li><li> Ouvrir le robinet d&#39;arrêt pour permettre à la solution de protéine à courir à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu&#39;à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l&#39;écoulement de la fraction non liée, qui contient le HP-NAP purifiée. </li><li> Ajouter 15 ml d&#39;glacé 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM dans la colonne. </li><li> Ouvrir le robinet d&#39;arrêt pour permettre au tampon de lavage pour fonctionner à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu&#39;à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l&#39;écoulement comme la fraction de lavage. </li><li> Répéter les étapes Protocole 3.5 à 3.6 quatre fois plus pour recueillir les fractions de lavage supplémentaires. </li><li> Ajouter 15 ml d&#39;glacé 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 M de NaCl dans une colonne. </li><li> Ouvrir le robinet d&#39;arrêt pour permettre au tampon d&#39;élution à courir à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu&#39;à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l&#39;écoulement de la fraction d&#39;élution. </li><li> Répéter les étapes protocole de 3,8 à 3,9 quatre fois plus pour recueillir les fractions d&#39;élution supplémentaires. </li></ol> 4. Buffer Exchange et endotoxines Suppression de HP-NAP Purifié par Chromatographie négative mode batch avec DEAE Résines Remarque: Le HP-NAP purifiée exprimé dans E. coli doit être soumis à un échange de tampon et l&#39; élimination d&#39;endotoxine avant de stimuler neutrophiles. <ol><li> Effectuer une dialyse pour changer le tampon du HP-NAP purifiée pour tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, à 4 ° C en utilisant un tube de dialyse à coupure de poids moléculaire de 14 kDa tel que décrit précédemment 24. </li><li> Filtrer le HP-NAP dialysée à travers une seringueFiltre électronique avec une charge positive, d&#39;une membrane hydrophile fixée à une seringue jetable de 20 ml à des débits allant de 2,5 à 4 ml / minute à 4 ° C pour éliminer l&#39;endotoxine. </li></ol> 5. Caractérisation des propriétés moléculaires de la recombinante purifiée HP-NAP par dodécylsulfate de sodium-gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), Western blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatographie et dichroïsme circulaire Spectroscopy <ol><li> Analyser le HP-NAP recombinante purifiée par SDS-PAGE et transfert de Western avec des surnageants de culture d&#39;hybridomes contenant un anticorps monoclonal de souris MAb 25 16F4 24 comme décrit précédemment. </li><li> Analyser le HP-NAP a été purifié par PAGE natif et la Chromatographie par filtration sur gel pour examiner son état ​​oligomère tel que décrit précédemment 26. </li><li> Analyser le HP-NAP recombinante purifiée par spectroscopie de dichroïsme circulaire pour examiner sa structure secondaire comme décrit précédemment 26. </li></ol> 6. Evaluation de la pureté de la HP-NAP par coloration à l&#39;argent d&#39;un gel SDS-PAGE <ol><li> Préparer la solution de fixation, solution, solution d&#39;argent, solution de développement sensibilisation, la solution d&#39;arrêt, et une solution de lavage selon les instructions d&#39;un kit de coloration à l&#39;argent du fabricant. </li><li> Effectuer coloration à l&#39;argent d&#39;un gel SDS-PAGE selon les instructions d&#39;un kit de coloration à l&#39;argent du fabricant. </li><li> Acquérir l&#39;image du gel avec un système d&#39;imagerie. </li></ol> 7. Mesure de la production d&#39;ERO induite par les neutrophiles par HP-NAP <ol><li> Isoler neutrophiles humains à partir de sang hépariné humain par sédimentation dextran suivi par gradient de densité centrifugation comme décrit précédemment 24. </li><li> Mesure de la production de radicaux libres à partir de neutrophiles stimulés avec HP-NAP à l&#39;aide d&#39;un dosage de chimioluminescence luminol-dépendante. <ol><li> Tourner sur un lecteur de plaque et régler la température à 37 ° C. Placer unevide fond plat plaque de 96 puits blanche à l&#39;intérieur de la chambre de lecteur de plaque, ce qui lui permet de se réchauffer à 37 ° C. </li><li> Préparer les mélanges de stimulation dans le D-PBS, pH 7,2, contenant 0,9 mM de CaCl2, 0,5 mM de MgCl2 et 13,3 pM de 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione (luminol) avec la présence et l&#39; absence de 0,67 uM endotoxine retirée HP-NAP préparé à partir de l&#39;étape 4.2 Protocole. </li><li> Ajuster la concentration en neutrophiles humains préparés à partir de protocole étape 7.1 à 2 x 10 6 cellules / ml dans du D-PBS, pH 7,2, contenant 5 mM de glucose. </li><li> Ajouter 50 pl de neutrophiles suspension dans chaque puits de la plaque de 96 puits tout. </li><li> Ajouter 150 pi des mélanges de relance préparés à partir de protocole étape 7.2.2 dans les neutrophiles et contenant à un intervalle de temps de 5 secondes par puits. </li><li> Mesurer l&#39;émission de la chimioluminescence pendant 5 secondes par puits sur une période de trois heures en utilisant un lecteur de plaque. </li></ol></li></ol> 8.Construction d&#39;ADN Plasmides hébergeant HP-NAP Mutants par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à base de mutagenèse directe Remarque: la mutagénèse site direct à base de PCR a été généré essentiellement 27 comme décrit précédemment , sauf que les sites de restriction &quot;silencieuses&quot; ont été introduits dans les amorces de mutagenèse par une mutagenèse dirigée (SDM) logiciel -aider 28. <ol><li> Effectuer la réaction PCR. <ol><li> Ajouter 10 ng du plasmide pET42a-PNA, 1 uM de mutagénèse paires d&#39;amorces énumérées dans le tableau 1, 200 uM de désoxynucléosides triphosphates (dNTP), et 3 unités de haute fidélité par PCR mélange d&#39; enzymes dans un tube PCR contenant de l&#39; eau déminéralisée, ce qui donne une finale volume de 25 ul. </li><li> Initier les cycles de PCR à 95 ° C pendant 10 minutes pour dénaturer l&#39;ADN matrice, et suivre avec 12 cycles d&#39;amplification à 95 ° C pendant 1 minute, T m pas -5 ° C pendant 1 minute, et 72 ° C pendant 6 min. </li><li> Terminer les cycles de PCR avecune étape de recuit à T m p -5 ° C pendant 1 minute et une étape d&#39;extension à 72 ° C pendant 30 min. </li></ol></li><li> Traiter 15 ul du produit de PCR avec 0,4 ul d&#39;Dpn I enzyme de restriction à 37 ° C pendant 2 heures, puis on analyse 2 ul du produit de PCR Dpn I traité par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. </li><li> mutants d&#39;écran. <ol><li> Transformer 2 ul du produit de PCR dans E. coli DH5a cellules compétentes par choc thermique pendant 45 sec à 42 ° C. </li><li> Répartir les cellules transformées sur une plaque LB contenant 50 pg / ml de kanamycine et incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures. </li><li> Isoler l&#39;ADN de plasmide à partir des colonies bactériennes en utilisant un kit commercial de la lyse alcaline selon le protocole du fabricant. </li><li> Traiter l&#39;ADN de plasmide isolé dans l&#39;étape 8.3.3 Protocole avec l&#39;enzyme de restriction Xhol pour vérifier la présence des mutations silencieuses souhaitées selon le protocole du fabricant. </li><li> séquence dul&#39;ADN plasmidique a vérifié par l&#39;étape 8.3.4 Protocole avec l&#39;amorce promoteur T7 pour confirmer la correction des séquences codantes des mutants HP-NAP selon le protocole du fabricant. </li></ol></li></ol>

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<li>Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+attenuated+measles+virus+engineered+to+express+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).</li>
<li>Shih, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786(2013).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
</ol>

HWF et YCY sont les inventeurs des brevets TW I 432579 et US 8,673,312 pour la méthode de purification en une étape de la protéine activatrice des neutrophiles d’Helicobacter pylori . Tous les documents décrits dans le manuscrit seront disponibles à des fins de recherche. Les auteurs confirment que cela ne modifie pas leur adhésion à toutes les politiques de JoVE sur le partage des données et du matériel.

La Chromatographie discontinue en mode négatif par DEAE résines échangeuses d&#39; anions présenté ici est approprié pour la purification de HP-NAP recombinante surexprimée dans E. coli. Les valeurs de pH des tampons utilisés dans les étapes de lyse des cellules et la purification sont très critiques pour assurer la solubilité du HP-NAP dans E. Les lysats coli et une séparation efficace de HP-NAP recombinante à partir d&#39; impuretés de cellules hôtes, respectivement. Les cellules bactérienne...

Helicobacter pylori (H. pylori) est une cause majeure de la gastrite et de l&#39; ulcère gastro - duodénal. Cette bactérie a également été classé comme cancérogène chez l&#39; homme par le Centre international de recherche sur le cancer, une partie de l&#39;Organisation mondiale de la Santé, en 1994. Il a été estimé que la prévalence de H. infection pylori est de 70% dans les pays en développement et 30-40% dans les pays industrialisés 1. Même si le taux de H. infection pylori diminue dans les pays industrialisés, le taux de H. infection pylori dans les pays en développement est encore élevé 2. Le traitement standard pour l&#39; éradication de H. pylori infection consiste en l&#39;administration d&#39;un inhibiteur de la pompe à protons, IPP et deux antibiotiques, la clarithromycine ou le métronidazole et amoxicilline 3. Toutefois, l&#39;augmentation de la résistance aux antibiotiques chez H. pylori la PI thérapie de l&#39; ulcère exhorte le développement de nouvelles stratégies pour prévenir or guérir l&#39;infection. Développement de la vaccination prophylactique et / ou thérapeutique contre H. pylori pourrait fournir une approche alternative pour contrôler H. infection pylori. Helicobacter pylori protéine d&#39; activation des neutrophiles (HP-NAP), un facteur de virulence majeur de H pylori, a été identifié dans les extraits d&#39;eau de H. pylori avec la possibilité d&#39;activer les neutrophiles adhérer aux cellules endothéliales et produire des espèces réactives de l&#39; oxygène (ROS) 4. L&#39; infiltration des neutrophiles de la muqueuse gastrique trouvée dans H. pylori patients infectés par gastrite active peuvent provoquer une inflammation et des dommages aux tissus de l&#39;estomac. Ainsi, HP-NAP peut jouer un rôle pathologique par l&#39; activation des neutrophiles pour induire une inflammation de l&#39; estomac, ce qui provoque en outre l&#39; ulcère ou H. pylori -Associated maladies gastriques. Néanmoins, HP-NAP est un candidat potentiel pour des applications cliniques 5,6. En raison de la pro immunogène et immunomodulateurspriétés de HP-NAP, cette protéine pourrait être utilisée pour développer des vaccins, des agents thérapeutiques et des outils de diagnostic. Un essai clinique a été mené à l&#39; aide de HP-NAP recombinante comme l&#39; un des composants d&#39;un vaccin contre la protéine H. pylori. Ce vaccin se compose de HP-NAP recombinant associé à la cytotoxine gène A (CagA), et des protéines Une cytotoxine vacuolisante (VacA) formulé avec de l&#39; hydroxyde d&#39;aluminium et il a en outre été démontrée comme étant sans danger et immunogène chez l&#39;être humain 7. En outre, HP-NAP agit comme un immunomodulateur puissant pour déclencher T auxiliaires de type 1 (Th1) multipolarisé réponses immunitaires pour le traitement du cancer et de 8 à réguler à la baisse des réponses immunitaires médiées par Th2 induites par des réactions allergiques et d&#39; infections parasitaires 9,10. En ce qui concerne le diagnostic recombinant ELISA basé sur HP-NAP a été appliqué pour détecter des anticorps sériques contre la HP-NAP de H. pylori patients infectés par le 11. Une étude a montré que le niveau d&#39;anticorps spécifiques HP-NAP dans le sérum de H. pylori patients infectés par le cancer gastrique était significativement plus élevé que chez les patients souffrant de gastrite chronique 12. Une autre étude a également montré que les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP sont associées à la présence de non-cardia 13 adénocarcinomes gastriques. Ainsi, recombinant ELISA à base de HP-NAP peut être appliqué pour détecter les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP pour le pronostic du cancer gastrique chez H. pylori patients infectés par l . Pris ensemble, le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer. Parmi les différentes méthodes utilisées pour la purification de recombinant HP-NAP exprimé dans Escherichia coli (E. coli) sous sa forme native rapporté jusqu&#39;à présent, une chromatographie sur gel de filtration deuxième étape de purification impliquant est nécessaire pour obtenir de haute pureté HP-NAP 14-16 . Ici, une méthode utilisant la chromatographie négative mode batch avecdiéthylaminoéthyle (DEAE) résines échangeuses d&#39; ions est décrit pour la purification de HP-NAP surexprimé dans E. coli avec un rendement élevé et une grande pureté. Cette technique de purification a été basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d&#39;autres protéines à l&#39;exception de HP-NAP sont récupérés à partir de la fraction non liée. Cette approche de purification utilisant la chromatographie par échange d&#39;ions DEAE en mode négatif est simple et économiser en permettant la purification de HP-NAP recombinante par Chromatographie en une seule étape par la collecte de la fraction non liée du temps. En plus de HP-NAP, plusieurs autres biomolécules, tels que les virus 17, immunoglobuline G (IgG) 18, l&#39; hémoglobine 19, la protéine phosphatase 20, et le facteur de virulence flagelline 21, ont également été rapportés d&#39;être purifiée par chromatographie échangeuse d&#39; ions en négatif mode. Le mode négatif est préféré pour la chromatographie échangeuse d&#39;ions, si des impuretés sont mineuresles composants présents dans l&#39;échantillon soumis à purifier 22. L&#39;application de la chromatographie négative dans la purification de biomolécules naturelles ou recombinantes a été récemment examiné 23. Le présent rapport fournit une étape par le protocole d&#39;étape pour l&#39; expression de HP-NAP recombinante dans E. coli, la lyse des cellules et la purification de HP-NAP utilisant une Chromatographie en discontinu en mode négatif par DEAE résines échangeuses d&#39; ions. Si une protéine souhaitée pour la purification est adaptée à la chromatographie d&#39;échange d&#39;ions en mode négatif, le protocole décrit pourrait également être adapté comme point de départ pour le développement d&#39;un procédé de purification.

<table><tbody><tr><td><Matériel></solide></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP/solide&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>préparé comme décrit dans les données supplémentaires de la référence 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG %20</td></tr><tr><td>fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>inhibiteur de protéase http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chlorométhylcétone (TLCK)</td><td>Inhibiteur de la protéase</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</tr><tr><td>N-tosyl-L-phénylalaninyl-chlorométhylcétone (TPCK)</td><td>Inhibiteur de la protéase</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</tr><tr><td>Standard protéique (albumine sérique bovine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp ;</td><td>une protéine standard pour Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&ndash ; Sephadex &nbsp ; Forme chlorure A-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por tube de dialyse</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>avec coupure de poids moléculaire de 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720 ;</td></tr><tr><td>Unités Acrodisc&reg ; avec Mustang&reg ; E membrane</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>pour l’élimination des endotoxines ; exploité à des débits allant de 1 à 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr> anticorps <tr><td>monoclonal de souris MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>élevé contre le HP-NAP purifié de la souche NCTC 11637 de H. pylori tel que décrit dans le renvoi 23 ; &nbsp ; Un don des Drs Evanthia Galanis et Ianko D. Iankov à la Mayo Clinic, États-Unis http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>pour la chromatographie par filtration sur gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>Kit de coloration à l’argent PlusOne, protéines</td><td>GE Healthcare Sciences de la vie</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>pour la centrifugation par gradient de densité pour purifier les neutrophiles humains http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>Plaque blanche à fond plat à 96 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protégée de la lumière http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Expand &nbsp ; système de PCR à modèle long</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>source de mélange d’enzymes PCR haute fidélité http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha ;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de produit</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV/VIS double faisceau U-2800</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td>hors du marché et mis à niveau vers un nouveau modèle http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>Homogénéisateur haute pression EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX ultracentrifugeuse générale</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>pour la séparation des fractions protéiques solubles et insolubles des lysats E. coli lysats http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&Auml ; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>pour la chromatographie par filtration sur gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv modèle 62ADS Spectrophotomètre CD</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>hors du marché et mis à niveau vers un nouveau modèle http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>système d’imagerie LAS-3000</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>abandonné et remplacé http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Compteur multi-étiquettes Wallac 1420 (Victor2)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>pour la détection par chimiluminescence http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

une étape négative de purification chromatographique<em&gt; helicobacter pylori</em&gt; activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; escherichia coli</em&gt; en mode batch

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophiles-activating protein (HP-NAP) est un facteur de virulence majeur de Helicobacter pylori (H. pylori). Elle joue un rôle crucial dans H. pylori gastrique induite par l&#39; inflammation en activant les leucocytes plusieurs innés incluant les neutrophiles, les monocytes et les mastocytes. Les propriétés immunogènes et immunomodulatrices de HP-NAP en font un candidat vaccin potentiel diagnostique et H. pylori et un nouveau candidat médicament pour le traitement du cancer. Afin d&#39;obtenir des quantités importantes de HP-NAP purifié utilisé pour ses applications cliniques, une méthode efficace pour purifier cette protéine avec un rendement élevé et la pureté doit être établie. Dans ce protocole, nous avons décrit un procédé en une étape négative purification chromatographique de HP-NAP recombinante surexprimée dans Escherichia coli (E. coli) en utilisant diéthylaminoéthyle (DEAE) des résines échangeuses d&#39; ions (par ex., Sephadex®) , ile mode de traitement par lots n. HP-NAP recombinante constitue près de 70% de la protéine totale dans E. coli et est presque entièrement récupérée dans la fraction soluble après lyse cellulaire à un pH de 9,0. Sous la condition optimale à un pH de 8,0, la majorité des HP-NAP est récupéré dans la fraction non liée , tandis que les protéines endogènes de E. coli sont efficacement éliminés par la résine. Cette méthode de purification par chromatographie négative par lots de mode avec DEAE résines échangeuses d&#39; ions donne de HP-NAP fonctionnel à partir de E. coli sous sa forme native avec un rendement élevé et de pureté. Le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.

Le schéma de principe du mode opératoire de purification négative de HP-NAP recombinante exprimée dans E. coli en utilisant DEAE résines échangeuses d&#39; ions en mode discontinu est représenté sur la figure 1. Cette technique de purification est basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d&#39; autres protéines à l&#39; exception de HP-NAP sous sa forme native sont récupérés à part...

Procédé à rendement élevé pour une étape de purification du recombinant négatif Helicobacter pylori protéine d&#39; activation des neutrophiles (HP-NAP) surexprimé dans Escherichia coli en utilisant des résines de diéthylaminoéthyle en mode discontinu est décrit. HP-NAP purifié par cette méthode est bénéfique pour le développement de vaccins, de médicaments ou de diagnostic pour H. pylori -Associated maladies.

Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

L'objectif général de cette purification est d'obtenir une protéine fonctionnelle de type neutrophile-activante de Helicobacter pylori, ou HP-NAP, sous sa forme native, avec une forte pureté et un rendement élevé, en utilisant une chromatographie par lots en mode négatif avec une résine échangeuse d'ions diéthylaminoéthyle. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'HP-NAP peut être purifiée sous sa forme native en une seule étape, avec une pureté et un rendement élevés. La purification négative de l'HP-NAP commence par une procédure de fixation par lots, au cours de laquelle la fraction protéique soluble provenant des lysats bactériens est ajoutée à la résine DEAE.Le mélange est incubé afin de permettre aux protéines totales de se lier à la résine. L'HP-NAP présente dans la fraction non liée est ensuite récupérée par centrifugation ou par écoulement gravitationnel. Les implications de cette technique sont une prévention, un traitement et un pronostic des maladies associées à Helicobacter pylori, ainsi qu'une thérapie anticancéreuse, dans un rapport de 10:1.En raison des propriétés immunogènes et immunomodulatrices de HP-NAP. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés. Parce que HP-NAP s'agrège facilement lors de la stérilisation.La procédure sera démontrée par Zhi-Wei Hong, un étudiant diplômé de notre laboratoire. En travaillant à quatre degrés Celsius, nous suspendons 50 millilitres du culot cellulaire préparé comme décrit dans le protocole écrit dans 20 millilitres de tampon tris à faible teneur en sel, à un pH de 9,0, contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases. Il est essentiel de maintenir l'échantillon à quatre degrés Celsius afin de permettre à la procédure d'empêcher l'agrégation des protéines.Disrupter les cellules bactériennes en faisant passer la suspension bactérienne dans un homogénéisateur à haute pression fonctionnant à une pression comprise entre 15 000 et 20 000 PSI, pendant sept passages à quatre degrés Celsius. Après la lyse bactérienne, la solution doit être centrifugée immédiatement. Transférer les échantillons homogénéisés dans un tube de centrifugation.Centrifuger immédiatement le lysat cellulaire à 30 000 × g à quatre degrés Celsius pendant une heure pour séparer les fractions protéiques solubles et insolubles à l'aide d'une ultracentrifugeuse. Après la centrifugation, transférer le surnageant, correspondant à la fraction protéique soluble, dans un bécher. Mesurer la concentration en protéines de la fraction protéique soluble par la méthode de Bradford en utilisant un kit commercial avec l'albumine sérique bovine comme standard, conformément aux instructions du fabricant.Ensuite, ajouter 177,6 microlitres d'acide chlorhydrique 1 N à 20 millilitres de la fraction protéique soluble afin d'ajuster son pH de 9,0 à 8,0. Ajouter du Tris-HCl 20 millimolaire, pH 8,0, et 50 millilitres de chlorure de sodium à la solution protéique pour obtenir une concentration finale en protéines de 0,5 milligramme par millilitre. Pour préparer 15 millilitres de résine DEAE, suspendre 0,6 gramme de poudre sèche de résine DEAE dans 30 millilitres de tampon Tris-HCl à température ambiante pendant au moins un jour.Centrifuger la résine à 10 000 × g à quatre degrés Celsius pendant une minute, puis retirer et jeter le surnageant. Ajouter ensuite 15 millilitres de tampon Tris-HCl. Après avoir répété les étapes de centrifugation et de resuspension quatre fois supplémentaires, conserver les 15 millilitres de résine sédimentée à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.À quatre degrés Celsius, ajoutez 45 millilitres des protéines solubles préparées à des millilitres de la résine et transférez le mélange dans un bécher de 100 millilitres muni d’un barreau aimanté. Agitez la suspension de protéines-résine à l’aide d’un agitateur magnétique à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, versez la suspension de protéines-résine dans une colonne en plastique ou en verre équipée d’un robinet et laissez la résine se tasser par gravité.Ouvrir le robinet pour laisser la solution protéique s'écouler à travers la colonne par gravité, jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement comme la fraction non liée, qui contient la protéine activant les neutrophiles purifiée. Ajouter 15 millilitres du tampon Tris-HCl glacé dans la colonne.Ouvrir à nouveau le robinet pour permettre au tampon de lavage de traverser la colonne par écoulement gravitationnel jusqu'à ce que le niveau du liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement comme fraction de lavage. Répéter le lavage avec le tampon glacé quatre fois supplémentaires pour recueillir les fractions de lavage additionnelles.Ensuite, ajoutez 15 millilitres de Tris-HCl à 20 millimolar, pH 8,0, à 1 molaire en chlorure de sodium, glacé, dans la colonne. Récupérez le liquide qui s'écoule comme les fractions d'élution, comme précédemment. Répétez les étapes d'élution quatre fois supplémentaires pour recueillir des fractions d'élution additionnelles.L'effet du pH sur la solubilité de HP-NAP dans un lysat d'E.coli est illustré ici. La quantité de HP-NAP détectée dans cette fraction soluble a fortement augmenté entre pH 7,5 et 9,5. La protéine recombinante HP-NAP a été presque entièrement récupérée dans la fraction soluble après lyse cellulaire à pH 9,0.Ici, l'effet du pH sur la purification négative de l'HP-NAP recombinant exprimé dans E.coli à l'aide de résines DEAE en mode discontinu est présenté. À un pH de 8,0, seulement une petite quantité d'HP-NAP était présente dans la fraction éluée. La quantité d'HP-NAP présente dans les fractions non liées était maximale à pH 8,0.La quantité optimisée de protéines chargée sur la résine DEAE est de 1,5 milligramme de protéine par millilitre de résine afin d'atteindre la capacité maximale de la résine pour absorber les impuretés provenant d'E.coli. À un pH de 8,0, très peu de protéines autres que HP-NAP sous sa forme native sont récupérées dans la fraction non liée en utilisant des résines DEAE en mode discontinu. La pureté de HP-NAP était supérieure à 95 pour cent.HP-NAP purifié se replie en un multimère présentant une structure secondaire en hélice alpha, comme le révèlent le chromatogramme de filtration sur gel et le spectre de dichroïsme circulaire dans l'ultraviolet lointain. Un dosage chimiluminescent dépendant du lumen révèle que HP-NAP purifié est capable de déclencher la production d'espèces réactives de l'oxygène par les neutrophiles. Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en moins de cinq heures si elles sont effectuées correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la purification de la HP-NAP fonctionnelle sous sa forme native, avec un rendement et une pureté élevés, en utilisant une chromatographie par lots en mode négatif avec une résine échangeuse d'anions DEAE. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des tampons au pH approprié lors de l'étape de stérilisation dans la chromatographie par lots. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons essayé d'appliquer d'autres approches chromatographiques à la place de la filtration pour purifier la HP-NAP sous sa forme native.Bien que cette méthode soit conçue pour s'appliquer à la HP-NAP recombinante exprimée dans E.coli, elle peut également être utilisée avec d'autres systèmes d'expression bactérienne, tels que per-sida sep-tidas. La démonstration visuelle de cette mesure est un code rapide.De plus, les étapes de stérilisation et de chromatographie par lots sont difficiles à maîtriser, car elles doivent être réalisées à quatre degrés Celsius sans aucun retard. Si une protéine destinée à la purification convient à notre chromatographie d'échange en mode négatif, cette procédure pourrait également servir de point de départ pour l'élaboration d'un processus de purification.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche clinique pour explorer la possibilité d'utiliser la HP-NAP dans le traitement du cancer ainsi que dans le développement de vaccins, de médicaments et de diagnostics pour les maladies associées à Helicobacter pylori.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

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Cette vidéo présente la purification de nanoparticules de protéines auto-assemblées ou SAPN marquées à l’histidine à l’aide de la chromatographie liquide d’affinité. Les fractions SAPN purifiées qui en résultent conviennent au développement de vaccins, ce qui est prometteur pour des applications immunothérapeutiques potentielles.

Purification de nanoparticules de protéines auto-assemblées à l’aide de la chromatographie d’affinité

Polypeptides élastine sont des biopolymères de relance sensible avec des applications allant de la purification de protéines recombinantes à l'administration de médicaments. Ce protocole décrit la purification et la caractérisation de polypeptides d'élastine-like et leurs fusions peptidiques ou protéiques provenant d'Escherichia coli en utilisant leur comportement critique inférieure de transition de phase de la température de la solution comme une simple alternative à la Chromatographie.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Nous décrivons ici une méthode pour la purification des enzymes pyrophosphokinase histidine-étiquetées et utilisant la chromatographie sur couche mince des substrats radiomarqués et produits pour le dosage de l' activité enzymatique in vitro. Le dosage de l’activité enzymatique est largement applicable aux kinase, cyclase de nucléotides ou réaction de transfert de phosphore dont le mécanisme comprend l’hydrolyse de nucléotides triphosphate.

Une Purification et analyse d’activité In Vitro pour un (p) ppGpp synthétase de Clostridium difficile

Une méthode détaillée est fournie ici décrivant la purification, le repliement et la caractérisation des nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) pour le développement de vaccins.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

Un adaptateur de plaque multicolonne permet aux colonnes de chromatographie d’être interfacées avec des plaques de collecte multi-puits pour une affinité parallèle ou une purification par échange d’ions, offrant une méthode de purification de protéines économique à haut débit. Il peut être utilisé sous gravité ou sous vide donnant des quantités de milligrammes de protéines via une instrumentation abordable.

Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque multicolonne

Dans cette étude, une technique de détection sandwich basée sur des anticorps doubles a été développée pour la détection rapide des antigènes fécaux infectés par Helicobacter pylori.

Détection rapide de l’antigène fécal de l’infection à Helicobacter pylori grâce à la technologie de détection à double sandwich d’anticorps

Cet article décrit une méthodologie de surexpression de Nsp15 recombinant, une nucléase toxique, dans un système d’expression C41(DE3), suivie d’une purification de la protéine marquée à l’aide de la chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique. Ces protocoles peuvent être adaptés à d’autres protéines toxiques difficiles.

Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli

Ce protocole décrit une méthode rapide et reproductible d’extraction et de précipitation à base de solvant organique pour purifier un polypeptide de type élastine (ELP) à partir d’Escherichia coli, offrant une alternative potentiellement évolutive aux méthodes conventionnelles de purification ELP.

Purification efficace des polypeptides de type élastine (ELP) à partir d’E. coli en utilisant une méthode d’extraction et de précipitation à base de solvant organique

Découvrez la purification négative de la protéine HP-NAP d'Helicobacter pylori par chromatographie en mode batch avec résine DEAE. Cette méthode efficace en une étape permet d'obtenir une haute pureté pour le développement de vaccins et de diagnostics.

Une étape négative de purification chromatographique Helicobacter pylori Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans Escherichia coli En mode batch (Vidéo) | JoVE Journal

Une étape négative de purification chromatographique

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