Name: Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez une méthode sensible pour mesurer le CO₂ produit par l'oxydation des substrats radiomarqués chez Drosophila melanogaster. Cette technique quantitative permet d'étudier l'impact des mutations sur le métabolisme énergétique.

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L’auteur remercie les Drs Mingjian Lu et Morris Birnbaum pour leurs conseils utiles et leur soutien financier de la part du NIDDK (R21DK089391).

1. Préparation des aliments contenant des Fly radiomarqués métaboliques Substrats <ol><li> Dans un tube de microcentrifugeuse, mélanger 1 - 2 uCi substrat radiomarqué (D- [6- 14 C] -glucose, D- [1- 14 C] -glucose ou [1- 14 C] acide -palmitic, 40 - 60 mCi / mmol) avec 15 ul FD &amp; C n ° 1 colorant bleu alimentaire et H 2 O à l&#39; égalité d&#39; un volume total de 25 ul. ATTENTION: Le carbone 14 est un émetteur bêta de faible énergie et a une courte distance dans l&#39;air. Cependant, prendre soin de ne pas renverser de molécules radiomarquées ou ingestion accidentelle par l&#39;expérimentateur. Fly flacons alimentaires basculent facilement; assurez-vous de les loger dans un conteneur qui les empêche de basculer, en particulier lorsque radiomarqueur est sous forme liquide (étape 1.2) ou dans les aliments non solidifiée (étape 1.4). Les mouches qui sont nourris ou ont été nourris substrats radiomarqués va commencer à expirer de petites quantités de CO 2 radiomarqué. Ces mouches doivent être conservés dans des boîtes acryliques dans les hottes, et un petit plat de KOH can être défini dans la boîte pour être utilisé comme un épurateur de CO 2. </li><li> Pipet tout le substrat radiomarqué et colorant bleu mélange dans le fond d&#39;une mouche flacon alimentaire vide (hauteur: 9,4 cm, largeur: 2,2 cm). </li><li> norme de chaleur voler la nourriture dans un four à micro-ondes jusqu&#39;à ce que la nourriture est tout simplement liquéfié (15-20 sec au niveau de puissance élevé pour un flacon contenant 10 ml de nourriture). </li><li> Ajouter la nourriture 975 ul fondue au substrat radiomarqué / colorant bleu mélange et rapidement tourbillonner, le suivi uniformité de la couleur bleue pour assurer un mélange complet. </li><li> Laissez les aliments refroidir et se solidifier complètement à température ambiante pendant 20 - 30 min. </li></ol> 2. Alimentation Substrats radiomarqué métaboliques à mouches adultes fruits <ol><li> Anesthésier les mouches adultes en utilisant un appareil anesthésiant CO 2 constitué par le polyéthylène poreux fusionné à base d&#39; acrylique et relié à un réservoir de CO 2 avec un régulateur de pression. L&#39; écoulement du CO 2 dans l&#39;appareil anesthésiant à 5 L / min. <ol><li> Transfert Anesthetized vole dans des flacons contenant radiomarqués, alimentaires teints en bleu (n = 15 - 30 mouches par flacon). flacons de Cap avec un bouchon en mousse, et se reposer horizontalement jusqu&#39;à ce que les mouches se réveillent. flacons de transfert à un récipient acrylique lidded (180 cm x 180 cm x 240 cm de haut). </li></ol></li><li> Pour l&#39; alimentation à court terme, mourir de faim mouches pendant 18 - 24 heures avant le transfert de mouches à la nourriture radiomarqué pour un 2 -. Étape 3 h d&#39;avance T qu&#39;il étape de la famine est important parce que les mouches nourries ne mangent pas de manière fiable une nouvelle source de nourriture qui leur est présentée . Pour l&#39;alimentation à long terme au cours de 5 - 7 jours, les mouches ne doivent pas être privés de nourriture, mais l&#39;expérimentateur doit surveiller la teneur en eau de la nourriture radiomarqué dans les flacons mouches sont logés dans et utiliser une aiguille et une seringue pour ajouter de l&#39;eau dans des flacons avec de la nourriture sèche. </li><li> Transfert vole à la nourriture non marquée par «tapping» dans un nouveau flacon. Une période de chasse initiale de 2-4 h permet mouches pour nettoyer les particules de nourriture radiomarqués de leurs cuticules et permet la digestion des radiomarqueured nourriture restante dans l&#39;intestin. Surveiller les progrès des aliments dans l&#39;intestin par une inspection visuelle des mouches pour chercher abdomens bleu. </li><li> Par la suite, le transfert vole vers différents types d&#39;aliments (12-24 de h sur la nourriture standard ou 1% de gélose pour la mesure des effets de la nourri par rapport à jeun sur la respiration) ou à des températures ambiantes (12-96 h à 18 ° C ou 30 ° C pour génétique manipulations utilisant GAL80 sensible à la température (GAL80 ts), par exemple). Remarque: La durée de cette période de chasse varie en fonction de l&#39;expérience effectuée. Pour exemple, une poursuite de 96 heures à 30 ° C peut être nécessaire dans des expériences utilisant des GAL80 ts afin d&#39;activer complètement l&#39; expression du transgène GAL4-dépendante. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;appareil CO 2 -Collection <ol><li> Assembler des matériaux pour la construction de &quot;voler pods&quot;, des tubes de treillis-capped qui contiendra les mouches marquées avec 14 C-glucose ou 14 C-acide palmitique et that restera ouvert à l&#39;atmosphère. Coupez le top 50 mm de 12 mm de tubes en polypropylène x 75 mm, ce qui laisse 25, des tubes à fond rond mm de long. Préparer 35 mm x 35 mm carrés de 130 um maille de nylon. En outre, obtenir du ruban adhésif transparent dans un distributeur de ruban adhésif. </li><li> Assembler des matériaux pour les CO 2 appareils de -Bureaux. Pour chaque pod voler, assembler un 20 ml à scintillation en verre du flacon, un top bouchon en caoutchouc avec un trou excentré, un centre de bien être inséré à travers le trou dans le bouchon supérieur, GF grade / B papier filtre en microfibres de verre (2,1 cm de diamètre cercle, 1 um pore). / B papier filtre GF est utilisé en raison de sa résistance à l&#39;humidité élevée et la capacité de charge élevée. </li><li> Préparer 5% de KOH fraîches le jour de l&#39;utilisation. Juste avant l&#39;étape 3.4, plier et placer le papier circulaire de filtre GF / B dans le centre de bien qui est filetée à travers le trou de la partie supérieure bouchon en caoutchouc et le saturer avec 100 ul de 5% de KOH. Reportez - vous à la figure 1. </li><li> Après incubation (s) sur un support non marqué, unnesthetize vole avec CO 2. Brush vole dans le tube de coupure de polypropylène, bouchon avec filet de nylon, et utiliser du ruban adhésif transparent pour adhérer au maillage tube. Travaillez rapidement pour éviter les mouches se réveiller et d&#39;échapper avant que le maillage a été solidement fixé sur le tube. Un nombre égal de mouches doit être utilisé dans chaque gousse de mouche pour une expérience particulière; 10 - 20 mouches par mouche pod produisent suffisamment radiomarqué-CO 2 pour la mesure par comptage de scintillation (étape 4.1 ci - dessous). </li><li> Transférer le pod de mouche à 20 ml à scintillation en verre du flacon. Boucher le flacon en verre avec la partie supérieure du bouchon en caoutchouc tenant un centre de bien contenant du papier filtre GF / B KOH saturé. Pliez le large en haut de la partie supérieure du bouchon en caoutchouc sur la lèvre du flacon à scintillation en verre. Reportez - vous à la figure 1. </li><li> flacons en verre Set contenant les mouches dans un couvercle, récipient acrylique, et incuber pendant différentes périodes de temps (2 à 12 h fonctionne bien). </li></ol> 4. Analyse des résultats <ol><li> Àla fin de l&#39;incubation, des flacons en verre décapsuler, et un papier filtre GF / B de KOH saturé transfert dans un flacon à scintillation en plastique de 6 ml contenant 4 ml de cocktail de scintillation. </li><li> Si nécessaire, congeler les mouches dans les gousses de mouches sur la glace sèche et conserver à -80 ° C pour la détermination ultérieure de substrats stockés. On notera que ces échantillons sont radioactifs et doivent être stockées en conséquence. </li><li> Préparer des flacons de scintillation supplémentaires: l&#39;un contenant / B papier filtre GF utilisé pour servir de fond et une à deux autres contenant de 0,1 à 0,5 uCi substrat radiomarqué pour déterminer cpm / uCi. </li><li> Mesurer cpm pour chaque échantillon en utilisant un compteur à scintillation selon le protocole du fabricant. </li><li> Calculer pmol 14 CO 2 / cpm et pmol 14 CO 2 par mouche par heure. Soustraire le cpm de fond à partir de la valeur cpm pour chaque échantillon. A partir des données nettes de substrat radiomarqués, calculer le cpm de fond corrigée / uCi de l&#39;échantillon compté. <ol><li> Utilisez lefourni par le fabricant activité spécifique et de la concentration radiochimique du substrat radiomarqué (par exemple, 50 uCi / umole et 0,1 pCi / pl, respectivement) pour calculer pmol / cpm. Utilisez ce facteur pour convertir les données mouche pod fond corrigée de cpm 14 CO 2 / échantillon pmol 14 CO 2 / échantillon. Puis diviser par le nombre de mouches et le nombre d&#39;heures dans la nacelle à la mouche. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila%3A+implications+for+aging+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li>
<li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Geront%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li>
<li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li>
<li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism%2C+respiration+and+flight+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li>
<li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681(2014).</li>
<li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+cyclin+D%2FCdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li>
<li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li>
<li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration%2C+pH%2C+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li>
<li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li>
<li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li>
<li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li>
<li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li>
<li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li>
<li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li>
<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%22rate+of+living%22+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li>
</ol>

L’auteur ne déclare aucun intérêt financier concurrent.

Ce protocole décrit un procédé pour mesurer l&#39;oxydation des substrats spécifiques radiomarqués chez les adultes de Drosophila melanogaster. Cette technique est simple, quantitative, reproductible et sensible, et il vient compléter les méthodes existantes qui mesurent la production totale de CO 2 et O 2 consommation , car il peut être utilisé pour identifier l&#39;élément nutritif (s) est oxydé pour la production d&#39;ATP. Mesure du CO 2 libérée par l&#39;oxydation de substrats radiomarqués spécifiques en utilisant la méthode décrite ici est complémentaire des techniques qui mesurent la production totale de CO 2. CO Total 2 production (V CO2) permet d&#39; estimer le taux métabolique et, si le montant total O 2 Consommation (V O2) est connu, le taux métabolique peut être calculé et la source de combustible pour l&#39; oxydation peut être estimée sur la base du ratio d&#39;échange respiratoire (V CO2 / V O2 = RER). Quandles hydrates de carbone sont le substrat exclusif, RER = 1, mais lorsque les acides gras sont la source exclusive, RER = 0,7, grâce à la stoechiométrie des réactions de glucose et de l&#39;oxydation des lipides. En l&#39;absence d&#39;équipements pour mesurer la consommation d&#39;oxygène chez la drosophile 14, la source de combustible oxydant ne peut être identifié. Cependant, par l&#39; étiquetage vole avec des quantités infimes d&#39;un substrat radioactif ou d&#39;une autre et les taux de mesure de radiomarqué production de CO 2, on peut tirer des conclusions quant à la capacité des mouches pour oxyder un substrat donné à différents moments au cours d&#39; un stimulus ou sur les effets d&#39;une étant donné la mutation sur l&#39;oxydation du carburant. Il y a un certain nombre d&#39;étapes critiques dans ce protocole. Tout d&#39;abord, il faut prendre soin lors de l&#39;utilisation des matières radioactives pour éviter les déversements et la contamination des zones de recherche. Deuxièmement, lorsque anesthésier les mouches pendant les étapes 2.1 et 3.4, l&#39;expérimentateur doit travailler rapidement pour éviter les effets de CO 2 prolongéel&#39;exposition sur le métabolisme et le comportement. Un groupe de 20 mouches peut être anesthésiée et transféré dans un nouveau flacon ou dans une nacelle de braguette en 20 secondes ou moins. Lorsqu&#39;ils sont transférés d&#39;un appareil d&#39;anesthésie à un flacon alimentaire, le flacon doit être posé sur le côté pour empêcher les mouches anesthésiées de se coincer sur la surface des aliments. Quand les mouches sont des aliments radiomarqué nourris au cours de plusieurs jours comme dans l&#39;étape 2.2, l&#39;expérimentateur devrait assurer que la nourriture ne se dessèche pas que les mouches sont sensibles à la déshydratation. L&#39;état nourri ou à jeun avant l&#39;étiquetage, le choix de l&#39;étiquette, la longueur du temps d&#39;étiquetage, la longueur de temps dans la nacelle à la mouche, et la méthode de l&#39;anesthésie sont des paramètres qui peuvent être soumis au dépannage et à la modification lors de l&#39;utilisation de cette technique. Tout d&#39;abord, les mouches soumis à des périodes d&#39;étiquetage courtes (2 - 3 hr) ne sont pas susceptibles de consommer des quantités importantes de nourriture radiomarqué moins soumis à une période de jeûne préalable. D&#39;autre part, le choix du marqueur cune incidence sur les conclusions que l&#39;on peut tirer sur les phénotypes métaboliques. Par exemple, la production de CO 2 radiomarqué à partir de D- [1- 14C] -glucose peut refléter l&#39; oxydation par le cycle de l&#39; acide citrique ou du phosphate pentose, alors que la production de CO 2 radiomarqué à partir D- [6- 14C] -glucose reflète l&#39; oxydation à travers le cycle de l&#39; acide citrique seul 12,15,16. Nourrir les mouches avec un traceur radiomarqué pour un acide aminé essentiel 17,18 serait une bonne stratégie pour évaluer l&#39; oxydation des acides aminés dérivés de protéines. Enfin, les périodes longues de marquage avec du glucose radiomarqué soulèvent également la possibilité d&#39;incorporation de ce précurseur dans d&#39; autres classes de molécules telles que les triglycérides 19 et des acides aminés tels que l&#39; alanine, qui interconvertit facilement avec du pyruvate. Elle peut être évaluée en mesurant la radioactivité incorporée dans les différentes classes de molécules 6. rad En effet, des cohortes distinctes de mouches peuvent être nourrissubstrats iolabeled de la même manière et ensuite utilisé pour des expériences mouche pod ou la mesure de radiomarqueur qui sont stockées et reste en glycogène et de triglycérides dans nourris et jeûné conditions 6, par exemple. Une autre stratégie consiste à utiliser de courtes périodes d&#39;étiquetage qui sont susceptibles de révéler l&#39;oxydation des nutriments alimentaires radiomarqués eux-mêmes et non pas des formes de stockage de ces nutriments. Troisièmement, il est également possible que deux groupes de mouches pourraient avoir des taux identiques de 14 production de CO 2 sur une période de temps donnée, mais des vitesses très différentes au départ. Par conséquent, faire varier la quantité de temps qui vole passer dans la nacelle de mouche peut être un paramètre important de modifier l&#39;évaluation de la variation phénotypique. Enfin, ce protocole prévoit l&#39;utilisation d&#39;une courte période de CO 2 anesthésie lors de la mise mouches dans l&#39;appareil mouche pod. Il est possible que les CO 2 anesthésie peuvent affecter la fonction métabolique au cours de l&#39;expérience mouche pod. Un suppléant approche est d&#39;utiliser l&#39; anesthésie d&#39;azote qui ne modifie pas le taux métabolique 20. Comme avec toute technique qui mesure un système aussi complexe que l&#39;oxydation du carburant et le taux métabolique, le procédé décrit ici a des limites. Tout d&#39; abord, il est possible que les mouches dans les différents groupes pourraient consommer différentes quantités de nourriture radiomarqué et ne serait donc entrer dans la phase de collecte de CO 2 de l&#39;essai avec différentes quantités de départ de substrat. Ceci peut être contrôlé par une certaine mesure en effectuant l&#39;expérience avec de grandes tailles d&#39;échantillon et en alimentant les mouches en masse. Pour les périodes d&#39;étiquetage courtes, les mouches avec les tripes de couleur bleue similaires auront consommé radiomarqueur et peuvent être reportés à la partie de chasse de l&#39;expérience. La quantité de radiomarqueur restant dans un groupe de mouches peut également être mesurée à la fin de l&#39;expérience et des cohortes distinctes de mouches après la fin de l&#39;alimentation et de la période de chasse initiale. Deuxièmement, les niveaux d&#39;activité entregroupes de mouches dans les gousses de mouches peuvent différer. Cela devra être déterminée expérimentalement et pris en compte lors de l&#39;interprétation des données. Troisièmement, cette technique ne permet pas de mesurer la production totale de CO 2, seule la production d&#39;un nutriment alimentaire spécifique ou la forme (s) de stockage de ce nutriment. Ce protocole ne remplace pas pour mais est complémentaire aux mesures de VCO 2 , car il fournit des informations différentes et complémentaires. La méthode décrite ici mesures exhalé, CO 2 radiomarqué qui est un produit de l&#39;oxydation des quantités infimes de substrats métaboliques spécifiques. En faisant varier l&#39;étiquette utilisée - glucose, acides gras ou acides aminés - on peut concevoir des expériences de plus en plus sophistiqués pour évaluer les contributions des différents substrats du métabolisme dans différentes conditions physiologiques telles que la famine et sur différents fonds génétiques. Les applications futures de cette technique comprennent la mesure de METABOLIm dans les stades larvaires et pupes de développement, deux étapes du cycle de vie de Drosophila qui sont caractérisées par des extrêmes de stockage des éléments nutritifs et la ventilation, respectivement.

Le travail dans l&#39;organisme modèle Drosophila melanogaster a grandement contribué à la compréhension des principes de la génétique, les processus de développement, la croissance, le vieillissement, le comportement, l&#39; immunité et la maladie humaine 1,2. Une myriade d&#39;approches biologiques génétiques et cellulaires chez la drosophile a entraîné des progrès dans ces domaines. Cependant, l&#39;étude du métabolisme de la mouche des fruits a développé plus lentement, en grande partie grâce à des difficultés dans la mesure des paramètres métaboliques dans un si petit animal. L&#39;intérêt d&#39;utiliser la drosophile comme modèle pour l&#39; étude des maladies humaines telles que le diabète et pour comprendre les contributions du métabolisme à des pathologies de croissance et divers a poussé le terrain pour développer et adapter les techniques métaboliques pour cet organisme 3,4. Des méthodes fiables sont maintenant disponibles pour la mesure d&#39;un certain nombre de paramètres métaboliques dans la mouche des fruits. Par exemple, il est facile d&#39;évaluer l&#39;apport alimentaire <sup&gt; 5, les niveaux de triglycérides stockés et du glycogène, ainsi que les taux circulants de glucose hémolymphe et le principal sucre circulant dans la mouche, le trehalose, qui est un disaccharide constitué de deux molécules de glucose 4. L&#39; utilisation de traceurs métaboliques a permis l&#39;étude de l&#39; absorption des nutriments dans l&#39;alimentation et la conversion des nutriments absorbés tels que le glucose à la forme de stockage du glycogène et de triglycérides 6. Les taux métaboliques peuvent être évalués dans le fruit voler à travers la mesure de la consommation d&#39;oxygène 7,8 et de dioxyde de carbone (CO 2). Le cycle de l&#39;acide citrique deux unités oxyde de carbone qui peuvent entrer dans le cycle en tant que coenzyme acétyle A (CoA), qui est dérivé du métabolisme des glucides alimentaires et stockés et les acides gras. Chaque tour du cycle génère une molécule chacun des GTP (ou ATP) et le donneur d&#39;électrons FADH 2, trois molécules de NADH, et deux molécules du CO produit des déchets 2. Production de CO 2 peutêtre utilisé pour estimer le taux de métabolisme de base. La production totale de CO 2 peut être quantifiée chez la drosophile par l&#39;utilisation de disponibles dans le commerce ou à la main respiromètres 9-10,11. La mesure de la production totale de CO 2, en particulier lorsqu&#39;elle est associée à la mesure de consommation d&#39; O 2, fournit des informations précieuses sur le métabolisme énergétique du corps entier. Toutefois, cette mesure ne permet pas d&#39;identifier le nutriment oxydé pour l&#39;adénosine triphosphate (ATP). Trois grandes classes de nutriments peuvent entrer dans le cycle de l&#39;acide citrique conversion suivante en acétyl CoA: hydrates de carbone, des acides gras et des protéines. Glucose-6-phosphate, le dérivé de glucose alimentaire ou de glycogène, peut être converti en pyruvate est décarboxylé en pyruvate déshydrogénase pour former l&#39;acétyl-CoA. Dégradation des acides gras dérivés de l&#39;alimentation ou de triglycérides stockés par des rendements de ß-oxydation, l&#39;acétyl-CoA qui pénètre ensuite dans le cycle de l&#39;acide citrique. finalementUne majorité des acides aminés peut entrer dans le cycle de l&#39;acide citrique après conversion en pyruvate, l&#39;acétyl-CoA ou de l&#39;acide citrique intermédiaires du cycle tels que l&#39;alpha-cétoglutarate. apport spécifique de substances nutritives pour le métabolisme énergétique en conditions basales et stimulées peut être contrôlée par l&#39;utilisation de traceurs radioactifs. Le protocole présenté ici est adapté pour être utilisé dans Drosophila à partir d&#39; un protocole utilisé pour évaluer l&#39; oxydation dans les cellules cultivées en culture 12,13. Dans cette approche, les mouches des fruits sont nourris 14 substrats C-radiomarquée métaboliques (glucides, acides gras ou acides aminés) dans le régime alimentaire pour un court (heures) ou longues (jours) impulsion, chassés sur les aliments sans étiquette, puis exposés à un la chambre contenant de l&#39; hydroxyde de potassium (KOH) , du papier filtre saturé en CO exhalé pour le piégeage 2 sous forme de bicarbonate. bicarbonate radiomarqué peut être quantifiée par comptage par scintillation. Les différences de radiomarqué-production de CO 2 entre l&#39; expériencegroupes al de mouches peuvent refléter l&#39;utilisation de différents combustibles pour la production d&#39;ATP au cours d&#39;une des différences intrinsèques rapides ou prolongées dans le métabolisme de carburant entre les génotypes, par exemple.

<table><tbody><tr><td>ACIDE PAMITIQUE, [1-14C]-, 50 & micro ; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 & micro ; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&micro ; Ci</td><td>PerkinFlacons</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>drosophile, étroits, polystyrène</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène à fond rond, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nylon nitex, 120 & micro ; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml flacons à scintillation en verre borosilicate Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon supérieur de la fiole avec trou décentré</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Puits central en polypropylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre en microfibre de verre Whatman GF/B, cercle, 2,1 cm de diamètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à scintillation de 6 ml avec bouchons à pression/vissage</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué substrats en<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

La puissance de la génétique de Drosophila est de plus appliquée aux questions de la signalisation hormonale et le métabolisme et le développement de modèles de maladies humaines dans cet organisme. Des méthodes sensibles pour la mesure de paramètres tels que les taux métaboliques sont nécessaires pour conduire la compréhension de la physiologie et de la maladie chez les petits animaux tels que la mouche des fruits. La méthode décrite ici évalue l&#39; oxydation du carburant dans un petit nombre de mouches adultes nourris avec des aliments contenant des quantités infimes de 14 substrats de carbone marqué tels que le glucose ou un acide gras. Après la période d&#39;alimentation et toutes les manipulations expérimentales supplémentaires, les mouches sont transférés dans des tubes courts coiffés de maille, qui sont ensuite placés dans des flacons en verre contenant du papier filtre de KOH saturé qui emprisonne exhalé, CO radiomarqué 2 produite à partir de l&#39; oxydation des substrats radiomarqués comme le bicarbonate de potassium, KHCO 3. Ce bicarbonate radiomarqué est mesurée par comptage par scintillation. Ceci est aqapproche QUANTITATIVE, reproductible et simple pour l&#39;étude de l&#39;oxydation du carburant. L&#39;utilisation du glucose radiomarqué, des acides gras, ou des acides aminés permet de déterminer la contribution de ces sources de carburant différentes pour le métabolisme énergétique dans des conditions différentes telles que l&#39;alimentation et le jeûne et dans différents contextes génétiques. Cela vient compléter d&#39; autres approches utilisées pour mesurer dans le métabolisme énergétique vivo et devrait favoriser la compréhension de la régulation métabolique.

La quantité d&#39;exhalé et piégés CO 2 radiomarqué qui est produite par le métabolisme d&#39;un substrat radioactif doit être en corrélation avec le nombre de mouches dans une nacelle volante ainsi que la quantité de temps que les animaux passent dans l&#39;appareil de collecte de CO 2. Pour tester cela, les mouches qui ont jeûné pendant 18 heures ont été nourris avec l&#39; acide palmitique radiomarqué (0,02 uCi / alimentaire ul) pendant 2 heures puis testées pour le CO radiomarqué 2 production dans des groupes de 12 ou 25 animaux pendant 3 ou 6 incubations h. La quantité de CO 2 produite par 25 mouches était presque le double de la quantité produite par 12 mouches, et le montant pour chaque groupe a doublé lorsque le temps d&#39;incubation a été augmentée de 3 h à 6 h (figure 2A). Le pmol 14 CO 2 / fly / h était à peu près équivalente dans chaque groupe. Le jeûne stimule la dégradation des acides gras par ß oxidation; par conséquent , la production de CO 2 à partir de l&#39; oxydation des acides gras doit être élevée chez les animaux à jeun par rapport aux animaux nourris. Pour déterminer si tel était le cas, de 18 h à jeun mouches ont été nourris avec l&#39;acide palmitique radiomarqué pendant 2 heures. Suite à cette impulsion d&#39;alimentation à court, les mouches ont été divisés en deux groupes et transférés à la nourriture à la mouche sans étiquette ou 1% d&#39;agar pendant 3 heures, puis transférés à voler gousses pendant 2 heures. Dans deux expériences distinctes, les mouches chassé sur gélose produit CO significativement plus radiomarqué 2 par rapport aux mouches chassés sur les aliments (figure 2B), ce qui indique que l&#39; oxydation ß a augmenté chez les animaux à jeun. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;appareil pour collecter exhalé, radiomarqué CO 2. Les mouches qui ont consommé des substrats métaboliques radiomarqués sontplacé dans un &quot;pod fly&quot; (FP), un tube de coupure de centrifugeuse plafonné à mailles (M). La nacelle volante est placée dans un 20 ml à scintillation en verre du flacon et coiffé d&#39;un bouchon de bouchon en caoutchouc (S) contenant un trou décentré, à travers lequel est placé un puits central (CW) qui contient un papier filtre GF / B saturé avec 100 ul 5% de KOH. Exhalée de CO 2 réagit avec le KOH et est piégé sur le papier filtre sous forme de bicarbonate. Pris au piège, CO 2 radiomarqué peut être quantifiée par comptage par scintillation de papier filtre saturé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Figure 2. 14 CO 2 corrélats production avec le temps et le nombre de mouches dans unFly Pod et répond à la Fed et des conditions de jeûne. (A) La quantité de 14 CO 2 produit en vol alimenté palmitate radiomarqué est en corrélation avec le nombre de mouches testés (n = 12 (barres ouvertes) ou 25 (barres fermées)) et le temps passé dans une nacelle de mouche (3 ou 6 heures ). Sur une base par-mouche, mouches produites 0,99, 1,13, 1,10 et 1,01 pmol 14 CO 2 / h (données énumérées dans le même ordre de gauche à droite comme les données du graphique). (B) Les mouches qui ont été chassés sur gélose oxydée plus radiomarqué palmitate que les mouches qui ont été chassés de la nourriture. Les données proviennent de deux expériences et sont présentés en tant que moyen écart type, n = 16 - 17 mouches / groupe (expérience 1); n = 10 mouches / groupe (expérience 2). * P = 0,017, test t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Cet article décrit une méthode de mesure de l’oxydation du carburant chez Drosophila melanogaster dans laquelle des traces de substrats métaboliques spécifiques radiomarqués sont administrées à des mouches. LeCO2 radiomarqué expiré qui est produit par l’oxydation du combustible est collecté et mesuré.

Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

L'objectif général de ce protocole est de mesurer le dioxyde de carbone produit par des mouches drosophiles intactes, en utilisant des substrats radiomarqués tels que l'acide palmitique ou le glucose. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les chercheurs travaillant sur Drosophila, par exemple si une mutation donnée pourrait affecter le métabolisme énergétique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet des mesures quantitatives, sensibles et reproductibles de l'oxydation des carburants chez un petit nombre de mouches drosophiles.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de montage du dispositif expérimental avec les mouches exigent une manipulation rapide de pièces de petite taille afin d'assurer une construction correcte avant que les mouches ne sortent de l'anesthésie. Le carbone-14 est un émetteur bêta de faible énergie et possède une portée courte dans l'air, mais il convient néanmoins de prendre des précautions pour éviter le renversement de molécules radiomarquées ou leur ingestion accidentelle par l'expérimentateur. Mélangez un à deux microcuries de substrat radiomarqué avec 15 microlitres de colorant alimentaire bleu FD&C numéro un et de l'eau afin d'obtenir un volume total de 25 microlitres.Introduisez entièrement le mélange de substrat radiomarqué et de colorant bleu dans le fond d’un flacon vide de nourriture pour drosophiles. Étant donné que les flacons de nourriture pour drosophiles se renversent facilement, assurez-vous de les placer dans un récipient qui les empêchera de basculer. Chauffez la nourriture standard pour drosophiles au four à micro-ondes jusqu’à ce qu’elle soit juste liquéfiée.15 à 20 secondes à puissance élevée sont généralement suffisantes pour un flacon contenant 10 millilitres d'aliment. Ajouter 975 microlitres de l'aliment fondu au mélange de substrat radiomarqué et de colorant bleu, puis agiter rapidement tout en surveillant l'uniformité de la couleur bleue afin de garantir un mélange complet. Les embouts de pipette peuvent nécessiter d'être coupés avec des ciseaux pour élargir l'extrémité étroite, permettant ainsi une pipetage précis de l'aliment visqueux et fondu.Laisser refroidir et solidifier complètement l'aliment à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Un dispositif d'anesthésie au dioxyde de carbone, composé de polyéthylène poreux soudé à une base acrylique et relié à une bouteille de dioxyde de carbone équipée d'un régulateur de pression, est utilisé pour anesthésier les mouches adultes. Faire circuler du dioxyde de carbone dans le dispositif d'anesthésie à raison de cinq litres par minute.Transférez les mouches anesthésiées dans des flacons contenant de la nourriture marquée au radiotraceur et colorée en bleu. Boucher chaque flacon avec un bouchon en mousse et le placer horizontalement jusqu'à ce que les mouches se réveillent. Transférez ensuite les flacons dans un récipient en acrylique avec couvercle.Pour un alimentation à court terme, priver les mouches de nourriture pendant 18 à 24 heures avant de les transférer vers un aliment radiomarqué afin de s'assurer qu'elles mangent pendant l'étape d'alimentation de deux à trois heures. Pour une alimentation à long terme sur une période de cinq à sept jours, il n'est pas nécessaire de priver les mouches de nourriture, mais l'expérimentateur doit surveiller la teneur en eau de l'aliment radiomarqué dans les flacons, et utiliser une aiguille et une seringue pour ajouter de l'eau aux flacons dont la nourriture est sèche. Une fois la période d'alimentation avec le substrat radiomarqué terminée, transférer les mouches vers un aliment non marqué en les tapotant dans un nouveau flacon.Une période de persistance initiale de deux à quatre heures permet aux mouches d'éliminer les particules alimentaires marquées radioactivement de leur cuticule et assure la digestion des aliments marqués radioactivement restant dans l'intestin. Surveillez la progression de l'aliment dans l'intestin par observation visuelle des mouches afin de détecter d'éventuels abdomens bleus. Ensuite, transférez les mouches vers différents types d'aliment ou à différentes températures ambiante.La durée de cette période de traçage varie selon l'expérience réalisée. Avant de préparer le dispositif de collecte du dioxyde de carbone, rassemblez les matériaux nécessaires à la fabrication des « fly pods », qui sont des tubes munis d'un bouchon en maille et destinés à contenir des mouches marquées au glucose C-14 ou à l'acide palmitique C-14, tout en restant ouverts à l'atmosphère. Fixez une lame de rasoir à l’aide d’un hémostat, chauffez-la dans la flamme d’un bec Bunsen jusqu’à ce qu’elle devienne rouge incandescente, puis utilisez la lame chauffée pour couper les 50 millimètres supérieurs de tubes en polypropylène de 12 millimètres de diamètre sur 75 millimètres de longueur, afin d’obtenir des tubes de 25 millimètres de longueur à fond arrondi.Préparer des carrés de 35 millimètres sur 35 millimètres en filet de nylon de 130 microns. Couper plusieurs morceaux de ruban transparent d'une longueur d'un pouce et demi à deux pouces. Ensuite, assembler les matériaux nécessaires à l'appareil de collecte du dioxyde de carbone.Pour chaque cage à mouches, préparez un flacon en verre de 20 millilitres pour scintillation, un bouchon en caoutchouc percé d'un trou décentré, un puits central et du papier filtre en microfibre de verre de grade GFB. Insérez le puits central à travers le trou du bouchon supérieur. Préparez de l'hydroxyde de potassium à 5 % frais le jour même de son utilisation.Juste avant d'endormir les mouches pour les transférer dans la capsule à mouches, pliez et placez le papier filtre GFB circulaire dans le puits central, en le passant par le trou du bouchon supérieur en caoutchouc, puis imbibez-le de 100 microlitres de solution d'hydroxyde de potassium à 5 %. Le transfert des mouches anesthésiées dans les capsules à mouches constitue l'étape la plus délicate de ce protocole. Pour garantir le succès de cette manipulation, tenez tous les matériaux nécessaires à portée de main et travaillez rapidement afin de limiter l'exposition des mouches au dioxyde de carbone et d'éviter qu'elles se réveillent et s'échappent avant que la maille ne soit solidement fixée au tube.Après les incubations sur milieux non étiquetés, anesthésiez les mouches au dioxyde de carbone. Brossez les mouches anesthésiées dans le tube en polypropylène coupé, fermez-le avec le maillage en nylon, puis utilisez du ruban transparent pour fixer le maillage au tube. Un nombre égal de mouches doit être utilisé dans chaque logement à mouches pour une expérience donnée.De 10 à 20 mouches par compartiment produisent une quantité suffisante de dioxyde de carbone radiomarqué pour être mesurée par comptage par scintillation. Transférez le compartiment dans un flacon en verre de 20 millilitres pour scintillation. Bouchonnez le flacon en verre avec un bouchon en caoutchouc muni d'un puits central contenant un papier filtre GFB saturé en hydroxyde de potassium.Replier le bord large du bouchon à sommet en caoutchouc par-dessus le bord du flacon en verre pour scintillation. Placer les flacons en verre contenant les mouches dans un récipient en acrylique avec couvercle, puis incuber pendant des durées variables. À la fin de l'incubation, retirer le bouchon du flacon en verre et transférer le papier filtre GFB saturé en hydroxyde de potassium dans un flacon en plastique de six millilitres contenant quatre millilitres de cocktail de scintillation.Préparez des vials de scintillation supplémentaires, un contenant un papier filtre GFB inutilisé servant de fond, et un à deux autres vials contenant un substrat radiomarqué de 0,1 à 0,5 microcurie pour déterminer les impulsions par minute par microcurie. À l’aide d’un compteur à scintillation, mesurez les impulsions par minute pour chaque échantillon conformément au protocole du fabricant. Calculez ensuite la production totale de dioxyde de carbone comme décrit dans le texte du protocole.Les mouches ont été privées de nourriture pendant 18 heures, nourries avec de l'acide palmitique marqué pendant deux heures, puis testées pour la production de dioxyde de carbone marqué, par groupes de 12 ou 25 animaux, lors d'incubations de trois ou six heures. Comme le montre ce graphique, la quantité de dioxyde de carbone produite par 25 mouches était presque le double de celle produite par 12 mouches, et la quantité produite par chaque groupe a doublé lorsque la durée d'incubation passait de trois à six heures. La quantité de dioxyde de carbone marqué en picomoles par mouche et par heure était presque équivalente dans chaque groupe.Étant donné que le jeûne stimule la dégradation des acides gras par la β-oxydation, la production de dioxyde de carbone issue de l'oxydation des acides gras devrait être plus élevée chez les animaux à jeun par rapport aux animaux nourris. Pour tester cette hypothèse, des mouches ayant jeûné pendant 18 heures ont été nourries avec de l'acide palmitique radiomarqué pendant deux heures, réparties en deux groupes, puis transférées vers un milieu de culture non marqué ou vers de l'agar à 1 %. Dans deux expériences distinctes, les mouches placées sur agar ont produit significativement plus de dioxyde de carbone radiomarqué que celles placées sur milieu alimentaire, indiquant que la β-oxydation était augmentée chez les animaux à jeun.Après cette procédure, des méthodes complémentaires telles que la mesure de la production totale de dioxyde de carbone, de la consommation totale d'oxygène et le calcul du rapport d'échange respiratoire peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple quelle est la source de carburant préférée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser ce protocole pour déterminer l'effet d'une mutation donnée ou d'une manipulation expérimentale sur la capacité à utiliser un carburant spécifique comme source d'énergie. N'oubliez pas que le travail avec des substances radioactives peut être dangereux, et que des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et de lunettes de protection, ainsi que l'utilisation d'un blindage approprié, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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