Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en Drosophila melanogaster

L’objectif global de ce protocole est de mesurer le dioxyde de carbone produit par des mouches des fruits intactes, des substrats radiomarqués tels que l’acide palmitique ou le glucose. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les chercheurs sur la drosophile, par exemple si une mutation donnée peut affecter le métabolisme énergétique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet des mesures quantitatives, sensibles et reproductibles de l’oxydation des combustibles chez un petit nombre de mouches des fruits.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d’assemblage de la nacelle nécessitent une manipulation rapide de petites pièces pour assurer la bonne construction de l’appareil expérimental avant que les mouches ne se remettent de l’anesthésie. Le carbone 14 est un émetteur bêta de faible énergie et a une courte portée dans l’air, mais des précautions doivent tout de même être prises pour éviter le déversement de molécules radiomarquées ou l’ingestion accidentelle par l’expérimentateur. Mélangez un à deux substrats radiomarqués par microcurie avec 15 microlitres de colorant alimentaire bleu FD&C Number One et de l’eau pour obtenir un volume total de 25 microlitres.

Tête de tuyau : tout le substrat radiomarqué et le mélange de colorant bleu dans le fond d’un flacon de nourriture pour mouches vide. Étant donné que les flacons de nourriture pour mouches se renversent facilement, assurez-vous de les ranger dans un récipient qui les empêchera de basculer. Faites chauffer des aliments pour mouches standard dans un four à micro-ondes jusqu’à ce qu’ils soient à peine liquéfiés.

15 à 20 secondes à un niveau de puissance élevé sont généralement suffisantes pour un flacon contenant 10 millilitres de nourriture. Ajoutez 975 microlitres d’aliments fondus au substrat radiomarqué et au mélange de colorant bleu, et faites tourbillonner rapidement tout en surveillant l’uniformité de la couleur bleue pour assurer un mélange complet. Il peut être nécessaire de couper les pointes de la tête du tuyau avec les ciseaux pour élargir l’extrémité étroite, permettant ainsi une tête précise du viscou des aliments fondus.

Laissez les aliments refroidir et se solidifier complètement à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Un appareil d’anesthésie au dioxyde de carbone composé de polyéthylène poreux fusionné à une base acrylique et relié à un réservoir de dioxyde de carbone par un régulateur de pression est utilisé pour anesthésier les mouches adultes. Fait circuler le dioxyde de carbone dans l’appareil d’anesthésie à cinq litres par minute.

Transférez les mouches anesthésiées dans des flacons contenant des aliments teints en bleu radiomarqués. Fermez chaque flacon avec un bouchon en mousse et posez-le horizontalement jusqu’à ce que les mouches se réveillent. Transférez les flacons dans un récipient en acrylique à couvercle.

Pour une alimentation à court terme, affamez les mouches pendant 18 à 24 heures avant leur transfert dans des aliments radiomarqués pour vous assurer qu’elles mangeront pendant l’étape d’alimentation de deux à trois heures. Pour une alimentation à long terme sur une période de cinq à sept jours, les mouches n’ont pas besoin d’être affamées, mais l’expérimentateur doit surveiller la teneur en eau des aliments radiomarqués dans les flacons et utiliser une aiguille et une seringue pour ajouter de l’eau aux flacons contenant de la nourriture sèche. Lorsque la période d’alimentation par substrat radiomarqué est terminée, transférez les mouches dans des aliments non étiquetés en les tapotant dans un nouveau flacon.

Une période de chasse initiale de deux à quatre heures permet aux mouches de nettoyer les particules alimentaires radiomarquées de leurs cuticules et permet la digestion des aliments radiomarqués restant dans l’intestin. Surveillez la progression de la nourriture dans l’intestin en inspectant visuellement les mouches pour rechercher des abdomens bleus. Par la suite, transférez les mouches dans différents types d’aliments ou à des températures ambiantes.

La durée de cette période de poursuite variera en fonction de l’expérience réalisée. Avant de fabriquer l’appareil de collecte de dioxyde de carbone, assemblez des matériaux pour construire des gousses de mouches, qui sont des tubes à mailles qui contiendront des mouches étiquetées avec du glucose C-14 ou de l’acide palmitique C-14 et resteront ouverts à l’atmosphère. Serrez une lame de rasoir avec un hémostat, chauffez-la dans la flamme d’un bec Bunsen jusqu’à ce qu’elle soit rouge et utilisez la lame chauffée pour couper les 50 millimètres supérieurs de tubes en polypropylène de 12 millimètres sur 75 millimètres, laissant des tubes à fond rond de 25 millimètres de long.

Préparez des carrés de 35 millimètres sur 35 millimètres de maille de nylon de 130 microns. Coupez plusieurs morceaux de ruban adhésif transparent d’un pouce et demi à deux pouces de long. Ensuite, assemblez les matériaux pour l’appareil de collecte du dioxyde de carbone.

Pour chaque capsule de mouches, assemblez un flacon à scintillation en verre de 20 millilitres, un bouchon en caoutchouc avec un trou décentré, un puits central et du papier filtre en microfibre de verre GFB de qualité. Insérez bien le centre à travers le trou de la butée supérieure. Préparez de l’hydroxyde de potassium à 5 % frais le jour de l’utilisation.

Juste avant d’anesthésier les mouches pour les transférer dans la nacelle, pliez et placez le papier filtre GFB circulaire dans le puits central qui est enfilé à travers le trou du bouchon supérieur en caoutchouc, et saturez-le avec 100 microlitres d’hydroxyde de potassium à 5 %. Le transfert de mouches anesthésiées dans les nacelles est l’étape la plus difficile de ce protocole. Pour assurer le succès, ayez tous les matériaux nécessaires à portée de main et travaillez rapidement pour limiter l’exposition des mouches au dioxyde de carbone et pour éviter que les mouches ne se réveillent et ne s’échappent avant que le treillis n’ait été solidement fixé au tube.

Suite aux incubations sur des milieux non marqués, anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone. Brossez les mouches anesthésiées dans le tube de polypropylène coupé, recouvrez-le avec le treillis en nylon et utilisez du ruban adhésif transparent pour faire adhérer le treillis au tube. Un nombre égal de mouches doit être utilisé dans chaque gousse de mouches pour une expérience particulière.

10 à 20 mouches par gousse de mouche produisent suffisamment de dioxyde de carbone radiomarqué pour la mesure par comptage par scintillation. Transférez la capsule de mouche dans le flacon à scintillation en verre de 20 millilitres. Boucher le flacon en verre avec le bouchon en caoutchouc, en tenant un puits central contenant du papier filtre GFB saturé d’hydroxyde de potassium.

Repliez le large haut du bouchon en caoutchouc sur le rebord du flacon à scintillation en verre. Placez les flacons en verre contenant les mouches dans un récipient en acrylique à couvercle et incubez pendant des périodes de temps variables. À la fin de l’incubation, débouchez le flacon en verre et transférez le papier filtre GFB saturé d’hydroxyde de potassium dans un flacon à scintillation en plastique de six millilitres contenant 4 millilitres de cocktail à scintillation.

Préparez des flacons à scintillation supplémentaires, l’un contenant du papier filtre GFB inutilisé pour servir de fond, et un à deux autres flacons contenant 0,1 à 0,5 substrat radiomarqué microcurie pour déterminer le nombre de points par minute par microcurie. À l’aide d’un compteur à scintillation, mesurez le nombre de compteurs par minute pour chaque échantillon selon le protocole du fabricant. Par la suite, calculer la production totale de dioxyde de carbone comme décrit dans le texte du protocole.

Les mouches ont été jeûnées pendant 18 heures, nourries avec de l’acide palmitique radiomarqué pendant deux heures, puis testées pour la production de dioxyde de carbone radiomarqué dans des groupes de 12 ou 25 animaux pendant des incubations de trois ou six heures. Comme le montre ce graphique, la quantité de dioxyde de carbone produite par 25 mouches était presque le double de la quantité produite par 12 mouches, et la quantité de chaque groupe a doublé lorsque le temps d’incubation a été augmenté de trois à six heures. Le dioxyde de carbone radiomarqué picomolaire par mouche et par heure était presque équivalent dans chaque groupe.

Étant donné que le jeûne stimule la dégradation des acides gras par oxydation bêta, la production de dioxyde de carbone par oxydation des acides gras devrait être élevée chez les animaux à jeun par rapport aux animaux nourris. Pour tester cela, des mouches à jeun de 18 heures ont été nourries avec de l’acide palmitique radiomarqué pendant deux heures, divisées en deux groupes, et transférées dans de la nourriture pour mouches non étiquetée, ou 1 % de gélose. Dans deux expériences distinctes, les mouches chassées sur gélose produisaient significativement plus de dioxyde de carbone radiomarqué que les mouches chassées sur de la nourriture, indiquant que l’oxydation bêta était accrue chez les animaux à jeun.

À la suite de cette procédure, des méthodes complémentaires telles que la mesure de la production totale de dioxyde de carbone et de la consommation totale d’oxygène, ainsi que le calcul du rapport d’échange respiratoire peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la source de carburant préférée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce protocole pour déterminer l’effet d’une mutation donnée ou d’une manipulation expérimentale sur la capacité d’utiliser un carburant spécifique comme source d’énergie. N’oubliez pas que travailler avec de la radioactivité peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et de lunettes de protection, et l’utilisation d’un blindage approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.