Name: Formant géants de taille polymersomes Utilisation Réhydratation Gel-assisté (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez la méthode de réhydratation assistée par gel pour former rapidement des vésicules géantes de polymères intacts. Cette technique permet de contrôler la distribution des tailles et offre une alternative robuste aux méthodes traditionnelles pour les applications en bioingénierie.

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Nous tenons à remercier le Dr Ian M. Henderson, Andrew Gomez et le Dr Walter F. Paxton pour leur expertise technique, leurs conseils et leur aide dans ce travail. Ce travail a été soutenu par le département américain de l’Énergie, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS et GDB ont été soutenus par BES-MSE. Ce travail a été effectué, en partie, au Center for Integrated Nanotechnologies, une installation d’utilisateurs de l’Office of Science du ministère de l’Énergie des États-Unis (DOE) (numéro de projet d’utilisateur RA2015A0004, PI : ACG).

1. Préparation des polymères et Agarose Remarque: Des gants et une blouse de laboratoire doit être porté en tout temps tout au long de ce protocole. Des lunettes de sécurité sont également nécessaires pendant le travail avec un solvant organique ou une étape avec possibilité d&#39;éclaboussures. <ol><li> Préparer une / ml, solution de 5 mg de polymère dans le chloroforme. Ajouter 1 ml de chloroforme à 5 mg de poly solide (oxyde d&#39;éthylène) - poly b- (butadiène) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) un copolymère diséquencé dans un flacon en verre et agiter pour dissoudre complètement. Effectuez toutes les étapes à l&#39;aide de chloroforme dans une hotte chimique. </li><li> Mélanger dans un lipide marqué par fluorescence (acheté déjà dissous dans du chloroforme) à un% 0,5 mol concentration finale en 99,5% en mole de polymère non marqué. <ol><li> Par exemple, une pipette ~ 12 pi de 1 mg / ml de lipide marqué par fluorescence dans du chloroforme dans 997,58 ul PEO-PBD, EO 22 -BD 37 polymère dans du chloroforme (ayant un poids moléculaire de 2950 Daltons) pour une concentration finale de 0.5% en mole de lipide marqué mélangés et 99,5% en moles de polymère. </li><li> Conserver la solution dans un flacon hermétique avec un couvercle de chloroforme résistant à -20 ° C. Enveloppez plombiers bande sur le bord du flacon où les vis de couvercle sur le flacon et fixer le couvercle sur le flacon. Envelopper un autre morceau de ruban plombiers à l&#39;extérieur du couvercle et enfin envelopper Parafilm à l&#39;extérieur de la bande pour assurer une évaporation minimale. </li></ol></li><li> Préparer une solution à 1% en poids / volume d&#39;agarose en mélangeant 0,5 mg standard d&#39;agarose dans 50 ml d&#39;eau (ou 50 ml de 100 mM de saccharose) dans un ballon Erlenmeyer de 250 ml. Faire bouillir la solution d&#39;agarose dans un micro-ondes standard pour ~ 1 min (ou jusqu&#39;à dissolution complète comme indiqué par la compensation de la solution). Remarque: La solution d&#39;agarose peut être utilisé après quelques minutes de refroidissement ou de se solidifier, stocké et refondu en utilisant la même procédure. </li></ol> 2. Agarose Film Préparation <ol><li> Coupez l&#39;extrémité hors d&#39;une pointe de pipette 1000 pi pour éviter le colmatage. Avec la pointe de coupe, pipette 300 pi de solution d&#39;agarose fondu sur un carré de 25 mm lamelle de verre directement auprès du fabricant. </li><li> Autoriser l&#39;agarose refroidir à ~ 65-75 ° C avant le dépôt. Si l&#39;agarose est trop cool, il va commencer à agglomérer sur la surface pendant le processus d&#39;étalement. A l&#39;inverse, si l&#39;agarose est trop chaud, il faudra plus d&#39;étalement pour faire adhérer l&#39;agarose à la surface. </li><li> Tenez juste le bord de la lamelle avec les doigts gantés et utiliser le bord long d&#39;une autre pointe de la pipette 1000 pi pour répandre l&#39;agarose uniformément sur toute la surface de la lamelle. Déplacez la pointe de pipette et d&#39;autre de la lamelle jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose adhère complètement et couvre la lamelle. </li><li> Placer la lamelle d&#39;agarose revêtue sur un morceau de parafilm avec l&#39;agarose vers le haut. Une fois que le nombre désiré de lamelles sont recouvertes, placer le Parafilm avec les lamelles dans un incubateur à 37 ° par rapport à déshydrater l&#39;agarose sur la surface pendant au moins 1 h. Note: Déshydratationest déterminée par la disparition de la couche visible d&#39;agarose; la lamelle devrait ressembler à plat et clair. Une fois que les films sont totalement déshydratés, stocker lamelles de la surface d&#39;agarose orientée vers le haut dans une boîte de Petri en plastique jetable. </li></ol> Formation 3. Polymer Film <ol><li> Pipette 30 pl préparés solution de polymère sur le film d&#39;agarose. </li><li> Tenez juste le bord de la lamelle avec les doigts gantés et utiliser le bord long d&#39;une aiguille de 18 G pour étendre la solution à travers les films d&#39;agarose en utilisant un mouvement circulaire d&#39;étalement. Continuer de se propager jusqu&#39;à ce que la solution est évaporée. Remarque: Faites attention à l&#39;extrémité pointue de l&#39;aiguille. </li><li> Placez les films de polymère dans un côté de polymère de boîte de Petri en plastique vers le haut et mettre la boîte de Petri dans un dessiccateur maison vide standard recouvert de papier d&#39;aluminium (pour éviter photoblanchiment du lipide marqué) pendant au moins 1 heure pour éliminer complètement tout solvant résiduel. </li></ol> 4. Formation de Polymersomes <ol><li> Adhérer un coverwell, soit un polydiméthylsiloxane fait maison (PDMS) bien (un ~ 0,5 cm d&#39;épaisseur bloc de PDMS durcis avec ~ 1 cm de diamètre au milieu poinçonnés) ou disponible dans le commerce et à la lamelle revêtue du film de polymère. Appuyez sur la coverwell doucement sur la lamelle couvre-objet revêtu de polymère avec le polymère orienté vers le haut jusqu&#39;à ce qu&#39;un joint étanche est formé entre la coverwell et la lamelle. Veillez à ne pas appuyer trop fort et briser la lamelle. </li><li> Ajouter 200-500 solution de réhydratation ul (l&#39;eau est très bien, mais un tableau de tampons ou de médias travaille également) à la chambre (volume de réhydratation dépend de la taille de l&#39;coverwell adhéré). </li><li> Créer une chambre d&#39;humidité pour réduire l&#39;évaporation de la solution de réhydratation. Placez un Kimwipe humide roulé le long des bords d&#39;une boîte de Pétri en verre. Placez le film de polymère avec le coverwell collé dans la chambre d&#39;humidité et couvrez avec un couvercle. Couvrir la boîte de Pétri avec une feuille d&#39;aluminium pour minimiser photoblanchiment. Endroitla boîte de Petri sur une plaque chauffante réglée à 40 ° C pendant au moins 30 min. </li><li> Réglez la température de la plaque chauffante pendant la réhydratation 24-70 ° C pour régler la taille des vésicules formées (figure 5). 70 ° C est proche de la T m de l&#39;agarose si la prudence doit être utilisé lors de poursuivre au - delà de cette température. </li></ol> 5. Caractérisation des polymersomes par Fluorescence Recovery après photoblanchiment (FRAP) <ol><li> Déplacer la lamelle avec le coverwell adhéré directement à un microscope inversé pour l&#39;imagerie. </li><li> Choisissez le jeu de filtres appropriés sur la base du lipide fluorescent inclus dans la solution de polymère. Pour les lipides marquées à la rhodamine dopées dans les solutions de polymère, en utilisant un filtre 560/25 nm d&#39;excitation et un filtre d&#39;émission 607/36 nm, ou d&#39;ensembles de filtres comparables. </li><li> Utiliser un objectif 100X à l&#39;huile de se concentrer sur la surface supérieure de la lamelle couvre-objet, où les polymersomes seront respectées. Si les polymersomes sont particulièrementgrande taille (&gt; 20 um) ou si le film de polymère est trop épaisse, un objectif de plus faible puissance (par exemple 40X) doit être utilisée pour mieux visualiser les polymersomes. </li><li> Identifier les polymersomes en utilisant la microscopie à fluorescence. Identifier polymersomes par le creux, la vésicule sphérique caractéristique d&#39;un diamètre&gt; 5 um. </li><li> Caractériser la fluidité de la membrane à l&#39;aide de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) sur un microscope à fluorescence comportant un condensateur réglable. En raison de la nature adhérente et l&#39;emballage serré de polymersomes sur les substrats, le mouvement naturel des polymersomes est limitée, l&#39;augmentation de la qualité de l&#39;imagerie FRAP. <ol><li> Concentrez le microscope sur la polymersome d&#39;intérêt. Fermer le condenseur à une petite région et de faire en sorte que le bord d&#39;une polymersome se trouve dans la région d&#39;imagerie d&#39;intérêt. </li><li> Augmenter l&#39;exposition de la caméra et assurer que tous les filtres de densité neutre sont enlevés pour photobleach efficacement la région d&#39;intérêt. Laisser la fl membrane<html> intensité de fluorescence photobleach pendant 30 à 60 secondes ou jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité de fluorescence est significativement diminuée. </li><li> Éteignez la lampe et ouvrir complètement le condenseur. Diminuer l&#39;exposition aux paramètres de départ et commencer immédiatement la capture d&#39;images toutes les 30 secondes pendant 3 min. </li><li> Calculer des coefficients de diffusion de la membrane en utilisant des procédés classiques 12. Si la région blanchie regagne l&#39;intensité de fluorescence au sein de l&#39;5/3 min, ce qui indique que la membrane est fluide. </li></ol></li></ol> 6. Caractérisation des polymersome Taille <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Figure 6. Procédé pour l&#39;analyse de la taille de polymersomes en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. Étape par étape les instructions sur la façon de mesurer le diamètre des vésicules formées. L&#39;utilisateur doit connaître les unités de calibrage en pixels / um du microscope utilisé.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <ol><li> Ouvrez les images de polymersomes acquises dans l&#39; image logiciel d&#39;analyse 13. </li><li> Réglez l&#39;échelle de l&#39;image en cliquant sur la case analysent déroulant et en cliquant sur &quot;échelle de jeu&quot;. <ol><li> Calibrer l&#39;échelle pour le microscope en utilisant des méthodes standards (ie, un micromètre). </li><li> Remplissez les unités de calibrage et cliquez sur &quot;ok&quot;. </li></ol></li><li> Cliquez sur la boîte à outils en ligne et tracer une ligne couvrant le diamètre d&#39;une vésicule. </li><li> Collecter les mesures de longueur en cliquant sur la case analysent déroulante et en cliquant sur &quot;mesure&quot;. </li><li> Continuer la mesure de vésicules individuelles suivant la procédure ci-dessus et chaque nouvelle mesure sera ajoutée à la fenêtre de données de mesures. </li><li> Appuyez sur &quot;Ctrl + D&quot; après le dessin de chaque ligne et de mesurer la longueur d&#39;imprimer la ligne tracée sur laimage, la rendant plus facile à suivre qui vésicules ont été analysées. </li></ol>

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Sandia National Laboratories est un laboratoire multiprogramme géré et exploité par Sandia Corporation, une filiale en propriété exclusive de Lockheed Martin Corporation, pour la National Nuclear Security Administration du département de l’Énergie des États-Unis sous le contrat DE-AC04-94AL85000.

Polymersomes sont de plus largement étudiées en tant que mimétiques de la membrane biologique. Les propriétés robustes et polyvalents de polymères les rendent très attrayant pour les études nécessitant une fonctionnalisation de la membrane, la longévité et la réactivité à l&#39;écoute. Les méthodes traditionnelles de formation de taille géante polymersomes 9,10 (&gt; 4 um) sont de main-d&#39;œuvre et nécessitent des équipements coûteux et spécialisés. Ici, nous présentons pour la première fois, une méthode rapide, polyvalent et robuste pour former polymersomes taille géantes en utilisant des réactifs de laboratoire peu coûteux et équipements standard. En utilisant un gel de réhydratation assistée, polymersomes unilamellaires peuvent être formés rapidement (&lt;30 min), dans une variété de solutions de réhydratation (y compris les milieux de culture cellulaire) et avec une variété de polymères différents (données non présentées). La formation de vésicules multilamellaires ou asymétriques n&#39;a pas été observée en utilisant cette technique. Tout au long de ce travail, nous avons utilisé le poly (oxyde d&#39;éthylène) - poly b- (butadiène) (PEO-PBM, EO 22 -BD 37) copolymère dibloc neutre. De nombreuses compositions de polymères différents (y compris les copolymères diblocs chargés) fonctionnent bien en utilisant cette méthode (non représenté). Cependant, certains copolymères triblocs disponibles dans le commerce et les copolymères de poids moléculaire élevé diblocs (~&gt; 5000 Daltons) ne forment pas polymersomes distinctes. Pour toutes les expériences de ce manuscrit, une faible concentration de lipide marqué a été dopées dans les solutions de polymères uniquement à des fins de visualisation. D&#39;autres procédés de visualisation, y compris les polymères fonctionnalisés directement avec un colorant fluorescent peuvent également être utilisés. Polymersomes peuvent également être visualisés en microscopie à champ clair, bien que la microscopie par fluorescence offre une plus grande résolution. La plupart des modifications mineures au protocole généralement ne modifient pas les résultats. Par exemple, de petites différences dans la concentration de la solution de polymère étalé sur les lamelles ne modifient pas la formation du polymère film formé. Bien que la gamme de concentration complète n&#39;a pas été déterminée, la formation de polymersome va se produire avec succès une large gamme de concentrations de films de polymère (par exemple, 1-10 mg / ml). Cependant, il y a quelques changements de protocole qui n&#39;affectent négativement la formation polymersome. Le plus notable est que les lamelles de verre rondes (au lieu de carré) résultat en très mauvais formation de polymersomes. Nous attribuons cela à l&#39;extrême, même couche d&#39;agarose sur le verre qui empêche effectivement la formation de polymersomes. L&#39;un des défis les plus remarquables de cette technique est la possibilité de récupérer les polymersomes de la surface avec un rendement élevé. Il y a certains cas où la suppression des polymersomes de la surface d&#39;origine peut être avantageux. En raison de la forte fluorescence de fond du film de polymère déshydraté, l&#39;élimination polymersomes individuelles et les faire adhérer à nettoyer les lamelles augmente la qualité de l&#39;imagerie et la caractérisation (particulièrement lors de l&#39;analyse de FRAP). Pour ce faire, pipetage doux avec une pointe de pipette dans laquelle l&#39;extrémité a été coupée va désorber les polymersomes de la surface (bien que le nombre de vésicules récupérées est significativement plus faible que ceux qui sont formés à l&#39;origine). Polymersomes peuvent alors être placés sur des surfaces de lamelle modifiées, ce qui permet la polymersome d&#39;interagir avec la nouvelle lamelle. Typiquement, pour les neutres polymersomes PEO-PBD, des lamelles couvre-traitée à l&#39;ozone pendant 15 minutes permettent aux polymersomes de tomber vers le bas à la surface pour l&#39;imagerie. Modification de surface différente est nécessaire pour différentes compositions de polymersome (par exemple, chargé négativement ou positivement les polymères). La plupart des matériaux utilisés dans ce protocole sont stockés et utilisés avec succès pendant des jours ou des semaines. L&#39;agarose solidifié peut être rebouillage et réutilisé jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose commence à avoir des agrégats, même après l&#39;ébullition, ou agarose solidifié commence à sécher. Lamelles avec des films d&#39;agarose séchés peuvent être stockés et l&#39;utilisationD indéfiniment (par exemple, des mois). Le polymère dissous dans le chloroforme peut être stocké à -20 ° C pendant plusieurs mois. Une fois le film de polymère est séché sur les films d&#39;agarose, cependant, les films doivent être stockés sous le vide et utilisé dans les deux semaines (stockage à long terme n&#39;a pas été déterminée directement, mais il existe des différences notables dans polymersomes formés à partir de films de polymère de plus de deux semaines). En utilisant le protocole de réhydratation assistée gel présenté ici, des centaines de polymersomes-forme uniforme sont formés rapidement avec seulement quelques heures de travail en utilisant un équipement standard et réactifs de laboratoire peu coûteux. En outre, polymersomes peuvent être formés dans une variété de solutions de tampon physiologique et à partir de différentes compositions de polymère (non représenté). Des modifications mineures à la méthode ne modifient pas de façon négative la formation de polymersomes, ce qui rend la réhydratation assistée par un gel d&#39; une technique souple et accessible aux scientifiques avec e variant techniquexpertise. La possibilité de créer facilement polymersomes géants à l&#39;échelle de la taille des cellules est essentielle pour la construction de systèmes analogues à des cellules artificielles. La facilité d&#39;utilisation et la polyvalence de réhydratation assistée gel pour rendre ces polymersomes offre un énorme progrès dans le domaine biomimétique pour la création d&#39;imite la membrane cellulaire robustes. Par exemple, en utilisant cette technique, les stratégies pour l&#39;encapsulation des différents composants intracellulaires, fonctionnalisation du polymère avec des protéines et l&#39;incorporation de protéines de transport membranaire membrane cellulaire, pour ne citer que quelques-uns, peuvent être conçus pour construire des cellules artificielles à base polymersome.

Création de vésicules synthétiques cellulaires taille géantes unilamellaires (GUVs) est d&#39; un intérêt croissant dans la reconstruction in vitro de différents processus cellulaires pour construire un cadre pour la génération d&#39;un système 1,2 cellulaire comme artificielle. Bien que GUVs composés de membranes lipidiques sont excellentes, imite des membranes biologiques naturelles, ils sont instables contre les fluctuations de l&#39;environnement et ont une durée de vie assez courte. En raison de ces limitations, les copolymères à blocs amphiphiles ont été utilisés comme mimétiques lipidiques pour former des vésicules de polymères, ou polymersomes. Dans ce contexte, polymersomes sont avantageux dans le développement de systèmes de cellules biomimétiques en raison de leur stabilité accrue 3, polyvalence chimique 4,5 et traits physiques modifiables 6 - 8. Les méthodes actuelles pour former polymersomes géants de taille comprennent électroformation 9 et réhydratation templated 10, les deux wUEL sont temps, l&#39;équipement de main-d&#39;œuvre, exigent spécialisée et de produire de faibles rendements de polymersomes géants intacts. Procédé de réhydratation assistée gel simple a été récemment mis au point pour la production de lipides GUVs 11. Ici, nous décrivons une adaptation de la technique de réhydratation assistée gel pour créer polymersomes géantes avec des compositions de polymères différentes, la taille contrôlée, ainsi que dans diverses compositions tampons. En bref, 1% p / v de films électrophorèse d&#39;agarose de gel d&#39;ADN standard sont déshydratés sur une lamelle de verre. solutions de polymère préparées dans du chloroforme sont ensuite répartis à travers le film d&#39;agarose déshydraté et laisser évaporer. À la suite de l&#39;élimination complète du solvant, les films polymères sont réhydratés dans le tampon de choix avec un chauffage modéré (40-70 ° C) et géant (&gt; 4 pm) polymersomes taille sont formées dans les 30 minutes. Cette méthode produit rapidement des centaines de totalement intacts, polymersomes bien formés à l&#39;aide de l&#39;équipement et Reagen standard de laboratoirets à des coûts minimes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique illustrant le procédé de réhydratation assistée par un gel. Polymersomes géantes composées d&#39;un copolymère à deux blocs sont formés après environ 30 minutes de réhydratation. Le bloc hydrophile est notée en magenta et le bloc hydrophobe est noté en vert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Fiole Erlenmeyer 125 ml</td><td>VWR</td><td>89000-360</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 18</td><td>VWR</td><td>BD-305196</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles carrées de 25 mm</td><td>VWR</td><td>48366-089</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Une agarose standard pour électrophorèse sur gel d’ADN</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma</td><td>288306-2L</td><td></td></tr><tr><td>Puits</td> <td>de recouvrement commercialMicroscopie électronique Sciences</td><td>70336</td><td>Press-to-Seal Isolateurs en silicone</td></tr><tr><td>Fidji Logiciel d’analyse d’images ImageJ</td><td></td><td></td><td>Téléchargement gratuit : http://fiji.sc/Fiji&nbsp;&nbsp ;</td></tr><tr><td>Flacon en verre avec couvercle en téflon</td><td>VWR</td><td>66009-556</td><td>capacité de 1,9 ml, caisse de 144</td></tr><tr><td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td>1 mg de lipides à une concentration de 1 mg/ml dans le chloroforme</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td>10,2 cm x 38,1 m</td></tr><tr><td>poly(oxyde d’éthylène)-b-poly(butadiène) ou PEO-PBD (d’un poids moléculaire de 2 940)Source de</td> <td>polymère</td><td>P2904-BdEO</td><td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri Pastic</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Ruban téflon</td><td>VWR</td><td>300001-057</td><td>1/2 » largeur</td></tr></tbody></table>

formant géants de taille polymersomes utilisation réhydratation gel-assisté

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Les vésicules polymères, ou polymères, sont largement explorées en tant qu’analogues synthétiques des vésicules lipidiques en raison de leur stabilité, de leur robustesse, de leurs propriétés barrières, de leur polyvalence chimique et de leurs caractéristiques physiques réglables. Cependant, les méthodes typiques utilisées pour préparer des vésicules de taille géante (> 4 μm) demandent à la fois beaucoup de temps et de main-d’œuvre, produisant un faible nombre de polymères intacts. Ici, nous présentons pour la première fois l’utilisation de la réhydratation assistée par gel pour la formation rapide et à haut rendement de vésicules polymères géantes (>4 μm) (polymères). En utilisant cette méthode, les polymères peuvent être formés à partir d’un large éventail de solutions de réhydratation, y compris plusieurs tampons physiologiquement compatibles différents et des milieux de culture cellulaire complets, ce qui les rend facilement utiles pour les études de biomimétisme. Cette technique est également capable de produire de manière fiable des polymères à partir de différentes compositions de polymères avec de bien meilleurs rendements et beaucoup moins de difficultés que les méthodes traditionnelles. La taille des polymères est facilement ajustable en modifiant la température pendant la réhydratation ou en ajoutant des fluidiseurs à membrane à la membrane polymère, générant des polymères de taille géante (>100 μm).

Polymersomes ont été formées en utilisant la procédure décrite ci - dessus (figure 1) et l&#39;équipement de laboratoire usuel représenté sur la figure 2. Polymersomes ont été réhydratés avec de l&#39; eau déminéralisée (figure 3) et imagée sur un microscope inversé à épifluorescence en utilisant un objectif de l&#39; huile 100X. Notez que si polymersomes ne sont pas visibles, ils auraient formé à des tailles trop grandes pour capturer avec un objectif d&#39;huile 100X; un objectif de plus faible puissance peut devoir être utilisés à la place. L&#39;un des avantages de l&#39;utilisation de la réhydratation assistée gel est la polyvalence de formation polymersomes dans une variété de solutions de réhydratation. Polymersomes ont été formés avec succès dans de l&#39; eau déminéralisée, un milieu complet de culture de cellules de mammifère, des solutions de saccharose et deux solutions tampons physiologiquement pertinentes (tampon phosphate salin (PBS) ou une solution saline tamponnée au Tris (TBS)), comme illustré sur la figure 4. Dans des conditions standard (réhydratationavec de l&#39; eau à 40 ° C pendant 1 heure), plus grande que ~ 70 polymersomes se trouvent généralement par 40 x 40 um 2 champ de vision. Alors que la production de surface de polymersomes est pas homogène, il y a des dizaines de champs de vision avec ce rendement représentatif. En outre, polymersomes étaient stables en solution pendant au moins 24 heures. taille de polymersomes a été facilement réglé en réhydratant films de polymère à des températures variables. Polymersomes formés dans de l&#39;eau déminéralisée à la température ambiante avaient un diamètre moyen de 2,9 ± 0,7 pm. Étant donné que les augmentations de température au cours de la réhydratation, la taille moyenne des polymersomes augmente également ( voir le tableau 1). A des températures élevées (&gt; 60 ° C), polymersomes formés avec des tailles encore plus grande que 100 um (figure 5). Tout traitement de l&#39; image a été réalisée en utilisant open-source du logiciel d&#39;imagerie (Figure 6).Des images recueillies ont été ouverts dans le programme logiciel. La taille de pixel calibré a été conclu mis boîte à grande échelle. Utilisation de l&#39;outil de ligne, les lignes ont été tirées à travers les diamètres. Après chaque ligne a été établi, la longueur calibrée a été mesurée et ajoutée à la zone de résultats. Les données peuvent alors être tracée dans le logiciel mathématique de choix (par exemple, Excel, Prism, origine, etc.) <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Figure 2. Image du matériel de laboratoire commun et peu coûteux nécessaires à la formation de polymersomes Les éléments requis sont: Parafilm, 18,5 aiguille G, polymère dans le chloroforme ou un autre solvant approprié, une pointe de pipette 1000 pi, une fiole d&#39; Erlenmeyer, pince à épiler, agarose, 25 mm lamelles carrés, PDMS puits d&#39;imagerie et une boîte de Pétri en verre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour</a>voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Figure 3. Les photos de la méthode de réhydratation assistée gel. Dissous agarose est étalé sur une lamelle carré de 25 mm jusqu&#39;à ce qu&#39;un même manteaux de film l&#39;ensemble lamelle. Lamelles sont ensuite placés dans un incubateur à 37 ° et le film est déshydraté. Une solution de polymère est déposée sur le film d&#39;agarose déshydraté et étalée à l&#39;aide d&#39;une aiguille dans un mouvement circulaire. La lamelle est ensuite placer dans un dessiccateur O / N pour évaporer complètement tous les résidus de solvants. Enfin, et la chambre d&#39;imagerie est collée sur le substrat et les polymères sont réhydraté avec une solution de choix et placé dans une boîte de Pétri à 40 ° C pendant moins de 25 min pour permettre la formation de polymersomes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </p<html> &gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Figure 4. polymersomes peuvent se former dans une variété de différents tampons. Des films polymères PEO-PBD ont été réhydratés avec le tampon indiqué à 40 ° C pendant 1 heure. Barre d&#39;échelle = 10 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> La Figure 5. L&#39; augmentation de la température lors de la réhydratation augmente la taille des polymersomes. Épifluorescence images représentatives de polymersomes formés dans l&#39; eau à la température de réhydratation indiquées. L&#39;augmentation de température entraîne de plus grandes polymersomes. Barre d&#39;échelle = 10 pm._blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Température (° C) </td><td> Taille moyenne (pm) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2,93 ± 0,7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5,76 ± 2,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6,65 ± 2,4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11,46 ± 5,8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7,0 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. L&#39; augmentation de la température au cours des résultats de réhydratation en augmentation de la taille de polymersome. Diamètres moyenne pour plus de 100 polymersomes dans l&#39; eau par différentes conditions de température ont été calculés et sont représentés ici. L&#39;erreur est l&#39;écart type.

Nous présentons un protocole permettant de former rapidement des vésicules géantes en polymère (pGVs). En bref, les solutions polymères sont déshydratées sur des films d’agarose séchés collés à des lamelles. La réhydratation des films polymères entraîne la formation rapide de pGV. Cette méthode fait progresser considérablement la préparation de vésicules géantes synthétiques pour des applications directes dans les études biomimétiques.

Formant géants de taille polymersomes Utilisation Réhydratation Gel-assisté

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

Le but général de cette méthode de réhydratation assistée par gel est de former de manière robuste des vésicules géantes polymériques unilamellaires intactes, dont la distribution de taille peut être facilement contrôlée. Cette méthode constitue une alternative robuste pour la formation de vésicules polymériques, qui peuvent être utilisées pour étudier les propriétés physiques de la membrane, puis intégrer ces vésicules dans des applications de bio-ingénierie. Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité de produire facilement des centaines de vésicules géantes polymériques intactes beaucoup plus rapidement et de manière moins laborieuse que les techniques traditionnelles.Ainsi, l'idée est née lorsque nous avons découvert la technique de réhydratation assistée par gel pour former des vésicules lipidiques géantes. Nos méthodes actuelles de formation de polymersomes géants sont toutefois difficiles et souvent peu productives, nous avons donc décidé d'utiliser cette méthodologie comme approche alternative. Commencez la préparation de la solution polymérique en vortexant cinq milligrammes de copolymère dibloc PEO-PBD dans un millilitre de chloroforme dans un flacon en verre jusqu'à dissolution complète.Ajoutez une solution de polymère à cinq milligrammes par millilitre dans du chloroforme et une solution de lipide marqué au fluorochrome à un milligramme par millilitre dans du chloroforme dans un nouveau flacon, jusqu'à l'obtention d'une concentration finale de 99,5 pour cent molaire de polymère et de 0,5 pour cent de lipide. Pour minimiser l'évaporation, transférez la solution de polymère dans un flacon hermétique muni d'un couvercle résistant au chloroforme, et conservez-la à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pour commencer la préparation du film d'agarose, ajoutez 50 millilitres d'eau et 0,5 gramme d'agarose standard dans un ballon Erlenmeyer de 250 millilitres.Faites bouillir pendant une minute au micro-ondes. Avant de poursuivre, laissez refroidir la solution d'agarose entre 65 et 75 degrés Celsius afin d'éviter une mauvaise adhérence ou la formation d'agrégats. Ensuite, coupez l'extrémité d'une pipette de 1000 microlitres et utilisez-la pour prélever 300 microlitres de la solution d'agarose que vous déposez sur un coverslip carré en verre de 25 millilitres.En portant des gants, tenez le bord de la lame et étalez l'agarose uniformément sur toute la surface à l'aide du bord long d'une autre pointe de pipette de 1000 microlitres. Placez la lame, côté agarose vers le haut, sur du parafilm et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Ensuite, pipetez 30 microlitres de la solution polymère préparée précédemment sur la lame recouverte de film d'agarose.Tenez le bord de la lame à couvrir avec les doigts gantés et étalez la solution polymère sur le film d'agarose en effectuant un mouvement circulaire à l’aide du bord long d’une aiguille de 18 gauge. Terminez en plaçant la lame à couvrir, côté polymère vers le haut, dans une boîte de Pétri en plastique placée à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide. Mettez le dessiccateur sous vide pendant au moins une heure afin d’éliminer tout solvant résiduel.Pour former des polymersomes, commencez par fixer une chambre de couverture sur le côté polymère du coverslip revêtu en appuyant doucement jusqu'à l'obtention d'un joint étanche. Ensuite, ajoutez de 200 à 500 microlitres de solution de réhydratation dans la chambre. Puis, placez un essuie-tout de laboratoire humide et roulé le long du bord intérieur d'une boîte de Pétri en verre afin de créer une chambre d'humidité.Placer la lame avec le puits de couverture adhéré dans la boîte et la recouvrir d'un couvercle. Couvrir la boîte de Pétri avec du papier d'aluminium pour minimiser le photoblanchiment, puis la placer sur un agitateur magnétique chauffant à 40 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes afin de terminer la formation des polymersomes. Pour commencer le processus d'imagerie FRAP, placer la lame avec le puits de couverture adhéré sur la platine d'un microscope à fluorescence inversé équipé d'un condenseur réglable.Ensuite, sélectionnez un jeu de filtres en fonction du lipide fluorescent utilisé et observez les polymersomes sur la surface supérieure du coverslip à l’aide d’un objectif à immersion huile de 100X. Pour caractériser la fluidité membranaire par FRAP, commencez par faire le point sur un polymersome, puis fermez le condenseur du microscope en le réglant sur une petite ouverture et assurez-vous que les bords du polymersome se situent à l’intérieur du champ d’image. Augmentez ensuite le temps d’exposition de la caméra, retirez tous les filtres neutres et laissez la région d’intérêt se photodégrader pendant 30 à 60 secondes.Enfin, éteignez la lampe et ouvrez complètement le condenseur. Réduisez l'exposition aux réglages initiaux et capturez des images toutes les 30 secondes pendant trois minutes. Ouvrez le logiciel d'analyse d'image sur l'ordinateur du microscope et chargez les images acquises des polymersomes.Définissez l'échelle de mesure en ouvrant le menu déroulant Analyser et en sélectionnant l'option Définir l'échelle. Saisissez les unités de calibration appropriées pour la distance en pixels, la distance connue et l'unité de longueur, puis cliquez sur OK. Ensuite, utilisez la boîte à outils de ligne et tracez une ligne couvrant le diamètre d'un polymersome sélectionné.Mesurez le diamètre du polymersome en ouvrant le menu déroulant Analyser et en sélectionnant Mesurer. Pour faciliter l'analyse, utilisez Ctrl + D afin d'imprimer la ligne de mesure sur l'image avant de passer au polymersome suivant. Continuez à mesurer les polymersomes en utilisant la procédure décrite ci-dessus et ajoutez chaque mesure à la fenêtre de données jusqu'à ce que l'ensemble des mesures soit terminé.Enfin, enregistrez les données en cliquant sur Fichier puis sur Enregistrer sous. Cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre qui s'ouvre, puis ouvrez le fichier de résultats sous forme de feuille de calcul pour analyser les données. Des polymersomes formés à partir de films polymériques PEO-PBD réhydratés avec divers tampons ont été observés par microscopie de fluorescence. Les images montrent que les polymersomes présentent une taille non homogène selon les différentes conditions de réhydratation, avec un diamètre généralement inférieur à 10 micromètres.Des images d'épifluorescence de polymersomes formés dans l'eau à différentes températures montrent que, lorsque la température de réhydratation augmente, des polymersomes de plus grande taille sont formés. Les diamètres moyens de plus de 100 polymersomes formés dans l'eau à différentes températures de réhydratation ont été calculés. À 24 degrés Celsius, le diamètre moyen était de 2,93 micromètres, augmentant jusqu'à 14,04 micromètres à 70 degrés Celsius.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir les polymersomes en solution en tout temps. Veillez à ce que la chambre soit solidement fixée sur la lame afin d'éviter toute fuite de la solution de réhydratation et tout dessèchement des polymersomes.Après avoir suivi cette procédure, des méthodes telles que la microscopie électronique peuvent être utilisées pour comprendre davantage les propriétés structurales des polymèresomes. Cette technique ouvre la voie à des recherches en biologie synthétique et en génie biologique afin d'explorer les polymèresomes comme alternative robuste et chimiquement modulable aux membranes lipidiques pour les interfaces abiotiques-biotiques, la recherche sur la délivrance de médicaments et les systèmes de protocellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la formation robuste de polymèresomes géants par réhydratation assistée par gel, du réglage de la taille globale des vésicules et de la caractérisation de l'intégrité de leur membrane.N'oubliez pas que le travail avec le chloroforme, l'agarose ou les aiguilles peut présenter des dangers. Soyez très attentif lors de l'exécution de ces procédures. Prenez des précautions telles que de travailler sous une hotte aspirante et d'utiliser en permanence des lunettes de protection et des gants.

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