Formant géants de taille polymersomes Utilisation Réhydratation Gel-assisté

L’objectif global de cette méthode de réhydratation assistée par gel est de former de manière robuste des vésicules polymères géantes unilamellaires intactes dans lesquelles la distribution de la taille des vésicules peut être facilement contrôlée. Cette méthode offre une alternative robuste pour la formation de vésicules polymères, qui peut être utilisée pour étudier les propriétés physiques de la membrane, puis intégrer ces vésicules dans des applications de bio-ingénierie. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de produire facilement des centaines de vésicules géantes en polymère intactes beaucoup plus rapidement et d’une manière moins exigeante en main-d’œuvre que les techniques traditionnelles.

L’idée est donc née lorsque nous avons appris l’existence de la technique de réhydratation assistée par gel pour former des vésicules lipidiques géantes. Cependant, nos méthodes actuelles de formation de polymères géants sont difficiles et souvent à faible rendement, nous avons donc décidé d’utiliser cette méthodologie comme approche alternative. Commencez la préparation de la solution polymère en faisant tourbillonner cinq milligrammes de copolymère dibloc PEO-PBD dans un millilitre de chloroforme dans un flacon en verre jusqu’à dissolution complète.

Ajouter une solution de polymère et de chloroforme de cinq milligrammes par millilitre et une solution de lipides et de chloroformes marqués par fluorescence dans un nouveau flacon jusqu’à l’obtention d’une concentration finale de 99,5 % de polymère et de 0,5 % de lipides. Pour minimiser l’évaporation, transférez la solution polymère dans un flacon hermétique avec un couvercle résistant au chloroforme et stockez-la à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pour commencer la préparation du film d’agarose, ajoutez 50 millilitres d’eau et 0,5 gramme d’agarose standard dans un erlenmeyer de 250 millilitres.

Faites bouillir pendant une minute à l’aide d’un micro-ondes. Avant de continuer, refroidissez la solution d’agarose entre 65 et 75 degrés Celsius pour éviter une mauvaise adhérence ou des agglutinations. Ensuite, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et utilisez-la pour pipeter 300 microlitres de la solution d’agarose sur une lamelle carrée en verre de 25 millilitres.

Tout en portant des gants, tenez le bord de la lamelle et répartissez l’agarose uniformément sur toute la surface à l’aide du bord long d’une autre pointe de pipette de 1000 microlitres. Placez la lamelle de couverture côté agarose vers le haut sur le parafilm et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Continuez en pipetant 30 microlitres de la solution polymère préalablement préparée sur la lamelle recouverte d’un film d’agarose.

Tenez le bord de la lamelle avec des doigts gantés et étalez la solution polymère sur le film d’agarose dans un mouvement circulaire à l’aide du bord long d’une aiguille de calibre 18. Terminez en plaçant la lamelle, côté polymère vers le haut, dans une boîte de Pétri en plastique à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide. Évacuez le dessiccateur pendant au moins une heure pour éliminer tout solvant résiduel.

Pour former des polymères, collez d’abord bien un couvercle sur le côté polymère de la lamelle recouverte en appuyant doucement jusqu’à ce qu’un joint étanche se forme. Ensuite, ajoutez 200 à 500 microlitres de solution de réhydratation dans la chambre. Ensuite, placez une lingette de laboratoire roulée humide le long du bord intérieur d’une boîte de Pétri en verre pour former une chambre d’humidité.

Placez la lamelle avec le couvercle collé bien dans le plat et couvrez-le avec un couvercle. Couvrez la boîte de Pétri avec du papier d’aluminium pour minimiser le photoblanchiment, puis placez-la sur une plaque chauffante à 40 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour terminer la formation des polymères. Pour commencer le processus d’imagerie FRAP, placez la lamelle avec le couvercle collé bien sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un condenseur réglable.

Ensuite, sélectionnez un ensemble de filtres en fonction du lipide fluorescent utilisé et imagez les polymères sur la surface supérieure de la lamelle à l’aide d’un objectif à huile 100X. Pour caractériser la fluidité membranaire à l’aide de FRAP, concentrez-vous d’abord sur un polymère, puis fermez le condenseur du microscope à une petite ouverture et assurez-vous que les bords du polymère se trouvent dans le champ de l’image. Par la suite, augmentez l’exposition de l’appareil photo, retirez tous les filtres de densité neutre et laissez la région d’intérêt blanchir pendant 30 à 60 secondes.

Enfin, éteignez la lampe et ouvrez complètement le condenseur. Diminuez l’exposition aux paramètres de départ et capturez des images toutes les 30 secondes pendant trois minutes. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images sur l’ordinateur du microscope et chargez les images acquises des polymères.

Définissez l’échelle de mesure en ouvrant le menu déroulant Analyser et en sélectionnant l’option Définir l’échelle. Entrez les unités d’étalonnage appropriées pour la distance en pixels, la distance connue et l’unité de longueur, puis sélectionnez OK. Ensuite, utilisez la boîte à outils de lignes et tracez une ligne couvrant le diamètre d’un polymère sélectionné.

Mesurez le diamètre du polymère en ouvrant le menu déroulant Analyser et en sélectionnant Mesurer. Pour faciliter l’analyse, utilisez control plus D pour imprimer la ligne de mesure sur l’image avant de passer au polymère suivant. Continuez à mesurer les polymères en utilisant la procédure ci-dessus et ajoutez chaque mesure à la fenêtre de données jusqu’à ce qu’elle soit complète.

Enfin, enregistrez les données en cliquant sur Fichier et Enregistrer sous.Cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre qui s’ouvre, puis ouvrez le fichier de résultats sous forme de feuille de calcul pour analyser les données. Des polymères formés à partir de films polymères PEO-PBD réhydratés avec divers tampons ont été imagés à l’aide de la microscopie à fluorescence. Les images montrent que les polymères sont de taille non homogène dans les différentes conditions de réhydratation, avec un diamètre généralement inférieur à 10 micromètres.

Des images d’épifluorescence de polymères formés dans l’eau à différentes températures montrent que lorsque la température de réhydratation augmente, des polymères plus gros se forment. Les diamètres moyens de plus de 100 polymères formés dans l’eau à différentes températures de réhydratation ont été calculés. À 24 degrés Celsius, le diamètre moyen était de 2,93 micromètres, augmentant jusqu’à 14,04 micromètres à 70 degrés Celsius.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de garder les polymères en solution à tout moment. Assurez-vous que le puits de couverture est solidement fixé à la lamelle pour éviter les fuites de la solution de réhydratation et le séchage des polymères.

À la suite de cette procédure, des méthodes telles que la microscopie électronique peuvent être utilisées pour comprendre des propriétés structurelles supplémentaires des polymères. Cette technique ouvre la voie à la recherche en biologie synthétique et en bio-ingénierie pour explorer les polymères en tant qu’alternative robuste et chimiquement adaptable aux membranes lipidiques pour la recherche et l’interface abiotique-biotique, la recherche sur l’administration de médicaments et les systèmes protocellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de former de manière robuste des polymères géants à l’aide de la réhydratation assistée par gel, d’ajuster la taille globale des vésicules et de caractériser l’intégrité de leur membrane.

N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme ou de l’agarose et des aiguilles peut être dangereux. Soyez très attentif lors de l’exécution de ces procédures. Prenez des précautions telles que travailler avec une hotte et utilisez des lunettes et des gants en tout temps.