Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

L’objectif global de cette technique de micro-injection est de générer des poissons épinoches transgéniques et modifiés par le génome pour tester la fonction des gènes et des amplificateurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en génétique du développement et de l’évolution, telles que le fonctionnement des gènes et des amplificateurs pour générer un modèle corporel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère efficacement des poissons transgéniques pour l’analyse génétique fonctionnelle.

Après avoir préparé deux plasmides et l’ARNm selon le protocole de texte, tirez au moins quatre aiguilles de micropipette dans du verre borosilicaté. Conserver verticalement dans un bocal de conservation capillaire dont les extrémités pointues sont orientées vers le bas. Pour féconder jusqu’à cent œufs d’épinoches, ajoutez 50 microlitres de solution de sperme et utilisez une pointe de pipette pour remuer doucement afin de vous assurer que tous les ovules sont fécondés.

Pendant que vous travaillez sur de la glace, remplissez au moins trois aiguilles en pipetant 0,5 microlitre de solution d’injection dans l’extrémité émoussée de l’aiguille et laissez-la s’écouler. Pendant ce temps, allumez la lumière de transillumination pour le microscope de dissection et placez une plaque de verre de 13 centimètres carrés sur la base de la lumière du microscope avec une lame de scie à plâtre de 15 centimètres sur la plaque de verre. Orientez la scie perpendiculairement à l’appareil d’injection avec les indentations tournées vers le porte-aiguille, puis allumez le boîtier de commande et assurez-vous que la pression est réglée à environ 175 kilopascals.

Réglez la durée d’injection sur 180 millisecondes. Desserrez ensuite le porte-aiguille, puis insérez une aiguille remplie dans le support jusqu’à ce que la résistance du support en caoutchouc puisse être ressentie et serrez le porte-aiguille jusqu’à ce qu’il soit serré à la main. Ajustez ensuite l’angle de l’aiguille à environ 45 degrés.

Utilisez les commandes du micromanipulateur pour ajuster l’aiguille de sorte que l’extrémité soit centrée dans le champ de vision. Zoomez sur un grossissement d’environ 40x et concentrez-vous sur la pointe de l’aiguille, qui ne doit pas toucher le verre situé en dessous. Avec une pince d’horloger, saisissez la pointe de l’aiguille à deux ou trois pinces de la largeur de l’extrémité et cassez doucement la pointe à un angle de 60 degrés.

Appuyez ensuite plusieurs fois sur la pédale d’injection pour vérifier si l’aiguille n’est pas cassée. Après quelques tapotements, de minuscules gouttelettes rouges devraient commencer à sortir de la fin. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, placez quelques gouttes d’eau d’épinoche sur la plaque de verre.

Abaissez doucement l’aiguille dans l’eau, puis augmentez la contre-pression jusqu’à ce qu’un léger jet de liquide rose émerge de l’aiguille. Rétractez l’aiguille autant que possible afin qu’elle ne soit pas endommagée lors de la préparation des embryons. Environ 25 minutes après la fécondation, utilisez deux pointes de pipette de 10 microlitres pour retirer cinq à 10 embryons de la couvée et les transférer sur la plaque de verre.

Avec les pointes de pipette, séparez doucement les embryons en indentations individuelles de la lame de scie en prenant soin de ne pas percer les embryons. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez suffisamment d’eau d’épinoche pour couvrir les embryons. Ensuite, après trois à cinq secondes, retirez la majeure partie de l’eau en ne laissant qu’un petit volume couvrant chaque embryon.

En commençant par l’embryon le plus éloigné, faites glisser la plaque de verre et zoomez sur l’embryon de sorte qu’il occupe environ 25 % du champ de vision. Abaissez l’aiguille dans le champ de vision, puis utilisez une pointe de pipette de 10 microlitres pour faire pivoter doucement l’embryon afin d’identifier le blastome, une bosse granuleuse, légèrement jaune et surélevée de cytoplasme sur le dessus du jaune. Faites pivoter l’embryon de manière à ce que le blastomère soit directement perpendiculaire à l’extrémité de l’aiguille.

Abaissez l’aiguille en appliquant une pression lente et uniforme pour percer le corion et insérez l’aiguille dans le cytoplasme sans la pousser à travers le jaune sous-jacent. Appuyez trois à quatre fois sur la pédale pour injecter de manière à ce qu’un bolus rouge aux bords légèrement diffus remplisse environ 1/8 du diamètre du cytoplasme. Avoir une aiguille pointue perpendiculaire au corion facilitera cette étape.

Limiter la quantité d’eau ajoutée aidera à garder le corion doux. Et enfin, cibler le cytoplasme augmentera la probabilité d’obtenir un animal transgénique. Utilisez les commandes du micromanipulateur pour rétracter l’aiguille et, avec la pointe de la pipette de 10 microlitres, maintenez l’embryon s’il colle à l’aiguille.

Après avoir rétracté l’aiguille, faites glisser la plaque de verre pour aligner l’embryon suivant avec l’aiguille et répétez l’injection. Lorsque tous les embryons ont été injectés, utilisez la pipette de transfert avec l’extrémité coupée pour ajouter de l’eau dans la plaque. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, collectez les embryons et placez-les dans une boîte de Pétri de 150 millimètres remplie d’eau d’épinoche.

Incuber les embryons à 18 degrés Celsius. Un jour après l’injection, versez doucement l’eau d’épinoche et remplacez-la par de l’eau fraîche. Vérifiez la présence d’embryons morts ou malformés et retirez-les pour éviter toute contamination.

Comme illustré ici, pour les transgènes qui ont une activité amplificateur, une injection réussie entraîne une expression cellulaire spécifique du transgène. Par exemple, dans les nageoires pectorales et médianes et la notochorde. Les poissons injectés peuvent ensuite être croisés pour produire des lignées stables telles que cette lignée stable à l’arrière qui entraîne l’expression de la GFP dans le cœur embryonnaire quatre jours après la fécondation.

Pour un activateur actif, 40 à 50 % des embryons présenteront une expression transgénique spécifique aux tissus, par exemple dans les nageoires médianes et pectorales. Jusqu’à 100 % des poissons F0 positifs à la GFP exprimant des transgènes plasmidiques péage deux produisent une progéniture transgénique. Cependant, le pourcentage de descendants porteurs du transgène varie considérablement, de moins d’un pour cent à 72 pour cent.

Le fait de ne conserver que les embryons injectés positifs à la GFP augmente généralement l’efficacité de la transmission. Seulement jusqu’à 10 % des embryons d’épinoches F0 réinjectés montrent une fluorescence dans les tissus attendus. De plus, le taux de transmission des dos est inférieur à celui des constructions plasmidiques.

Avec seulement jusqu’à 14 % des épinoches criblées transmettant le dos. Contrairement à la faible efficacité de la transgénèse arrière, 70 à 100 % des poissons à qui l’on a injecté des serres ont des lésions en mosaïque. Ici, un amplicon PCR non coupé dans chacun des embryons injectés indique que certaines cellules de chaque embryon portent des lésions au locus cible.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un peu plus d’une heure pour une couvée de 100 embryons si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la pratique et la patience sont nécessaires pour améliorer la technique et la survie de l’embryon. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions sur les modèles détaillés d’expression de l’amplificateur.

De plus, les poissons dont le génome est modifié peuvent être cultivés en croisement pour étudier les phénotypes résultant de mutations induites. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la génétique évolutive et du développement pour étudier la régulation et la fonction des gènes chez les épinoches. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter des embryons d’épinoches pour la transgenèse et l’édition du génome.