Name: Dissection et Flat-montage de lépinoche à trois épines branchiale Squelette (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez la dissection et le montage à plat du squelette branchial de l'épinoche à trois épines pour visualiser les traits trophiques. Cette méthode facilite l'étude du développement et de l'évolution chez les poissons.

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Ce travail a été financé en partie par le NIH R01 #DE021475 à CTM et une bourse de recherche supérieure de la NSF à NAE. Merci à Miles Johnson pour son aide en matière d’imagerie et à Priscilla Erickson pour la lecture critique du manuscrit.

Tous les travaux de poisson a été approuvé par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université de Californie à Berkeley (numéro de protocole R330). Euthanasie a été réalisée en utilisant l&#39; immersion dans 0,025% Tricaine-S tamponnée avec 0,1% de bicarbonate de sodium 39. Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante. 1. Préparation Remarque: Effectuer les étapes 1.1-1.5 dans des tubes coniques ou des flacons de scintillation qui peut sceller hermétiquement et être posés horizontalement. Les poissons ne doivent être constamment secoué, mais essayez de mélanger la solution aussi souvent que possible en retournant doucement ou en secouant la grille de tubes ou flacons pour exposer tous les côtés du poisson à la solution de coloration et de permettre aux taches de pénétrer le tissu uniformément. Ne placez pas un grand lot de poisson sur une plate-forme shaker, comme le poids lourd du liquide va briser le shaker. <ol><li> Fixer soit du poisson ou du poisson fraîchement euthanasiés stocké dans de l&#39;éthanol avec 10% de formol neutre tamponné (FBN) pendant la nuit. Vous pouvez également utiliser 4% paraformaldéhyde en solution 1 x PBS au lieu de NBF à 10%. Remarque: Si l&#39;extraction de l&#39;ADN, attachez une petite partie des caudale ou nageoires pectorales avant la fixation et à stocker dans l&#39;éthanol. </li><li> Dispose de fixer correctement dans une hotte chimique et remplacer l&#39;eau du robinet (qui est ~ pH 7,0) pendant 2 heures. Évitez d&#39;utiliser l&#39;eau de-ionisée car il peut souvent être acide et peut détartrer os. </li><li> Enlever l&#39;eau et le poisson tache avec 0,008% Alizarine Rouge S dans 1% de KOH dans de l&#39;eau pendant 24 heures. Pour les poissons de moins de 20 mm de longueur standard, utilisez 0,004% Alizarine Red S. (Faire un 100x (0,8%) solution mère de Alizarine Red S qui peut ensuite être diluée). </li><li> Retirer la tache (mise en conteneur à déchets approprié dans la hotte) et placer le poisson dans l&#39;eau du robinet pendant quelques heures. Changer l&#39;eau au besoin jusqu&#39;à ce que l&#39;eau de rinçage est la plupart du temps clair. </li><li> Retirer le poisson de l&#39;eau et le lieu dans 50% de glycérol, 0,25% de KOH pour la compensation légère et la dissection ultérieure. Remarque: Ce protocole de coloration est modifiée à partir de méthodes 40,41 décrites précédemment. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Dissection Note: Voir la Figure 1 pour un examen de la tête pertinente morphologie squelettique. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" /> Figure 1:. Tête Stickleback morphologie du squelette Alizarine rouge tachée tête épinoche à trois épines imagé avec fluorescence sous un ensemble de rhodamine filtre B. morphologie utile est étiqueté: Op = opercule, Sous-op = subopercle, BSR = branchiostèges rayons, Preop = préopercule, Infraorb 1-3 = infraorbital 1-3 (également appelés circumorbitals ou suborbitaux), Dent = du dentaire, Premax = prémaxillaire, Max = maxillaires , Nas = nasale, Lat. ETHM = ethmoïde latéral, PSPH = parasphénoïde, Fron = os frontal. Pour obtenir une description plus détaillée de l&#39;épinoche tête squelette, voir Anker (1974) 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande</a>cette figure. <ol><li> Poser le poisson plat (figure 2A) et insérer une pince de forte # 5 horloger dans le côté de l&#39;œil à un angle de 45 ° ~ pour perforer la membrane qui recouvre l&#39;œil. </li><li> Peler la membrane loin de l&#39;œil, semblable à peler un couvercle de yogourt (figure 2B). </li><li> Insérez une pince ouverte derrière l&#39;œil, attraper le nerf optique derrière l&#39;œil, et enlever l&#39;œil (figure 2C). Ne pas percer l&#39;oeil car il fuira la mélanine. Si perforé, la mélanine peut être lavé au cours des étapes ultérieures. </li><li> Répétez de l&#39;autre côté. </li><li> A partir de la partie postérieure, placez une petite lame de ciseaux de dissection sous le rabat de l&#39; opercule, la lame de ciseaux glisser dorsalement ci - dessus opercule, puis couper les tissus mous grâce à la prise de l&#39; oeil (figure 2D). Couper dorsale à l&#39;os de l&#39;opercule. </li><li> Couper l&#39;os frontal (dorsale à l&#39;orbite de l&#39; oeil) (Figure 2F). </li><li> Couper l&#39;os parasphénoïde midline autour til centre des orbites (Figure 2F). </li><li> Répétez l&#39;opercule coupe sur le côté opposé. </li><li> Insérez une pince sous l&#39;opercule et pelez lentement le visage loin du corps, le parage tout tissu mou encore attaché (Figure 2G - H). Prenez soin de ne pas perturber la première rangée de branchiospines. <ol><li> Avec des pinces, détacher les cératohyaux des deux côtés de la basihyal médiane tout en détachant et en enlevant le squelette craniofacial antérieure (l&#39;ensemble de la mâchoire y compris le dentary, prémaxillaire et maxillaire, l&#39;ensemble du squelette de hyoïde y compris l&#39;opercule dermique extérieur, préopercule, subopercle, et rayons branchiostèges et la dorsale sous - jacente et des éléments endochondrale ventrales, et la partie antérieure du crâne , y compris le nez, ethmoïde latéral, et les os sous - orbitaire, voir les figures 1 et 2I). </li><li> épines pelviennes peuvent être pliés hors du corps, et peut servir de poignée pour une pince pour agripper of lorsqu&#39;il est présent. Épines verrouillent en place. Pour déverrouiller, tirez doucement la colonne vertébrale avec une pince directement loin du corps de poisson, puis pliez doucement en arrière pour presser la colonne vertébrale à plat contre les poissons. </li></ol></li><li> Insérer fermé pince postérieure et ventrale au squelette branchial (juste en dessous de tube de l&#39; intestin) et des pinces de glisser en avant, à démêler les muscles et les ligaments qui restent attachés au squelette branchial (Figure 2J - K). </li><li> En utilisant les conseils de pinces fermées, gratter les muscles attachés dorsal squelette branchial la braincase ventrale dans un postérieur à la direction antérieure (Figure 2L). </li><li> Répétez 2.9 et 2.10 sur le côté opposé. </li><li> Saisissez la base du tube de l&#39; intestin et tirez en avant pour enlever le squelette et le tube intestin branchial (Figure 2M - N). </li><li> Séparer le tube de l&#39; intestin en faisant un postérieur perpendiculaire de coupe à la fin de la cinquième ceratobranchial (Figure 2O </strong&gt;). </li><li> Après avoir enlevé tous les fragments d&#39;os restants de la boîte crânienne sur la face dorsale du squelette branchial, insérer des ciseaux dans le panier branchiale pour faire une coupe dorsale (coupe antérieure à postérieure) entre les ensembles bilatéraux de plaques dorsales de dents (Figure 3A - D). Assurez-coupe est centrée pour éviter d&#39;endommager les plaques dorsales de dents. </li><li> Faire deux coupes latérales peu profondes dans la lumière intestinale caoutchouteux à la fin postérieure du squelette branchial (extrémité antérieure du tube de l&#39; intestin) pour aider à ouvrir le squelette branchial (Figure 3E). </li><li> Placer le poisson et tous les morceaux de tissu dans un bocal et placez-le squelette branchial dans un tube à centrifuger avec 50% de glycérol, 0,25% de KOH continuer compensation douce, ou 100% de glycérol si aucune autre compensation est nécessaire. bocaux d&#39;étiquetage et les tubes avec un identifiant unique afin qu&#39;ils puissent être suivis. Le montant de la compensation requise est en grande partie fonction de la taille des poissons, gros poissons adultes (plus de 40 mm de longueur standard) nécessitent généralement de compensation supplémentaire. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" /> Figure 2:. Stickleback branchiale squelette dissection Alizarine rouge tachée poisson épinoche à trois épines prête pour la dissection. L&#39;œil est dépigmentée d&#39;une vaste clairière. Les flèches bleues indiquent la direction du mouvement. (A) Vue latérale de la tête de l&#39; épinoche, antérieure se trouve à droite. (B) Enlèvement de la membrane recouvrant l&#39;œil. (C) L&#39; élimination de l&#39;oeil. (D) Dorsale coupé au- dessus de la opercule. (E) Frontal coupe osseuse. (F) parasphenoid coupé. (G - I) Retrait du squelette facial. (J) Suppression des connexions ventrales des tissus mous du squelette branchial. (K - L) Enlèvement des dorsales branchiaux connexions squelette. (&lt;strong&gt; M - N) Retrait du squelette branchial. (O) Séparer le tube intestinal du squelette branchial. Voir les étapes 2.1 à 2.16 pour plus de détails. Barre d&#39; échelle = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 3. branchiale Squelette Re-coloration (si nécessaire) <ol><li> Pour colorer le plus sombre squelette branchial ou d&#39;un tissu clair plus, supprimer 50% de glycérol, solution de KOH 0,25% et laver avec 1% KOH deux fois (un lavage de cinq minutes suivi d&#39;un second lavage de 24 heures tout en secouant horizontalement sur une plate-forme shaker). </li><li> Retirer 1% de KOH et re-tache avec 0,008% Alizarine Rouge S dans 1% de KOH pendant 24 heures. </li><li> Retirer la tache et le remplacer par 1% de KOH pendant 24 heures. </li><li> Retirer la solution KOH et le remplacer par 50% de glycérol, 0,25% de KOH. </li></ol> 4. Montage branchiale Squelette <ol><li> Retirer le squelette branchialà partir de 50% de glycérol, 0,25% de KOH ou 100% de glycérol et lieu près du fond d&#39;un 22 mm x 60 mm lamelle en verre avec la face dorsale vers le haut (figure 3F). Ajouter quelques gouttes de glycérol à 50%, 0,25% de KOH ou 100% de glycérol sur le dessus du squelette branchial. Si la transition de 50% de glycérol, 0,25% de KOH à 100% de glycérol, le changement solution dans un tube à centrifuger et agiter pendant&gt; 5 min avant de monter pour équilibrer les tissus. </li><li> Rouler deux petites boules de pâte à modeler et placer sur chaque extrémité de la lamelle à agir comme entretoises. </li><li> Librement placer une deuxième lamelle sur le dessus avec une pression suffisante pour aplatir le squelette branchial antérieur (figure 3G). </li><li> Peel ouvrir le rabat dorsal gauche y compris les plaques de dents dorsales, aplatir, et glisser entre les lamelles (figure 3H). </li><li> Répéter technique avec rabat droit dorsal et pousser tout le squelette branchial loin du bord de la lamelle (figure 3I). <ol><li> Modifiernativement, tenir les deux volets dorsales ouvertes avec une pince et placer soigneusement la lamelle sur, aplatir le squelette branchial dans un mouvement fluide. </li><li> Vous pouvez également monter le squelette branchial à l&#39;envers sur une lamelle, évasement chaque côté dorsal latéralement de façon gravité ne permet pas le squelette branchial pour fermer back up. Puis couvrir avec la deuxième 22 mm x 60 mm couvercle en verre de glissement et inverser prep. Remarque: les techniques de montage différentes ont tendance à travailler mieux ou pire pour chaque individu. Essayez chacune et de voir ce qui se sent plus à l&#39;aise. </li></ol></li><li> Appuyez légèrement sur le dessus lamelle pour aplatir des balles assez pour garder le squelette branchial d&#39;argile monté à plat, mais prendre soin de ne pas écraser l&#39;échantillon. <ol><li> Au cours du processus de montage, cératobranchiaux peuvent tourner et obscurcir une rangée de rakers. Remédier au forceps entre les lamelles et réorientant les cératobranchiaux ou squelette entier branchiale coulissant. </li></ol></li><li> Magasin preps plat dans des plateaux coulissants à rotempérature om. Monté dans 100% de glycerol, préparations peuvent être conservés entre les lamelles couvre-pontés pendant au moins dix ans. pinces propres et des ciseaux avec de l&#39;isopropanol ou de l&#39;éthanol et des conseils de couverture. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" /> Figure 3:. Montage plat squelette branchial Manipulation et montage du squelette branchial est représenté. Les flèches bleues indiquent la direction du mouvement. (A) branchiale dorsale squelette vers le haut. (B - D) Rotation et incision entre les plaques dorsale de la dent. (E) coupé dans un tissu mou latéral pour ouvrir davantage la base du tube intestinal. (F) branchiale squelette placé au fond d&#39;une lamelle couvre -objet prêt pour le montage. (G) Deuxième lamelle placée sur la moitié antérieure du squelette branchial ( au- dessus des plaques de dents dorsales). (H - I)montage plat du squelette branchial par l&#39;ouverture dorsale dents volets de plaque et de glissement entre deux lamelles. Voir les étapes 4.1 à 4.6 pour plus de détails. Barre d&#39; échelle = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le squelette branchial est un ensemble complexe d’os dans la gorge d’un poisson qui manipule, filtre et mâche les aliments sur leur chemin vers l’œsophage. De nombreux traits trophiques intéressants, y compris la structure des branchicténies, des dents pharyngiennes et des os branchiaux, varient d’une espèce à l’autre et à l’intérieur de celle-ci. La majorité de ces traits sont difficiles, voire presque impossibles à mesurer avec précision avec le squelette branchial in situ (par exemple, la longueur de...

Une quantité incroyable de diversité existe dans le squelette de la tête chez les vertébrés, en particulier chez les poissons. Dans de nombreux cas , cette diversité facilite les stratégies d&#39;alimentation différentes : 1 - 4, et peut impliquer des changements majeurs à la fois un motif craniofaciale externe et interne. Le squelette branchial est situé à l&#39;intérieur de la gorge d&#39;un poisson et qui entoure la majeure partie de la cavité buccale. Le squelette branchial est composé de 5 segments en série homologues, les quatre antérieure qui soutiennent les branchies. Ensemble , ces cinq segments fonctionnent comme une interface entre les poissons et leur nourriture 5. Variation dans une multitude de traits, y compris branchiospines, dents pharyngiennes, et les os branchiaux contribuent à la recherche de nourriture efficace sur les différents types d&#39;aliments. Épinoches ont subi une radiation adaptative après des formes océaniques ancestrales colonisées lacs d&#39;eau douce et les criques tout l&#39;hémisphère nord. Le changement dans le régime alimentairedu petit zooplancton dans l&#39;océan à des proies plus grosses en eau douce a donné lieu à une variation trophique dramatique dans plusieurs traits craniofaciales 6. Alors que de nombreuses études ont porté sur les différences craniofaciales externes dans épinoches 7 - 13, des changements importants craniofaciales évoluent de façon répétée dans le squelette branchial interne. La possibilité de créer des hybrides fertiles entre les populations d&#39;épinoches morphologiquement distinctes offre une excellente occasion de cartographier la base génétique des changements ont évolué vers le squelette branchial. Un trait trophique d&#39;importance écologique est la structuration des branchicténies, des os dermiques périodiques qui tapissent les faces antérieure et postérieure des os branchies et sont utilisés pour filtrer les proies. Les poissons qui se nourrissent généralement sur ​​de petits objets de proies ont tendance à avoir plus et plus densément maillant espacées branchicténies par rapport aux poissons qui se nourrissent de proies plus grosses 14,15. Variation branchicténies a été rapporté à la fois wSEIN et entre les espèces 14-19, et les aspects de la branchicténies patterning contribuent à des niches trophiques et remise en forme 16. Des décennies de recherche ont largement documenté nombre maillant racloir et la variation de longueur dans épinoches à trois épines 17 - 21; Toutefois, ces études se concentrent généralement sur la première rangée de branchiospines. Des travaux récents ont montré la modularité dans le contrôle génétique du nombre maillant racloir à travers le squelette branchial 22,23 et à travers une seule ligne dans branchicténies espacement 23 et la longueur 24 mettant en évidence l&#39;importance d&#39;étudier plus de ramer un ou une seule raker maillant pour comprendre le base génétique du développement de la réduction des branchies racloir. Un second trait trophique de signification à la fois écologique et biomédicale est le motif de dents pharyngées. Dents chez les poissons peuvent être situés à la fois dans la mâchoire, et par voie orale dans le squelette branchial, connu sous le nom de dents pharyngées. dents orales sont utilisées principalement pour prey capturer tout les dents pharyngées sont utilisés pour la mastication et la proie manipulation 25 - 27. Les deux ensembles forment par l&#39; intermédiaire des mécanismes de développement partagés et sont considérés comme de développement homologue 28. Modularité intéressante se produit où certaines espèces, comme le poisson zèbre, le manque de dents pharyngée orale et dorsale 29 tandis que d&#39; autres espèces ont plusieurs cératobranchiaux dentées, pharyngobranchials, et parfois dentées basihyal et hypobranchiaux 30. Dans épinoches dents pharyngiennes se trouvent sur ​​le côté ventral et cinquième ceratobranchial dorsalement sur ​​la partie antérieure et postérieure pharyngobranchials 31. Cinématique sur l&#39; épinoche alimentation montrent la mâchoire orale est principalement utilisé pour la capture des proies et de faciliter l&#39; aspiration d&#39; alimentation 9 en laissant la mastication à la mâchoire du pharynx. Dans cichlidés, inférieure morphologie pharyngée de la mâchoire varie considérablement 32,33 et a été montré pour être adaptatif et en corrélation avec niche trophique 34. Multiles populations d&#39; eau douce d&#39;épinoches ples ont évolué une augmentation spectaculaire de pharyngée ventral nombre de dents 23,35,36. Des travaux récents ont montré que la base génétique du développement de ce gain de dent évolué est en grande partie distincte dans deux populations dérivées indépendamment des épinoches d&#39;eau douce 36. Contrairement à dents de mammifères, les poissons se régénèrent leurs dents en permanence tout au long de la vie adulte 37. Ces deux populations précédemment décrites en eau douce dentées élevées ont évolué un taux de remplacement de la dent accélérée, fournissant un système de vertébrés rares pour étudier la base génétique de la régénération 36. Un troisième trait trophique qui a évolué à plusieurs reprises dans les épinoches d&#39;eau douce est plus long os épibranchiales et ceratobranchial, les branchies homologues arc segmentaire de la mâchoire supérieure et inférieure, respectivement 38. Plus longs os branchiaux confèrent une plus grande cavité buccale et probablement sont adaptatifs pour permettre à de plus grandes proies soient consumed. En outre, dans d&#39; autres poissons, les os épibranchiales sont importants pour la dépression des dorsale pharynx dents plaques 25. Comme branchicténies et les dents pharyngées, les os branchiaux sont internes et donc, difficile de visualiser facilement ou quantifier. Nous présentons ici un protocole détaillé pour disséquer et plat monter le squelette branchial, permettant une visualisation facile et la quantification d&#39;une variété de traits craniofaciales importants. Bien que ce protocole décrit une dissection de l&#39;épinoche, cette même méthode fonctionne sur une variété d&#39;autres poissons.

<table><tbody><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10 % Neutre Buffered Formalin (NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>Rouge d’alizarine S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 10 mm Verre Petri Dish</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td>Pour disséquer des échantillons sur</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Peut être versé dans des boîtes de Pétri en verre ou en plastique pour faire des plaques de dissection</td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 lb de crème</td></tr><tr><td>Flacons à scintillation (caisse de 500)</td><td>Wheaton</td><td>986586</td><td>Verre borosilicaté avec bouchon à vis</td></tr><tr><td>Forceps-Dumont #5 Inox (Pointe Biologie)</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Dumostars sont une alternative</td></tr><tr><td>aux ciseaux de dissection.</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>D’autres tailles sont disponibles en fonction de la taille de l’échantillon</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>S6E avec LED KL300</td><td>De nombreux autres modèles fonctionnent bien, avoir une base plate aide</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Tubes 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de lames en carton</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection et flat-montage de l&#39;épinoche à trois épines branchiale squelette

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

Les segments pharyngiens postérieurs de la tête des vertébrés donnent naissance au squelette branchial, le principal site de transformation des aliments chez les poissons. La morphologie du squelette branchial du poisson est adaptée au régime alimentaire d’une espèce. L’épinoche à trois épines (Gasterosteus aculeatus) est apparue comme un système modèle pour étudier la base génétique et développementale des différences évoluées dans une variété de caractères. Les populations marines d’épinoches ont colonisé à maintes reprises d’innombrables nouveaux lacs et ruisseaux d’eau douce. L’adaptation au nouveau régime alimentaire dans ces environnements d’eau douce est probablement à l’origine d’une série de changements craniofaciaux qui ont évolué à plusieurs reprises dans des populations d’eau douce dérivées indépendamment. Ceux-ci incluent trois changements majeurs dans la structure du squelette branchial : la réduction du nombre et de la longueur des os branchicténiens, l’augmentation du nombre de dents pharyngiennes et l’augmentation de la longueur des os branchiaux. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour disséquer et monter à plat le squelette branchial interne chez les épinoches à trois épines. La dissection de l’ensemble du squelette branchial tridimensionnel et son montage à plat dans une préparation en grande partie bidimensionnelle permettent de visualiser et de quantifier facilement la morphologie du squelette branchial. Cette méthode de dissection est peu coûteuse, rapide, relativement facile et applicable à une grande variété d’espèces de poissons. Chez les épinoches, cette méthode efficace permet de quantifier la morphologie squelettique dans les croisements génétiques pour cartographier les régions génomiques contrôlant les motifs craniofaciaux.

<html> Ce protocole se traduit par un squelette branchial monté disséqué et plat (figure 4) où une variété de traits trophiques importants peuvent être quantifiés. Du point de vue dorsale, toutes les lignes de branchicténies, toutes les plaques pharyngée à dents, et presque tous les os branchies peuvent être facilement visualisées et quantifiées 22 - 24,35,36,38,42. Alizarine Red S fluoresces également sur ​​un rhodamine ou un filtre rouge...

Le squelette branchial, y compris les branchicténies, les dents pharyngées et les os branchiaux, sert de site principal de transformation des aliments chez la plupart des poissons. Nous décrivons ici un protocole pour disséquer et monter à plat ce squelette interne chez les épinoches à trois épines. Cette méthode est également applicable à une variété d’autres espèces de poissons.

Dissection et Flat-montage de l&#39;épinoche à trois épines branchiale Squelette

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

L'objectif général de cette procédure est de disséquer et de monter à plat le squelette branchial du mérou. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du développement, de la génétique et de l'évolution, telles que la manière dont les animaux s'adaptent à de nouveaux environnements et comment la variation de la morphologie adulte apparaît au cours du développement.L'avantage principal de cette technique est que, en disséquant et en montant à plat le squelette branchial, on peut visualiser une variété de traits trophiques qui ne peuvent pas être étudiés en montage entier. En préparation, examinez la morphologie squelettique de la tête du épinoche à trois épines. Après avoir préparé le poisson pour la dissection, commencez par insérer des pinces fines n°5 dans le côté de l'œil, selon un angle de 45 degrés, afin de percer la membrane recouvrant l'œil.Ensuite, retirez délicatement la membrane de l'œil, comme le couvercle d'un pot de yaourt. Puis, insérez des pinces ouvertes derrière l'œil, saisissez le nerf optique et retirez l'œil. Prenez soin d'éviter de percer l'œil, au risque qu'il libère de la mélanine.Répétez ce processus avec l’œil du côté opposé. Ensuite, placez la lame de petites ciseaux sous la face postérieure du voile operculaire et sectionnez le tissu mou en direction dorsale au-dessus de l’opercule, vers la cavité orbitaire. Puis, sectionnez l’os frontal, situé en position dorsale par rapport à la cavité orbitaire.Ensuite, sectionner l'os parasphénoïde selon la ligne médiane, autour du centre de l'orbite. Répéter la coupe de l'opercule du côté opposé. Pour les étapes suivantes, les épines pelviennes peuvent être utilisées comme poignées.Ils se déploient en les tirant doucement directement vers l'extérieur par rapport au corps. Insérez ensuite la pince sous l'opercule et détachez lentement la face du corps, en éliminant au fur et à mesure tout tissu mou encore attaché.Faites attention aux rayons branchiaux et prenez soin de ne pas les perturber. Il est facile de saisir accidentellement le premier os ceratobranchial avec le Percoll lors du retrait du squelette facial. Regardez sous le Percoll pendant que vous le détachez vers l'avant afin de vous assurer que vous n'avez pas empoigné un élément supplémentaire.À présent, à l’aide de pinces, détacher les ceratohyaux des deux côtés du basihyal situé sur la ligne médiane, tout en décollant et en retirant le squelette facial crânien antérieur. Répéter l’opération sur le côté opposé. Le squelette facial crânien antérieur comprend l’ensemble de la mâchoire, le squelette hyoïdien entier, les éléments dorsaux et endochondraux sous-jacents ainsi que la partie antérieure du crâne.Ensuite, insérez les pinces fermées juste en dessous du tube digestif et déplacez-les vers l'avant. Séparez délicatement les muscles et ligaments restants attachés au squelette branchial au cours de cette manipulation. Puis, utilisez la pointe des pinces fermées pour racler les muscles reliant le squelette branchial dorsal à l'écaille cérébrale ventrale.Gratter avec un mouvement de l’arrière vers l’avant. Répéter le processus de retrait musculaire sur le côté opposé de l’éperlan. Ensuite, retirer le squelette branchial en saisissant la base du tube digestif et en tirant vers l’avant.Séparez le tube digestif à l'aide d'une incision perpendiculaire, postérieure au cinquième ceratobranchial. Une erreur fréquente consiste à saisir le tube digestif trop en avant, laissant ainsi le tube frontal ventral largement en arrière. Assurez-vous de bien saisir profondément à l'arrière dans la cavité thoracique, et vous pourrez toujours retirer ultérieurement l'excès de tube digestif.Après avoir retiré tous les fragments osseux restants de la cavité crânienne située sur le côté dorsal du squelette branchial, insérez les ciseaux dans le panier branchial et effectuez une incision dorsale entre les paires bilatérales de plaques dentaires dorsales. Veillez à maintenir cette incision centrée afin d'éviter d'endommager les plaques dentaires dorsales.Ensuite, effectuez deux incisions latérales superficielles dans la lumière souple de l'intestin à l'extrémité postérieure du squelette branchial. À l'extrémité antérieure du tube digestif, afin de faciliter l'ouverture du squelette branchial.Transférez maintenant le squelette dans un tube de microcentrifugeuse contenant 50 % de glycérine, 0,25 % d'hydroxyde de potassium pour une clarification douce. Sinon, transférez-le dans de la glycérine pure si aucune clarification supplémentaire n'est nécessaire. Si un retentage est nécessaire, les détails sont indiqués dans le protocole écrit.Pour préparer le montage, remplacez la solution par du glycérol pur et agitez le tube pendant au moins cinq minutes. Ensuite, retirez le squelette branchial et placez-le près du fond d'une lame de verre de 22 par 60 millimètres, avec le côté dorsal vers le haut. Transférez maintenant quelques gouttes de glycérol sur le squelette.Ensuite, formez deux petites boules de pâte à modeler et placez-en une à chaque extrémité de la lame de couverture ; elles servent d'espacements. Puis, posez légèrement une seconde lame de couverture sur la préparation, en exerçant une pression suffisante pour aplatir le squelette branchial antérieur. Ouvrez maintenant délicatement le lambeau dorsal gauche, y compris les plaques dentaires dorsales, et glissez ce lambeau entre les lames de couverture.Ensuite, faites de même avec le volet dorsal droit. Poussez ensuite l'ensemble du squelette branchial loin du bord de la lamelle. Pour terminer la procédure, appuyez légèrement sur la lamelle supérieure afin d'aplatir les boules d'argile.Juste assez pour maintenir le squelette branchial à plat, mais pas trop pour qu’il ne soit pas écrasé. Si, au cours du processus, une rangée de râpeurs devient invisible, insérez une pince entre les lamelles et réorientez le ceratobranchial ou l'ensemble de la préparation.Lorsqu'il est monté à plat dans du glycérine pure, le prélèvement peut être conservé à plat à température ambiante pendant au moins une décennie. Ce protocole permet d'obtenir un squelette branchial disséqué et monté à plat, où divers traits trophiques importants peuvent être chronifiés.En vue dorsale, toutes les rangées de filaments branchiaux, toutes les plaques dentaires pharyngiennes et presque tous les os branchiaux peuvent être facilement visualisés et chronifiés. L'Alizarine rouge S fluoresce également avec un filtre rhodamine ou similaire rouge, permettant une double marquage avec d'autres marqueurs et des méthodes alternatives de visualisation. Sur cette image, les filaments branchiaux sont indiqués par des chevrons.Les dents sont indiquées par des flèches et les os sont marqués par des astérisques. Une fois maîtrisée, la dissection peut être réalisée en quelques minutes et effectuée sur des centaines d'animaux relativement rapidement. Et bien que nous ayons démontré une dissection du squelette branchial d'un épinoche, nous espérons que cette procédure pourra servir de guide pour une variété d'espèces de poissons.En disséquant le squelette branchial, nous pouvons visualiser rapidement et facilement une variété de traits trophiques importants, invisibles dans les montages entiers, permettant ainsi une meilleure compréhension du développement et de l'évolution du squelette crânio-facial.

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Cet article présente les méthodes utilisées pour sonder les propriétés mécaniques de l'échelle multicouche de Atractosteus spatule (A. spatule) à l'aide de nano-indentation chimique spatialement corrélée, structurelle, et, infrarouge transformée de Fourier (FTIR), la microscopie électronique à balayage (MEB), et X- ray tomodensitométrie (CT à rayons X). Les résultats expérimentaux ont été utilisées pour étudier les principes de conception de matériels biologiques de protection.

Caractérisation des échelles de poissons multi-couches (<em&gt; Atractosteus spatule</em&gt;) En utilisant Nanoindentation, CT à rayons X, FTIR, et SEM

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Manipulations transgéniques et l' édition du génome sont essentielles pour tester fonctionnellement le rôle des gènes et des éléments cis -Informations règlementaires. Voici un protocole de microinjection détaillé pour la génération de modifications génomiques (y compris les constructions fluorescentes Tol2 médiées reporters transgène, TALENs et CRISPRs) est présenté pour le poisson modèle émergent, l'épinoche à trois épines.

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

L’analyse par éléments finis est un outil fréquemment utilisé pour étudier les performances mécaniques des structures sous charge. Ici, nous appliquons son utilisation à la modélisation de la biomécanique de la mâchoire du poisson-zèbre.

Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

Ici, nous présentons le protocole pour la culture tissulaire 3D de l’axe postérieur du corps du poisson zèbre, permettant l’étude vivante de la segmentation des vertébrés. Ce modèle d’explant fournit le contrôle sur l’élongation d’axe, l’altération des sources morphogènes, et l’imagerie vivante au niveau du tissu de résolution subcellulaire.

Une culture d’explantation de queue 3D pour étudier la segmentation des vertébrés chez le poisson zèbre

Nous décrivons ici des outils et des méthodes de calcul qui permettent la visualisation et l’analyse de données d’images tridimensionnelles et quadridimensionnelles d’embryons de souris dans le contexte de l’allongement axial et de la segmentation, obtenues par tomographie par projection optique in toto, et par imagerie en direct et coloration par immunofluorescence en monture entière à l’aide de la microscopie multiphotonique.

Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés

Découvrez la dissection et le montage à plat du squelette branchial de l'épinoche à trois épines pour visualiser les traits trophiques. Cette méthode facilite l'étude du développement et de l'évolution chez les poissons.

Dissection et Flat-montage de l'épinoche à trois épines branchiale Squelette

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