Name: Évaluation des myofilaments Ca 2+ Sensibilité sous-jacente cardiaque Excitation-contraction Couplage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Apprenez à mesurer la sensibilité Ca2+ des myofilaments dans les myocytes cardiaques isolés de rats. Cette méthode combine Fura-2 AM et microscopie pour analyser le couplage excitation-contraction et les dysfonctionnements cardiaques.

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Cette recherche a été financée par le Programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l&#39;éducation, de la science et de la technologie (2013068067); par le Graduate Programme cerveau Corée 21 du ministère coréen de l&#39;éducation, des sciences et de la technologie, hôpital universitaire national de Séoul, la Société coréenne de l&#39;hypertension (2013), Fonds de recherche Telecom SK (. pas 3420130290) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 31460265; NSFC 81260035).

Le protocole est en conformité avec le Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire publiées par les Instituts nationaux de la santé des Nations Unies (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996). Elle a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université nationale de Séoul (approbation IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Préparation du tampon (tableau matériel et équipement) <ol><li> Préparer 300 ml de solution d&#39;isolation fraîches le jour de l&#39;expérience (en mM: NaCl 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glucose 5; HEPES, 5, Na 2 HPO 4, 0,4, taurine, 20; pH 7,4 avec du NaOH). </li><li> Préparer 100 ml d&#39; une solution de stockage fraîches le jour de l&#39;expérience (en mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO4 5; CaCl 2 0,2; sodium pyruvate 5; glucose 5,5; taurine 20; HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 avec NaOH). </li><li> Préparer 1L de solution de perfusion (en mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCL 2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; CaCl 2, 1,8; le mannitol, 14,5; pH 7,4 avec NaOH). </li><li> Préparer 30 ml de solution de collagénase 1 par addition de collagénase (1 mg / ml), de la protéase (0,1 mg / ml), de l&#39; albumine de sérum bovin (BSA, 1.67mg / ml), et le Ca2 + (0,05 mM) à 25 ml d&#39;isolement Solution. </li><li> Préparer 20 ml de solution de collagénase 2 par addition de collagénase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), et le Ca2 + (0,05 mM) à 16,7 ml de solution d&#39;isolation. </li><li> Préparer 40 ml de solution de BSA par addition de 0,4 g de SAB à 40 ml de solution d&#39;isolation. Séparée 10 ml et 30 ml dans deux béchers. Ajouter Ca2 + à 30 ml de solution de SAB de sorte que la concentration finale en Ca2 + dans la solution de BSA est de 1 mM. </li></ol> 2. Préparation pour l&#39;isolement du ventricule gauche (LV) myocytes <ol><li> Transfert 8-12 semaine-vieux, Sprague-Dawley (SD) des rats dans des cages de transport propres de l&#39;installation de l&#39;animal à la salle de préparation et d&#39;isolement. </li><li> Hmanger deux bains d&#39;eau à 37 o C. Remarque: Utilisez le bain d&#39;une eau pour l&#39;eau - réservoir chemisé et les tubes de perfusion du système de perfusion Langendorff. Utilisez l&#39;autre bain d&#39;eau pour agiter les troncs de tissus myocardiques afin de séparer les myocytes simples. </li><li> Ajouter 5 ml et 3,3 ml de solution de BSA (sans Ca2 +) à 25 ml d&#39; une solution de collagénase 1 et 16,7 ml d&#39;une solution de collagénase 2 pour compenser le volume à 30 ml et 20 ml, respectivement. </li><li> Ajouter la solution d&#39;isolation (100 ml) et une solution de collagénase 1 (30 ml) à la colonne 1 (colonne 1) et la colonne 2 (colonne 2) dans le système Langendorff de perfusion, respectivement (figure 1A). </li><li> Oxygéner la solution d&#39;isolation et d&#39;une solution de collagénase 1 dans la colonne 1 et Col.2 via le tube de raccordement d&#39;oxygène dans le système de perfusion de Langendorff (figure 1A). De même, une solution de collagénase oxygénat 2 et la solution de BSA dans le bain-marie à agitation avec 100% d&#39; O 2 par l&#39;intermédiaire dutube de raccordement d&#39;oxygène. </li></ol> 3. Isolement de myocytes LV <ol><li> Anesthetize un rat SD par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (30 mg / kg) et de confirmer l&#39;état d&#39; anesthésie par orteil pincement et l&#39; absence de retrait réflexion. </li><li> Déplacer le rat sur un plateau de dissection. En position couchée, fixer les quatre pattes sur les côtés du corps avec du ruban adhésif. </li><li> Appliquer thoracique incisions mi-axiales avec des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le coffre, en veillant à ne pas endommager le cœur. Utilisez une autre paire de ciseaux propres à disséquer le cœur des vaisseaux de connexion (par exemple, cava supérieur et inférieur vena, vaisseaux pulmonaires, et de l&#39; aorte) et de la membrane péricardique 13. </li><li> Laisser une partie de l&#39;aorte , d&#39;une longueur suffisante (5-8 mm), serrer l&#39;aorte avec une pince fine, et de monter rapidement la canule du système de perfusion de Langendorff à moins de 1 min (figure 1A). Attachez fil de suture 4/0 étroitement sur l&#39;aorte. </li><li&gt; Ouvrir le robinet sur la colonne 1 et perfuser le coeur isolé avec une solution pré-chauffée et oxygénée isolement pendant 10 min (débit de perfusion: 12-14 ml / min). Fermez le robinet sur la colonne 1, mettez la valve sur Col. 2 et perfuser le cœur avec une solution de collagénase 1 pendant 8 - 10 min. </li><li> Démonter le coeur digéré en coupant l&#39;aorte et le transférer en maintenant l&#39;aorte avec une pince dans le flacon contenant une solution d&#39;isolation frais (Figure 1BI). Utilisez des ciseaux fins et des pinces pour couper la majeure partie de la paroi libre LV (y compris le septum) en petits morceaux (~ 22 mm, Figure 1Bii). </li><li> Transférer les morceaux dans un flacon contenant une solution préchauffée et oxygénée collagénase frais 2 (Figure 1Biii). Agiter pendant 10 min. Fournir de l&#39;oxygène à maintenir la solution contenant la collagénase-2 myocytes. </li><li> Déplacez le myocytes - suspension à un tube de 10 ml de centrifugeuse en utilisant pipettes avec une ampoule d&#39;aspiration et ajouter Ca 2+ - contenant une solution BSA (1: 1 en volume). Centrifuger à 30 g pendant 2 minutes et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot de myocytes dans 5 ml de solution de BSA. Centrifugeuse et jeter le surnageant. </li><li> Disperser les pastilles de myocytes et de garder les myocytes dans 10 ml de solution de pré-oxygénée stockage à température ambiante (figure 1Biv-vi). </li><li> Répéter les opérations (étapes 3/7 à 3/9) avec le tissu LV restant dans le ballon. Remarque: Continuez à répéter les procédures (étapes 03.07 à 03.09) jusqu&#39;à ce que la plupart des tissus LV disparaît pour obtenir un bon rendement de myocytes. </li><li> Maintenir les myocytes dans une solution de stockage pendant 8/6 heure à température ambiante jusqu&#39;à la fin des expériences. </li></ol> 4. Les mesures simultanées de intracellulaires Ca 2+ Transitoires et myocytes Contraction <ol><li> myocytes charge BT avec l&#39;ester acétoxyméthyle Fura-2 AM (2 uM). Remarque: Effectuez toutes les procédures et expériences chargement avec myocytes chargés dans un tube noir (Figure 1Bvii). <ol><li> Centrifuge la suspension de myocytes (1 ml) à 2 000 x g pendant 10 s. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de myocytes dans 1 ml de solution de Tyrode avec une faible concentration de Ca 2+ (250 uM, Tableau matériel et équipement). </li><li> Ajouter Fura-2 heures et poloxamère 407 (2 pi), disperser doucement la suspension de myocytes, et maintenir le mélange à la température ambiante (20-24 ° C) pendant 15 minutes (Figure 1Bvii). </li><li> Centrifuger le mélange pendant 5 secondes, éliminer le surnageant et on disperse le culot de myocytes dans 1 ml de solution de perfusion contenant 500 uM de Ca 2+. Au bout de 10 min, centrifuger le mélange pendant 5 sec et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter une solution de perfusion frais (500 uM Ca 2+, 1 ml) et de garder le Fura-2 heures - culot myocytes chargé dans cette solution pour les enregistrements. </li></ol></li><li> Mesure de LV myocytes contraction et intracellulaire de Ca2 + <ol><li> Avant d&#39;enregistrer, remplir le tube de perfusion qui fonctionne à travers unchemise d&#39;eau avec la solution de Tyrode, qui est pré-chauffé à 36 ° C </li><li> Placez quelques gouttes de la Fura 2 heures - chargé LV myocytes suspension sur la chambre d&#39;un microscope inversé à fluorescence pour 5-8 min. perfuser lentement la solution de Tyrode (2,2 ml / min). </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;start&quot; sur le panneau avant du stimulateur numérique pour commencer la stimulation de champ (2 Hz). Remarque: La tension de sortie (V 10, 5 msec durée) est appliquée aux myocytes dans la chambre par des fils de platine positionnés de part et d&#39;autre de la chambre. <ol><li> qui se contractent de manière stable Sélectionnez myocytes (pas ceux affichant hyper- ou hypo-contraction) pour l&#39;enregistrement. </li></ol></li><li> Réglez le myocytes de choix dans la position horizontale du système de détection sarcomère basé sur la vidéo et ajuster la mise au point du microscope pour obtenir des images optimales de sarcomères. Placez la boîte rectangulaire pourpre sur la zone dans laquelle sarcomères claires sont clairement observés jusqu&#39;à ce que la moyennedes longueurs de sarcomères (pic rouge) affiche un pic singulier forte (figure 2A, image inférieure). </li><li> Notez les changements de longueur de sarcomère en réponse à une stimulation de champ (Figure 2A et B). Remarque: Utilisez les myocytes chargés dans les 1 - 2 h. </li><li> Régler l&#39;ouverture de la caméra de sorte que le champ dans le système de détection de sarcomères vidéo basée sur la taille de myocyte (figure 2A). Stimule la myocytes avec une excitation à 360 nm / 380 nm et émission à 510 nm (fréquence d&#39;acquisition de 1000 Hz). Enregistrez le raccourcissement des sarcomères et le rapport Fura2 AM avec une stimulation de champ (figure 2B). </li></ol></li></ol> 5. L&#39; évaluation de la sensibilité de myofilament Ca <ol><li> La moyenne des longueurs de sarcomères et Ca 2 + transitoires à l&#39; état ​​d&#39; équilibre (10 - 20 traces) et tracer la boucle à phase plan du rapport Fura-2 par rapport à la longueur des sarcomères du même myocytes ( à la fois avec la valeur mesurées et delta changements; Figure 2C). </li><li> Dans chaque parcelle, définir Fura de ratio à 50% de relaxation (CE 50, figure 2C). Comparer à la fois la boucle et CE 50 de chaque intervention. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous décrivons les protocoles pour évaluer les changements de la sensibilité de myofilament Ca en simple myocytes cardiaques isolés et soulignons l&#39;importance de mesurer ce paramètre aux côtés de propriétés électrophysiologiques, intracellulaires Ca 2 + transitoires, et la dynamique des myofilaments. En effet, les enregistrements d&#39;une ou deux des paramètres ne peuvent pas expliquer les mécanismes sous-tendant la contraction cardiaque et la relaxation. A la différence des procédés clas...

Excitation-contraction cardiaque (EC) de couplage est le schéma fondamental pour analyser les propriétés mécaniques du myocarde, à savoir la fonction contractile du cœur 1,2. Couplage C&#39;est initiée par dépolarisation de la membrane secondaire par rapport à l&#39;activité des canaux ioniques sarcolemmiques (par exemple le canal Na + voltage-dépendants, qui peut être mesurée par des techniques de patch-clamp). L&#39; activation subséquente de type L voltage-dépendants canaux Ca2 + (LTCCs) et influx de Ca 2+ par LTCCs déclencher la masse de Ca 2+ libération par le biais des récepteurs de la ryanodine (les RyRs), augmentant ainsi la cytosolique concentration en Ca 2+ du nanomolaire (nM ) micromolaire (uM) niveau. Une telle augmentation de Ca 2+ cytosolique favorise la liaison à Ca2 + troponine C (CTN) en filaments fins et induit des changements conformationnels du complexe du filament pour faciliter l&#39;interaction actine-myosine et atteint myocardial contraction 3. A l&#39; inverse, le Ca 2+ cytosolique est re-uptaken retour dans le réticulum sarcoplasmique (SR) par le Ca2 + ATPase dans SR (SERCA2a) ou est extrudé hors de la myocytes via 2+ échangeur Na + / Ca et le plasmiques Ca 2+ ATPase 1,2. Par conséquent, la baisse de Ca cytosolique 2+ incite des changements conformationnels de minces filaments à l&#39;état d&#39; origine, ce qui entraîne la dissociation de l&#39; actine-myosine et myocytes relaxation 1-3. Dans ce système, l&#39;activité de SERCA2a est généralement considérée pour déterminer la vitesse de relaxation du myocarde , car elle représente 70-90% de Ca2 + cytosolique retrait dans la plupart des cellules cardiaques mammaliennes 1. En tant que tel, anormale Ca2 + manipulation par LTCC, RyR et SERCA2a, etc. ont été considérés comme les principaux mécanismes de troubles de la contractilité et de détente au cœur malade 1-4. 2+ qui fonctionne comme le messager dans les comptes de couplage CE pour environ 1% du total intracellulaire de Ca2 + et la majorité de Ca 2+ est lié à intracellulaires Ca2 tampons 5,6. Ceci est dû au fait que les différents tampons de Ca2 + sont abondants dans les myocytes cardiaques, par exemple, des phospholipides membranaires, l&#39; ATP, phosphocréatine, la calmoduline, la parvalbumine, myofibril TnC, la myosine, SERCA2a et calséquestrine dans le RP. 5,6,7. Parmi eux, SERCA2a et TNC sont prédominants Ca2 + tampons 5,6,7. En outre, Ca 2+ se liant à ses tampons est un processus dynamique au cours de contraction (par exemple, 30-50% de Ca 2+ se lie à TnC et désolidarisé pendant Ca 2 + transitoires 7) et le changement de Ca 2+ cause supplémentaire de liaison &quot;libérer&quot; de la libre Ca 2+ dans le cytosol, les résultats dans les altérations du Ca2 * intracellulaire concntration. Par conséquent, la perturbation du niveau intracellulaire de Ca2 + induit des mouvements anormaux myofilament, qui sont les précurseurs du dysfonctionnement contractile et l&#39; arythmie 8,9. De nombreux facteurs ( à la fois physiologiques et pathologiques) peuvent être des sources de modifications post-transcriptionnelles de protéines de myofilaments qui influencent la sensibilité de myofilaments tampon Ca2 + et Ca myofilaments 8-10. Récemment, il a été rapporté que des mutations dans les protéines myofilament augmentent le Ca 2+ affinité de liaison et intracellulaire de Ca2 + manipulation, déclenchant une pause-dépendante potentialisation de Ca 2 + transitoires, Ca 2+ libération anormale, et arythmies 8. Conformément à ce concept, nous avons également montré que myofilament Ca 2+ désensibilisation dans les cœurs de rats hypertendus secondaires à la régulation positive de la synthase neuronale de l&#39; oxyde nitrique est associée à diastolique élevée et systolique niveaux de Ca2 +11, qui , à son tour, augmente la vulnérabilité du LTCC à l&#39; inactivation dépendante de Ca 12. Par conséquent, la sensibilité de myofilament Ca est un régulateur &quot;actif&quot; de Ca2 + intracellulaire homéostasie et myocytes fonction contractile. Il est devenu nécessaire d&#39;analyser les interactions entre myofilament et Ca2 + manipulation des protéines d&#39; une enquête approfondie des myocytes couplage CE et la fonction cardiaque. Ici, nous décrivons un protocole qui permet d&#39; évaluer les changements de la sensibilité de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques isolés. Une analyse complète des Ca2 + intracellulaire profil, la sensibilité et la contraction de myofilament Ca va déterrer de nouveaux mécanismes mécanique du myocarde sous - jacents.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 semaines</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Corée)</td><td>AHN901</td><td>Code d’assurance :645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp ; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Albumine fœtale bovine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Sondes moléculaires</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 Solution à 20 % dans du DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau agitée</td><td>Chang Shin</td><td>Modèle scientifique : C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Constructeur expérimental</td><td>Acquisition et analyse des données de couplage EC dans les myocytes</td></tr><tr><td>Myocytes Calcium & Système d’enregistrement de contractilité</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau circulante</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence myocytaire</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence & Détection vidéo</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence & Interface système</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse d’excitation</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Lampe ARC à haute intensité Alimentation</td><td>Cairn Recherche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de roue à filtres</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>numérique Systèmes médicaux Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>Compositions of Experimental Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solution d’isolation (pH : 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5,4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 3,5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td></td><td>CB2742654 Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp ; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentration (mmol) 0,4</td></tr><tr><td>Solution de stockage (pH : 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5,4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0,2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Solution de perfusion (solution Tyrode, pH : 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 141,4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentration (mmol) 0,33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1,8&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Pour le chargement en Fura 2AM, les concentrations de CaCl2 sont de 0,25 mM et 0,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 1</td></tr><tr><td>Concentration de Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>(mmol) 14,5</td></tr><tr><td>Solution de collangenase 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’isolement (30 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine fœtale bovine (solution BSA 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagénase de type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Protéase</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentration (mmol) 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’isolement ( 20 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine fœtale bovine (solution BSA 3,3 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagénase de type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td>BSA</tr><tr><td>Solution d’isolement ( 40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentration d’albumine fœtale bovine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>(mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

Évaluation des myofilaments ca<sup&gt; 2+</sup&gt; sensibilité sous-jacente cardiaque excitation-contraction couplage

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

L&#39;insuffisance cardiaque et des arythmies cardiaques sont les principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde entier. Cependant, le mécanisme de la pathogenèse et de dysfonctionnement du myocarde dans le cœur malade reste à être pleinement clarifié. Des preuves convaincantes récentes démontrent que les changements dans la sensibilité du myofilament Ca affectent Ca intracellulaire 2+ activités de l&#39; homéostasie et canaux ioniques dans les myocytes cardiaques, les mécanismes essentiels responsables du potentiel d&#39;action cardiaque et la contraction dans les cœurs sains et malades. En effet, les activités des canaux ioniques et des transporteurs sous - jacents potentiels d&#39;action cardiaques (par exemple, Na +, Ca 2+ et K + et des canaux 2+ échangeur Na + -Ca) et le Ca2 + intracellulaire des protéines (par exemple , la manipulation., Les récepteurs de la ryanodine et Ca 2 + -ATPase dans réticulum sarcoplasmique (SERCA2a) ou phospholambane et sa phosphorylation) sont classiquement mesurée Evalumangé les mécanismes fondamentaux de cardiaque excitation-contraction (CE) de couplage. Les deux activités électriques dans la membrane et les changements Ca2 + intracellulaires sont les signaux de déclenchement de couplage CE, alors que myofilament est l&#39;unité fonctionnelle de contraction et de relaxation, et la sensibilité de myofilament Ca est impératif dans la mise en œuvre de la performance myofibrille. Néanmoins, peu d&#39; études intègrent la sensibilité de myofilament Ca dans l&#39;analyse fonctionnelle du myocarde sauf si elle est l&#39;objet de l&#39;étude. Ici, nous décrivons un protocole qui mesure sarcomère shortening / re-allongement et le intracellulaire niveau Ca 2+ en utilisant Fura-2 AM (de détection ratiométrique) et d&#39; évaluer les changements de la sensibilité de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques de coeurs de rats. L&#39;objectif principal est de souligner que la sensibilité myofilament Ca doit être pris en considération dans le couplage CE pour l&#39; analyse mécaniste. enquête approfondie sur isur les canaux, les transporteurs d&#39;ions Ca 2+ intracellulaire, la manipulation et la sensibilité de myofilament Ca qui sous - tendent myocytes contractilité dans les cœurs sains et malades fournira des informations précieuses pour la conception de stratégies plus efficaces de translation et de valeur thérapeutique.

myocytes LV sont isolés des coeurs de rats normaux et hypertendus. Myocytes en forme de tige avec des stries claires (représentant sarcomères) et des contractions stables en réponse à une stimulation de champ sont considérés comme les myocytes optimales et sont sélectionnés pour les enregistrements (figure 2A). Dans l&#39;exemple représenté en F igure 2A, une Fura 2 heures LV myocytes est chargé en position horizontale et l&#39;ouverture de la caméra est...

Cet article décrit un protocole qui évalue les changements de sensibilité du myofilament Ca2+ pendant la contraction dans des myocytes cardiaques isolés à partir du cœur de rat. Associée à l’électrophysiologie cardiaque, aux niveaux de cytosol systolique/diastolique Ca2+ et à la contraction/relaxation, cette mesure est impérative pour soutenir les mécanismes médiant le couplage excitation-contraction cardiaque chez les cœurs sains et malades.

Évaluation des myofilaments Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilité sous-jacente cardiaque Excitation-contraction Couplage

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la sensibilité calcique des myofilaments afin d'améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la contraction cardiaque dans les cœurs sains et malades. Cette méthode peut aider à répondre à des questions liées à la congestion cardiaque et à l'insuffisance cardiaque. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle permet, conjointement à l'étude des canaux ioniques, des transporteurs ioniques et de la régulation calcique intercellulaire, d'obtenir une compréhension complète des mécanismes responsables de la contractilité cardiaque chez la souris, en condition physiologique comme en pathologie cardiaque.Pour commencer cette procédure, faites chauffer deux bains d'eau à 37 degrés Celsius. Ajoutez cinq millilitres de solution de BSA sans calcium à 25 millilitres de solution de collagénase un et 3,3 millilitres de solution de BSA sans calcium à 16,7 millilitres de solution de collagénase deux. Ensuite, ajoutez 100 millilitres de solution d'isolement à la colonne un et 30 millilitres de solution de collagénase un à la colonne deux du système de perfusion Langendorff.Oxygénez la solution d'isolement et

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Murine ventriculaire gauche muscle papillaire peut être utilisée pour étudier la contractilité cardiaque in vitro. Cet article décrit en détail l'isolement et des protocoles expérimentaux pour étudier les caractéristiques contractiles cardiaques.

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Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

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Un ensemble de protocoles est présenté qui décrit la mesure de la fonction contractile via la détection de la longueur du sarcomère ainsi que la mesure transitoire du calcium (Ca2+) dans les myocytes isolés du rat. L’application de cette approche pour les études sur des modèles animaux d’insuffisance cardiaque est également incluse.

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Ce protocole décrit comment mesurer la contractilité dans les cardiomyocytes primaires humains adultes provenant de cœurs de donneurs avec le système MyoBLAZER, une plate-forme fiable pour évaluer les changements de contractilité induits par les médicaments au cours du développement préclinique.

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Apprenez à mesurer la sensibilité Ca2+ des myofilaments dans les myocytes cardiaques isolés de rats. Cette méthode combine Fura-2 AM et microscopie pour analyser le couplage excitation-contraction et les dysfonctionnements cardiaques.

Évaluation des myofilaments Ca

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