Conception et développement d'aptamères-or à base de nanoparticules colorimétriques Assays pour In-the-champ Applications

L’objectif global est de proposer une approche générale pour le développement d’un test colorimétrique basé sur les nanoparticules d’aptame-or pour la détection des molécules cibles, et de proposer des approches pour améliorer le stockage à long terme et réduire les taux de faux positifs. Cette méthode répond aux questions clés dans le domaine des tests colorimétriques sur nanoparticules d’or, aptamer, telles que la reproductibilité des tests sur le terrain pour le stockage à long terme et la réduction du taux de faux positifs. Ces tests peuvent être sujets à des problèmes de durée de conservation et à des faux positifs.

Dans ce travail, nous améliorons ces deux questions. Nettoyez une fiole Erlenmeyer de 500 millilitres et une grande barre agitatrice avec cinq millilitres d’acide nitrique concentré et 15 millilitres d’acide chlorhydrique concentré dans une hotte de sécurité chimique. Humidifier toute la surface de la fiole avec du lavis acide.

Puis rincez la fiole avec de l’eau sans nucléase et laissez-la sécher. Ajoutez 100 millilitres de chlorure d’or millimolaire trois millimolaires. Utilisez une feuille de papier aluminium pour couvrir le dessus de la fiole Erlenmeyer nettoyée à l’acide et chauffez en remuant continuellement sur une plaque chauffante jusqu’à ébullition.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de citrate de sodium à 38,8 millimolaires. La couleur change du clair ou gris au bleu foncé ou au noir, puis enfin au foncé puis au rouge sur plusieurs minutes. Continuez à remuer avec le feu éteint pendant 10 minutes.

Laissez refroidir la suspension à nanoparticules dorées à température ambiante et ajoutez 110 microlitres de DEPC en brassant continuellement. Couvrez toute la fiole de papier aluminium et laissez le traitement DEPC incuber toute la nuit. Le lendemain, autoclave de la suspension à nanoparticules d’or.

Puis refroidissez à température ambiante et filtrez à travers une membrane acétate de cellulose à pore de 0,22 micron. Conservez la solution de nanoparticules d’or filtrée et autoclavée dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Calculez la concentration de nanoparticules d’or comme décrit dans le protocole textuel.

Ici, la concentration a été calculée à 10 nanomolaires d’une taille de 15 nanomètres, déterminée par la diffusion dynamique de la lumière. Acheter ou synthétiser les séquences d’aptamers liant la cocaïne en utilisant la chimie standard de la phosphoramidite. Après avoir purifié les aptamères par désalage standard, reconstituez les oligonucléotides dans de l’eau sans nucléase à partir de solutions de 100 micromolaires ou d’une millimolaire.

Les aptamers purifiés aliquotés peuvent être conservés à 20 degrés Celsius pendant plusieurs mois. Combinez l’ADN avec la solution de nanoparticules d’or à 10 nanomolaires en stock, en variant le volume de nanoparticules d’or selon le souhait, afin de fournir suffisamment d’échantillons pour effectuer le test. Faites couver le mélange pendant trois à quatre heures à température ambiante et protégez-le de la lumière.

Ajoutez un volume égal de 20 millimolaires HEPES, deux millimolaires de chlorure de magnésium et un tampon de pH 7,4, puis placez l’échantillon à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant la nuit. La concentration initiale de sel nécessaire pour induire la réponse couleur du test par titration du sel est déterminée avec le blanc du test. Ajoutez 20 microlitres de méthanol à des aliquotes de 180 microlitres du test aptamer-chlorure d’or dans une plaque à 96 puits.

Une étape cruciale dans la performance de ces tests consiste à déterminer la concentration de chlorure de sodium pour déstabiliser les nanoparticules d’or une fois la cible ajoutée. Titrez les échantillons avec des volumes croissants de solution de chlorure de sodium stock et déterminez le point d’équivalence. Ici, déterminez le volume de chlorure de sodium nécessaire pour provoquer le moindre changement de couleur par observation visuelle.

Pour optimiser la réponse au test, ajouter 20 microlitres de molécules d’analyte diluées dans du méthanol à des aliquotes de 180 microlitres d’essai par nanoparticules aptamer-or dans une plaque de 96 puits à température ambiante. Ajoutez immédiatement la concentration de chlorure de sodium déterminée à l’étape précédente pour initier la réponse couleur du test. Obtenir le plus grand changement de couleur possible en augmentant ou diminuant la concentration de chlorure de sodium et en comparant la réponse cible à la réponse à blanc.

Utilisez la concentration de chlorure de sodium qui offre la plus grande différence de réponse. Observez ou mesurez la réponse au test 150 secondes après l’ajout de chlorure de sodium. Analysez l’absorbance à 650 nanomètres et 530 nanomètres, à l’aide d’un spectrophotomètre.

Tracez les résultats comme le rapport d’absorption obtenu à 650 nanomètres et 530 nanomètres en fonction de la concentration d’analyte. Normaliser la réponse de l’essai au signal blanc. Préparez les composants du test de nanoparticules aptamer-or comme décrit précédemment dans la vidéo.

Préparez des solutions séparées contenant un gramme par millilitre de tréhalose et un gramme par millilitre de saccharose dans de l’eau sans nucléase pour produire la solution cryogénique. Une étape cruciale pour congeler ces tests consiste donc à déterminer la quantité de tréhalose et de saccharose à ajouter aux échantillons pour garantir une congélation totale et uniforme. Fabriquez une solution contenant 19,2 milligrammes par millilitre de tréhalose et 4,8 milligrammes par millilitre de saccharose avec le test de 60 MN4 ADN par nanoparticule d’or à un volume final de 200 microlitres dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre.

Les concentrations en solution cryogénique finale varient en fonction de la couverture ADN. Congelez rapidement les échantillons à l’aide d’un congélateur à 146 degrés Celsius ou dans de l’azote liquide. Conservez les échantillons congelés jusqu’à utilisation.

Pour ce travail, laissez les échantillons dans le congélateur à 146 degrés Celsius toute la nuit, puis transférez dans un congélateur à 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Voici des résultats représentatifs des courbes de titration du chlorure de sodium pour les nanoparticules d’or non traitées et traitées par ADN aptamère. La concentration initiale de chlorure de sodium utilisée dans le test a été déterminée par titrage.

Les résultats représentatifs du test colorimétrique de nanoparticules aptamère-or pour la cocaïne et les molécules témoins sont présentés ici. Les graphiques révèlent l’effet que l’augmentation de la densité de couverture ADN a sur le taux de réponse faux positif du test de cocaïne. Voici les graphiques de la courbe d’étalonnage obtenus à partir de l’analyse photoimagerique du test colorimétrique de cocaïne.

Photos prises avec des smartphones. Les résultats représentatifs de la réponse au test de nanoparticules aptamère-or colorimétriques à la cocaïne et aux molécules témoins sont présentés ici. Les données comparent des échantillons fraîchement préparés aux échantillons stockés congelés jusqu’à quatre semaines.

Lors de cette procédure, il est très important de déterminer la concentration adéquate de chlorure de sodium pour déstabiliser les nanoparticules d’or et favoriser le changement de couleur typique lors de l’ajout de la cible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment développer des essais colorimétriques à nanoparticules d’or et aptamer pour la détection de cibles d’intérêt. Vous pouvez utiliser les approches décrites ici pour réduire les taux de faux positifs et maintenir vos tests viables pendant plus d’un mois.