Vérification rapide de Terminators Utilisation du pgr-Blue plasmidique et Golden Assemblée Porte

L’objectif global du protocole de biologie synthétique est de déterminer rapidement la fonctionnalité du terminateur et de quantifier la force du terminateur dans un système in vitro qui utilise l’assemblage de la porte d’or. Ce protocole est utilisé pour tester les terminateurs que nous avons trouvés in silico à l’aide de la bio-informatique et les tester dans un cadre biologique. Cela permet une confirmation rapide et simple des terminateurs bio-informatiques identifiés dans un environnement de laboratoire.

Le principal avantage de ce protocole est sa rapidité. Nous pouvons passer de l’identification bio-informatique à la confirmation biologique en moins d’une semaine. Et ce faisant, nous pouvons également vérifier qu’un terminateur est bien un terminateur et nous pouvons quantifier sa force terminative.

En général, les individus auront d’abord du mal avec cette technique, car il semble contre-intuitif d’ajouter l’enzyme de restriction avec une ligase dans le même tube. Cependant, nous utilisons des endonucléases de restriction de type 2S et le site de reconnaissance de l’enzyme est séparé du site de coupe réel. Une fois que le terminateur est ligaturé dans le plasmide bleu pGR, il s’agit d’une ligature permanente.

Cependant, en ayant l’enzyme de restriction et la ligase dans le même tube, en passant par plusieurs cycles, nous pouvons atteindre une efficacité de coagulation élevée. Commencez cette procédure en remettant en suspension les oligonucléotides individuels dans de l’eau exempte de nucléases à une concentration de 100 micromolaires, puis préparez un tampon de recuit 10x. Ensuite, étiquetez un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre pour chaque terminateur à tester.

Dans chaque tube, ajoutez 16 microlitres d’eau ultra-pure, 2 microlitres de tampon de recuit 10x et 1 microlitre chacun des oligonuclotides des brins supérieur et inférieur des terminateurs souhaités. Il est très important de s’assurer que les oligonuclotides que vous avez commandés ont les bonnes extrémités collantes. Parce qu’une fois qu’ils sont recuits ensemble, il est important de s’assurer que la terminaison est dans la bonne orientation.

Si le terminateur est dans la mauvaise orientation, pGR blue ne sera pas en mesure de vérifier s’il s’agit d’un terminateur fonctionnel. Ensuite, placez les tubes de micro-centrifugeuse dans un flotteur et faites-les bouillir pendant quatre minutes au bain-marie. Au bout de quatre minutes, éteignez la plaque chauffante, mais laissez le tube dans l’eau pendant la nuit pour qu’il refroidisse lentement.

Stockez les terminaisons recuites à 20 degrés Celsius. Pour effectuer une dilution de 40 nanomolaires des terminateurs recuits, décongelez-les d’abord sur de la glace, puis dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre, ajoutez 124 microlitres d’eau sans nucléases, à 1 microlitre de terminateurs recuits. Centrifugez les échantillons pendant 30 secondes à 10 000 x g.

Après l’essorage, stockez les échantillons sur de la glace. Dans un nouveau tube adapté au thermocycleur, ajoutez 6 microlitres d’eau sans nucléase. Ajoutez ensuite un microlitre de tampon d’ADN ligase commercial.

Effectuez toutes les étapes suivantes sur la glace. Ensuite, ajoutez 1 microlitre contenant 35 à 50 nanogrammes par microlitre du plasmide de destination bleu pGR, 1 microlitre des 40 terminateurs recuits nanomolaires, 0,5 microlitre d’endonucléase de restriction BSA1 haute fidélité commerciale et 0,5 microlitre d’ADN ligase commerciale. Centrifugez le mélange réactionnel à 10 000 x g pendant 120 secondes.

Placez ensuite le tube directement dans le thermocycleur et lancez le programme suivant. 20 cycles de 1 minute à 37 degrés Celsius, suivis de 1 minute à 16 degrés Celsius puis d’un cycle de 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’essai, congelez et stockez les échantillons à 20 degrés Celsius, ou procédez immédiatement à la transformation.

Transformer les réactions de ligature en cellules E. coli chimiquement compétentes en utilisant tout protocole de transformation approprié. Ici, les cellules JM109 sont transformées à l’aide de la transformation rapide.

À l’aide d’un bâton de hockey en verre en forme de L, étalez 25 microlitres de cellules transformées sur des plaques de gélose LB préchauffées contenant 1 ampicilline millimolaire et 10 millimolaires d’arabinose. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ne les incubez pas plus de 24 heures.

L’ampicilline se dégrade rapidement. Le lendemain, inspectez la couleur des colonies. Une ligature réussie doit être blanche ou jaune à la lumière visible, et deviendra fluorescente en vert sous la lumière bleue ou UV.

Une ligature infructueuse produira une colonie de couleur bleue sous la lumière visible. Pour chacun des terminateurs et des commandes, préparez un tube à essai contenant 5 millilitres de bouillon LB stérile avec 1 millimolaire d’ampicilline et 10 millimolaires d’arabinose. Lors de l’exécution de ce protocole, avec pGR, il est vraiment important de s’assurer que les contrôles appropriés sont en place.

Le premier contrôle ne devrait être que du bouillon LB. Le prochain contrôle devrait être les cellules qui ont une résistance à l’ampicilline, mais qui ne sont pas fluorescentes sous la lumière bleue. Ceux-ci serviront de blanc.

Le contrôle suivant est un plasmide pGR qui n’est pas coupé, il n’a donc pas de terminateur en place et cela servira de référence pour la force du terminateur et le dernier de vos tubes sera pour votre échantillon. Sous la lumière visible, utilisez une boucle stérile pour prélever 2 à 3 colonies blanches ou jaunes et transférez-les dans le bouillon LB. Laissez les échantillons incuber sur un agitateur à 37 degrés Celsius à 160 tr/min pendant 16 à 18 heures.

Le lendemain, à l’aide d’un spectrophotomètre, déterminez la densité des cellules optiques de chaque échantillon à 600 nanomètres. En général, après cette période, on s’attend à ce qu’une OD 600 de 0,8 à 1,0 soit attendue. Placez une plaque stérile à 96 puits dans la hotte.

Pour chaque échantillon ou contrôle, préparez 3 puits avec 199 microlitres de bouillon LB stérile avec de l’ampicilline et de l’arabinose. Ensuite, pipetez 1 microlitre de la solution cellulaire des bouillons de nuit dans les puits individuels de la plaque à 96 puits. Remplissez les plaques d’un couvercle respirant, puis secouez-les pendant 18 à 20 heures à 37 degrés Celsius et 160 tr/min.

Le lendemain, à l’aide d’un lecteur de plaques, déterminez la DO 600, qui doit être d’environ 0,5. Mesurez également la fluorescence G de P à une longueur d’onde d’excitation de 395 nanomètres et à une émission de 509 nanomètres. Mesurez la fluorescence RFP à une longueur d’onde d’excitation de 575 nanomètres et une émission de 605 nanomètres.

À l’aide d’Excel, normalisez la variation de croissance en divisant la fluorescence par la DO 600. Après la normalisation, déterminez l’intensité relative de la terminaison en prenant la fluorescence de la terminaison GFP sur la fluorescence de contrôle GFP et en la divisant par la fluorescence de terminaison RFP sur la fluorescence de contrôle RFP. Les terminateurs fixes présumés T1 à 6 identifiés bio-informatiquement dans le phage bernal 13 de la microbactérie ont été analysés comme décrit dans cette vidéo.

Ces résultats montrent une fluorescence relative. Tous les résultats ont été normalisés à l’aide de cellules contenant des régulateurs de croissance non coupés et non modifiés comme témoin. T3 s’est avéré être un terminateur puissant.

Tous les résultats représentent des colonies individuelles cultivées en trois exemplaires et moyennées pour la représentation visuelle. Les barres d’erreur représentent les écarts entre les points de données moyennés. Afin de déterminer le meilleur contrôle de référence pour quantifier l’intensité du terminateur, on a comparé les données brutes utilisant le plasmide pGR original ne contenant aucun terminateur et le bleu pGR cloné avec une séquence connue pour ne pas être un terminateur.

Comme on peut le voir ici, les deux témoins ont montré des niveaux similaires d’expression de GFP et de RFP et, plus important encore, ont produit des ratios GFP/RFP similaires. Tous ces résultats représentent des colonies individuelles qui ont été cultivées en trois exemplaires et dont la moyenne a été calculée pour la représentation visuelle. Une fois maîtrisée, cette technique peut prendre aussi peu que 72 heures, y compris le temps d’expédition et de commande.

Il est important de noter que le pGR bleu ne fonctionne que dans E.coli. De plus, comme nous ne regardons qu’un petit morceau du terminateur, nous n’avons vraiment aucune idée d’autres éléments régulateurs qui pourraient contrôler la transcription. Pour vérifier les résultats obtenus avec ce protocole en utilisant le pGR blue, des méthodes supplémentaires peuvent être utilisées, comme la PCR quantitative.

De plus, l’insert pGR peut être découpé et ligaturé dans un plasmide de votre choix.