ARN-ADN Extraction simultanée de sédiments côtiers et Quantification de 16S ARNr et Transcriptions par PCR en temps réel

L’objectif global de cette procédure est d’extraire de l’ADN et de l’ARN de haute qualité et à haut rendement des sédiments marins côtiers, puis de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARN ribosomique 16S. Cette méthode décrivant l’extraction d’ADN et d’ARN à partir de sédiments marins, suivie d’une PCR quantitative, est une étape clé dans l’analyse moléculaire de l’abondance et de la diversité microbiennes dans l’environnement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour coextraire l’ADN et l’ARN d’un même échantillon, qui peut ensuite être utilisé pour une analyse en aval, comme la PCR quantitative.

La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Enrico Tatti de NUI Galway et Duncan Sweeney, doctorant à l’Université d’Essex. Pour coextraire l’ADN et l’ARN des sédiments côtiers après avoir préparé des matériaux exempts d’ARN et collecté des échantillons de sédiments côtiers conformément au protocole textuel, transférez 0,5 gramme de sédiment dans un tube de lyse de billes de deux millilitres. Ajoutez 500 microlitres de tampon phosphate CTAB et 500 microlitres d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique dans le tube et retournez cinq à 10 fois pour homogénéiser l’échantillon.

Vortex à pleine vitesse pendant 2,5 minutes avant de tourner à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, dans une hotte, extrayez la couche aqueuse supérieure et transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, placez les échantillons sur de la glace et ajoutez 500 microlitres de chloroforme :alcool isoamylique glacé.

Ensuite, retournez le tube plusieurs fois jusqu’à ce qu’une émulsion soit visible et centrifugez comme précédemment. Dans une hotte, extrayez la couche aqueuse supérieure et placez-la dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, pour précipiter les acides nucléiques, ajoutez deux volumes de solution de chlorure de sodium à 30 % PEG et mélangez bien.

Incuber sur de la glace pendant deux heures ou laisser les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, centrifugez les échantillons à 16 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. À l’aide d’une micropipette, retirez délicatement le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille.

Laissez environ 10 microlitres de solution PEG dans le tube et ajoutez un millilitre d’éthanol glacé à 70 %. Après avoir fait tourner l’échantillon, utilisez une micropipette pour retirer lentement l’éthanol, en prenant soin de ne pas toucher la pastille. Ensuite, centrifugez pendant cinq secondes et retirez l’éthanol résiduel.

Laissez le granulé sécher à l’air libre pendant cinq minutes avant d’utiliser 50 microlitres d’eau traitée au DEPC pour le remettre en suspension. Aliquote un échantillon de 15 microlitres pour l’ADN et de 30 microlitres pour l’ARN. L’étape la plus critique consiste à s’assurer que la pastille d’ADN/ARN n’est pas délogée lors de l’élimination du surnageant et qu’il ne reste pas d’éthanol résiduel avant de remettre la pastille en suspension dans l’eau, car elle inhibe la réaction moléculaire en aval.

Pour digérer l’ADN dans l’échantillon d’ARN, ajoutez trois microlitres de tampon DNase I et 1,5 microlitre de DNase I à l’aliquote d’acide nucléique de 30 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Mélangez le réactif d’inactivation de la DNase en tourbillonnant pendant 30 secondes.

Ajoutez ensuite 4,8 microlitres de la solution à l’échantillon et incubez à température ambiante pendant cinq minutes, en tapotant de temps en temps le fond des tubes pour mélanger la solution. Après avoir fait tourner l’échantillon, transférez le surnageant contenant l’ARN dans un nouveau tube, en prenant soin de ne pas transférer le précipitant. Pour vérifier la qualité de l’ARN, diluez deux microlitres d’ARN, un sur 10, en ajoutant 18 microlitres d’eau déminéralisée stérile sans RNase.

Dans les réactions PCR séparées, ajoutez un microlitre d’ARN pur ou une dilution sur 10 dans un tube PCR stérile de 0,5 millilitre. En suivant le tableau dans le protocole de texte, ajoutez les composants de la réaction PCR pour amplifier le gène de l’ARN ribosomique 16S. Inclure un contrôle positif, un contrôle inhibiteur de PCR et un contrôle négatif.

Exécutez ensuite les réactions PCR à l’aide des paramètres d’amplification suivants. Pour générer l’ADNc du premier brin à partir de l’ARN, ajoutez les réactifs de réaction dans un tube PCR de 0,2 millilitre conformément au protocole texte. Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Placez ensuite les échantillons sur de la glace pendant au moins une minute avant de les incuber à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajoutez les réactifs dans le tableau indiqué ici à partir du protocole textuel et incubez à 55 degrés Celsius pendant 50 minutes. Ensuite, inactivez la réaction à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir généré des étalons d’ADN et d’ARN pour la qPCR selon le protocole de texte, décongelez les échantillons d’ADN environnemental et d’ADNc, les étalons et les réactifs de qPCR sur de la glace. Diluez les étalons d’acide nucléique et préparez une dilution sur 10 de l’ADN environnemental et de l’ADNc, de l’état pur à 10 à moins trois. Faites un master mix pour le nombre total de réactions plus 10 % et mélangez bien.

Ajoutez 19 microlitres de mélange principal et un microlitre de matrice en trois exemplaires à chaque puits dans une plaque qPCR optique de 96 puits. Utilisez un couvercle optique qPCR pour couvrir la plaque. Ensuite, centrifugez brièvement la plaque et chargez-la dans le bloc chauffant de la machine qPCR.

Ensuite, ouvrez le logiciel de gestion qPCR, puis cliquez sur l’onglet Protocole, cliquez sur Créer et ajoutez les conditions d’amplification suivantes. Réglez le volume d’échantillon sur 20 microlitres, cliquez sur OK et enregistrez le protocole. Choisissez maintenant l’onglet Plaque.

Ensuite, sous Modifier la sélection, cliquez sur Sélectionner un fluorophore. Ajoutez le colorant rapporteur pour la sonde appropriée et cliquez sur OK. Mettez en surbrillance les puits contenant les normes, puis dans le menu Type d’échantillon, sélectionnez Standard. Choisissez Répliquer la série pour définir la taille de la réplication sur trois, puis cliquez sur Appliquer.

Choisissez Série de dilution pour ajouter la concentration de départ calculée pour la concentration standard. Indiquez le facteur de dilution de 10, sélectionnez Décroissant ou Croissant selon l’ordre dans lequel la courbe standard a été ajoutée à la plaque, puis cliquez sur Appliquer. Mettez en surbrillance les positions de puits contenant les échantillons inconnus et sélectionnez Inconnu dans le menu déroulant Type d’échantillon.

Choisissez Répliquer la série et définissez Taille de réplication sur trois, puis cliquez sur Appliquer. Sous Nom de l’échantillon, modifiez les noms des échantillons et répétez la procédure pour les puits sans gabarit. Ensuite, dans la boîte de l’éditeur de plaques, cliquez sur OK et enregistrez le fichier.

Cliquez ensuite sur Démarrer l’exécution. Une fois l’exécution terminée, choisissez l’onglet Quantification pour afficher la courbe standard, les descripteurs de courbe standard et les graphiques d’amplification. Enfin, choisissez l’onglet Données de quantification pour les valeurs Cp et la quantité de départ correspondante pour les gènes d’échantillons inconnus.

Déterminer le nombre de copies de gènes par gramme de sédiment de poids humide selon le protocole de texte. Comme le montre cette image en gel, une extraction réussie d’acide nucléique produit des bandes d’ADN et d’ARN claires où des bandes d’ARN ribosomique 23S et 16S sont visibles en plus de la présence d’une bande d’ADN génomique de haut poids moléculaire. Cette figure montre que lorsqu’une plage de dilution décuplée est correctement préparée et amplifiée pour générer une courbe standard à utiliser pour la réaction qPCR, une différence de cycle de 3,3 entre chaque dilution standard est observée.

Il est important de signaler le point de croisement, ou les valeurs Cp, à partir du contrôle no template, ou NTC, le cas échéant. Si cela se produit, un seuil de Cp pour les échantillons standard et inconnus de 3,3 cycles ou un pli logarithmique supérieur à la valeur Cp du NTC est imposé comme décrit précédemment. Ici, une amplification de l’échantillon environnemental de 10 à moins un, de 10 à moins deux et de 10 à moins trois dilutions a été effectuée.

L’échantillon pur n’a pas amplifié et les valeurs de Cp de 10 puissance moins un à 10 puissance moins trois dilutions étaient respectivement de 24,12, 26,02 et 28,40. Comme le montre ce graphique, des descripteurs de courbe standard, y compris les valeurs R carré de 0,99 et les efficacités de la PCR dans la plage de 90 à 110 %, sont souhaités. Dans cette expérience, le Cp NTC était de 30,5 et un seuil de Cp négatif de 27,2 a été imposé.

La conversion de l’abondance des gènes en pourcentage par gramme de sédiment de poids humide a donné des dilutions de 2,5 fois 10 puissance septième et de 7,1 fois 10 puissance sept pour les dilutions de 10 puissance moins un et de 10 puissance moins deux, respectivement. La dilution de 10 à moins trois Cp était supérieure au seuil NTC. Dans ce cas, le 10 puissance moins deux a été sélectionné comme dilution optimale de la matrice.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ARN peut être rapidement dégradé, il est donc important de conserver l’échantillon sur de la glace et d’utiliser des gants pour éviter la contamination par la RNase tout le temps. N’oubliez pas que nous travaillons avec du phénol : chloroforme et de l’alcool isamylique, ce qui peut être extrêmement dangereux. Et des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire, de gants et de lunettes de protection et le travail sous une cagoule chimique doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire l’ADN et l’ARN et de quantifier l’abondance des gènes et des transcrits dans les sédiments côtiers marins. N’oubliez pas que cette procédure peut être facilement utilisée pour extraire de l’ADN et de l’ARN et pour quantifier une gamme de cibles génétiques à partir de la plupart des échantillons environnementaux, y compris le sol.