Name: ARN-ADN Extraction simultanée de sédiments côtiers et Quantification de 16S ARNr et Transcriptions par PCR en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Apprenez l'extraction simultanée d'ADN et d'ARN à partir de sédiments côtiers et la quantification des gènes et transcrits 16S ARNr par PCR en temps réel. Cette méthode permet d'analyser l'abondance microbienne.

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Cette publication a émané de la recherche menée avec le soutien financier du Natural Environment Research Council (NERC) sous le numéro de subvention NERC NE / JO11959 / 1 et de la Science Foundation Ireland &amp; Marie-Curie d&#39;action COFUND sous le numéro Grant 11 / GSS / B2159awarded à CJS et l&#39;Academic Research Consortium de l&#39;Est (ARC Est).

1. ADN et ARN Extraction de sédiments marins côtiers <ol><li> Préparation de la ribonucléase (RNAse) matériau -free et espace de travail <ol><li> Préparer de l&#39; eau distillée sans RNase (dH 2 O) par traitement avec 0,1% de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) et incuber à 37 ° CO / N. Retirer DEPC résiduelle par autoclavage dH 2 O à 121 ° C pendant 15 min. Utilisez DEPC traité dH 2 O pour faire toutes les solutions. </li><li> Cuire au four toute la verrerie à 180 ° CO / N. Retirer les couvercles et les jantes en plastique, les tremper dans une solution de 2 M NaOH O / N, et les rincer à l&#39; DEPC traité dH 2 O avant utilisation. </li><li> Préparer une solution tampon CTAB phosphate selon le tableau 1. </li><li> Préparer la solution de précipitation PEG-NaCl selon le tableau 2. </li><li> Nettoyez toutes les surfaces de travail (c. -à- banc, microcentrifugeuse, la hotte aspirante) et micropipettes en utilisant une solution RNAse décontaminer avant de commencer. Porter des gants pendant toute la procédure. </li&gt; <li> Utilisez plasticware sans RNAse ainsi que des conseils de filtre micropipette pour éviter la contamination croisée échantillon. </li></ol></li><li> la collecte d&#39;échantillons de l&#39;environnement et de stockage <ol><li> Collecter les sédiments côtiers à marée basse en utilisant un 50 ml tube Falcon stérile de 2,5 cm supérieurs. Collecter environ 15-20 g de sédiments. Bien refermer le couvercle après le prélèvement de l&#39;échantillon. Transport immédiatement au laboratoire dans une glacière à 4 ° C pour un traitement immédiat. </li><li> Homogénéiser l&#39;échantillon en mélangeant avec une spatule stérile et aliquote de 0,5 g de sédiment de poids humide dans un tube à cordon de battement 2 ml. Aliquotes répétitions supplémentaires, flash-gel en plaçant dans l&#39;azote liquide. aliquotes Conserver à -80 ° C. Attention: Porter des gants et des lunettes de sécurité lors de la manipulation de l&#39;azote liquide. Note: Si le site de terrain ne se trouve pas à proximité d&#39;un laboratoire, aliquote de 0,5 g de sédiments dans 2 ml microtubes stériles sur le site de terrain. Flash geler les tubes en les mettant immédiatement en liazote quid et le transport au laboratoire. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à la transformation. </li></ol></li><li> Co-extraction de l&#39;ADN et de l&#39;ARN à partir des sédiments Remarque: Le protocole suivant est une version modifiée de la méthode Griffiths 6. <ol><li> Ajouter 500 pi de tampon CTAB-phosphate et 500 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) dans le tube de perles lyser 2 ml contenant 0,5 g de sédiments et d&#39;inverser le tube 5-10 fois pour homogénéiser l&#39;échantillon. Attention: Effectuez cette étape dans un hottes portant un équipement de protection approprié (c. -à , manteau de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité) en tout temps. </li><li> Vortex à pleine vitesse pendant 2,5 minutes. Centrifugeuse à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Dans un hottes extraire la couche aqueuse supérieure et transférer à un nouveau 1,5 ml microtube stérile. Garder les échantillons sur la glace, ajouter 500 pi de glace froide chloroforme: alcool isoamylique (24: 1). </li><li> Inversez plusieurs fois jusqu&#39;à ce qu&#39;une émulsion est Visible. Centrifugeuse pendant 10 min à 16 000 xg à 4 ° C. </li><li> Dans un hottes extraire la couche aqueuse supérieure et le placer dans un nouveau 1,5 ml tube stérile. Précipiter les acides nucléiques en ajoutant deux volumes de solution à 30% PEG- NaCl et bien mélanger. </li><li> Incuber sur la glace pendant 2 heures ou à laisser des échantillons à 4 ° CO / N. </li><li> A la fin de centrifuger les échantillons d&#39;incubation à 16 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Remarque: Une pastille peut être visible au fond du tube. </li><li> Retirez délicatement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une micropipette, assurez-vous de ne pas perturber le culot. Laisser environ 10 pi de solution PEG dans le tube et ajouter 1 ml de glace-froid à 70% d&#39;éthanol. </li><li> Centrifugeuse pendant 20 min à 16 000 xg à 4 ° C. Retirer lentement l&#39;éthanol avec une micropipette en prenant soin de ne pas toucher le culot. </li><li> Centrifuger pendant 5 sec et éliminer l&#39;éthanol résiduel en utilisant une micropipette. Laissez le culot sécher à l&#39;air pendant environ 5 min. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 50 ul traitée au DEPCH 2 O. Examiner la qualité et le rendement de l&#39; ADN / ARN par électrophorèse sur gel d&#39; agarose en retrait de 5 pi sur un gel d&#39;agarose à 1% 19. Divisez les acides nucléiques en deux aliquotes, 15 pi de l&#39;ADN et 30 pi pour l&#39;ARN. </li><li> Stocker l&#39;ADN à -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. Isoler ARN tel que décrit dans la section suivante. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de l&#39;ARN et de Contrôle de la qualité de l&#39;ARN sans ADN <ol><li> Digestion de l&#39;ADN <ol><li> Ajouter 3 pi de tampon de DNAse I et de 1,5 pi de DNase I à 30 ul volume d&#39;acides nucléiques, incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Mélanger le réactif ADNase Inactivation par tourbillonnement pendant 30 s. Ajouter 4,8 ul de la solution à l&#39;échantillon. Incuber à température ambiante pendant 5 min, de temps en temps appuyez sur le fond des tubes pour mélanger la solution. </li><li> Centrifugeuse à 10.000 xg pendant 90 secondes à la température ambiante, transférer le surnageant (ARN) dans un nouveau tube, en prenant soin de ne pas transférer précipité qui peut inhiber les réactions en aval. </li&gt; </ol></li><li> Contrôle de la qualité de l&#39;ARN <ol><li> Ajouter 2 ul d&#39;ARN à 18 pi de stériles dH sans RNAse-2 O pour diluer 1:10. <ol><li> Dans les réactions PCR séparées, ajouter 1 pl de dilution pur ou 1:10 de l&#39;ARN à 0,5 ml tube stérile PCR. Ajouter PCR composants de réaction pour amplifier le gène ARNr 16S selon le tableau 3. Inclure un (par exemple., L&#39; ADN extrait d&#39;une culture bactérienne pure), un «PCR inhibiteur&quot; contrôle &quot;positif&quot; (ie, 1 pl de l&#39; ADN de culture pure positive et 1 pi d&#39;ARN extrait pur) et un contrôle «négatif» de dH sans RNAse stérile 2 O. </li></ol></li><li> Régler le thermocycleur avec les paramètres d&#39;amplification suivantes: 95 ° C 5 min, 95 ° C (30 s, 57 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min) x 35 cycles, 72 ° C 10 min. </li><li> Exécuter 10% du produit de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1% à 85 V pendant 40 min. Répéter le traitement à la DNase I, si un produit PCR est formé dans l&#39;environnement RNA échantillons. </li></ol></li></ol> 3. Génération de premier brin d&#39;ADNc à partir d&#39;ARN <ol><li> Ajouter les réactifs selon le tableau 4 à un RNAse / DNAse 0,2 ml de tube PCR. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 65 ° C 5 min. Placer sur de la glace pendant au moins 1 min, puis on incube à 25 ° C pendant 10 min. </li><li> Dans le même tube ajouter les réactifs listés dans le Tableau 5. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 55 ° C pendant 50 min. Inactiver la réaction à 72 ° C pendant 10 min. </li><li> ADNc de magasin à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. PCR quantitative <ol><li> Génération de normes d&#39;ADN pour qPCR <ol><li> Amplifier la séquence d&#39; ARNr 16S bactérienne 20 (ou toute autre séquence d&#39;intérêt) à partir de l&#39; ADN génomique extrait d&#39; une culture pure avec des amorces de PCR (q-1369F et 1492R 21). </li><li> On purifie le produit PCR en utilisant un kit commercial selon les instructions du fabricant. </li><li> Clone du PCR purifiéproduit en un débord 3 &#39;T clonage système de vecteur selon les instructions du fabricant. </li><li> Transformer le vecteur contenant le PCR insérer dans Escherichia coli cellules compétentes JM109 selon les instructions du fabricant. </li><li> Plaque 50 pi de transformation ONTO ampicilline (100 pg / ml), X-gal (20 pg / ml) et IPTG (0,5 mM) de Luria Bertani plaques de gélose (tryptone 10 g / L, extrait de levure 5 g / L, NaCl 10 g / l, agar 15 g / L). Incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Sélectionnez un seul transformant blanc positif de la plaque. Inoculer le transformant positif dans 50 ml de bouillon LB contenant 100 ug / ml d&#39;ampicilline et incuber O / N agitation à 250 tours par minute à 37 ° C. </li><li> De l&#39;O / N culture, d&#39;isoler et de purifier le plasmide en utilisant un kit commercial selon les instructions du fabricant. </li><li> Linéariser le plasmide en utilisant une enzyme de restriction appropriée qui est capable de couper le plasmide une fois (par exemple Eco RI). </li><li<html> &gt; Analyse de la pureté du plasmide en mesurant le rapport d&#39;absorption A260 / 280 19. Si le ratio est inférieur à 1,8, re-extraire le plasmide avec du phénol-chloroforme 19. Remarque: L&#39;ADN pur a un rapport de 1,8. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39; ADN plasmidique par l&#39; absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre 19. Remarque: En variante, la précision de la quantification peut être améliorée par l&#39;utilisation d&#39;un colorant de liaison à l&#39;ADN fluorescent utilisé en conjonction avec un fluoromètre. </li><li> Séquence du plasmide insérer pour confirmer la taille de la cible dans des bases. Calculer la quantité (c. -à- pourcentage) d&#39;ADN inséré dans le plasmide (par exemple dans un vecteur de 3000 pb, un fragment d&#39;ADN de 123 pb est de 3,9% de l&#39; ADN total) et multiplier par la concentration obtenue dans l&#39; 04/01/10, pour déterminer la la concentration d&#39;ADN de la cible (insert). </li><li> Utilisez l&#39;équation suivante pour calculer les copies de cible par ul: charge / 54067 / 54067eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Calculer le poids cible moléculaire (TMW) en multipliant le nombre de paires de bases de l&#39;ADN cible par le poids moléculaire moyen de l&#39;ADN double brin (dsDNA, 660 Daltons par paire de base). </li><li> Diluer l&#39;ADN cible dans une plage de 10 10 à 10 2 copies en utilisant 2 pi d&#39;ADN et 18 pi de dH 2 O stérile Mélanger chaque puits de dilution et centrifuger brièvement avant de prendre la prochaine dilution. </li></ol></li><li> Génération de la courbe standard d&#39;ARN pour qPCR <ol><li> De l&#39; étape 4.1.5, écran un certain nombre de colonies blanches (environ 5) par PCR sur colonie 19 utilisant l&#39;amorce inverse cible (ie, R1492) et le plasmide vecteur avant l&#39; amorce M13F. Remarque: Cette combinaison d&#39;amorces va amplifier les inserts clonés dans l&#39;orientation sens correct avec un site promoteur T7 en amont. </li><li> Purifier le produit PCR en utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant. Quantifier le p PCR purifiéroduit à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. </li><li> Ajouter 200 ng de produit de PCR dans un volume final de 20 ul avec 7,5 mM de chaque ribonucleotide, un tampon de réaction 1 de T7 et une polymerase de T7 pour l&#39; enzyme in vitro réaction de transcription. </li><li> Incuber la réaction pendant 4 heures à 37 ° C. Ajouter 1 unité de RNase DNase I à la réaction, incuber pendant 15 min à 37 ° C pour éliminer la matrice d&#39;ADN. </li><li> Récupérer l&#39;ARN transcrit in vitro par précipitation à l&#39; éthanol 19 et de quantifier les rendements d&#39;ARN en utilisant un fluorimètre ou par absorbance à 260 nm. </li><li> Calculer le nombre de transcription par ul d&#39;ARN. Ajouter le nombre de paires de bases dans l&#39;ARN cible (par exemple, 123 bases) de la longueur du promoteur T7 (153 bases) et multiplier par le poids moléculaire moyen de l&#39; ARN, 340 Daltons par base. </li><li> Ajouter 500 ng d&#39;ARN cible quantifiée à une réaction de la transcriptase inverse (RT), comme indiqué dans la section 3. En série dilué l&#39;ADNc tel que décrit dans 4.1.13 pour une utilisationcomme la courbe standard. </li></ol></li><li> PCR en temps réel <ol><li> ADN environnemental Thaw / échantillons d&#39;ADNc, des normes et des réactifs qPCR sur la glace. Protéger la sonde fluorogène de la lumière. </li><li> Diluer les normes pour la courbe standard comme indiqué dans 4.1.14. Faire des dilutions 1:10 de l&#39;ADN de l&#39; environnement / ADNc de pur à 10 -3 en ajoutant 2 ul d&#39;échantillon à 18 pi de dH stérile 2 O. </li><li> Faire une réaction maître de mélange pour le nombre total de réactions plus 10% selon le tableau 6 (amorces et la sonde) et le tableau 7 (mélange réactionnel). Bien mélanger et centrifuger brièvement. </li><li> Ajouter 19 pi de mélange maître et 1 pl de modèle (standard, l&#39;échantillon de l&#39;environnement ou de l&#39;eau pour le contrôle négatif) à chaque puits dans une plaque à 96 puits optique qPCR. Effectuez chaque réaction (normes, des échantillons environnementaux et des contrôles négatifs) en triple. </li><li> Couvrir la plaque de 96 puits avec un couvercle optique q-PCR. Centrifuger brièvement la plaque. Chargez lela plaque dans le bloc de chauffage de la machine qPCR et fermer le couvercle. </li><li> Ouvrez le logiciel de gestion qPCR. Cliquez sur l&#39;onglet &quot;protocole&quot;, cliquez sur &quot;créer un nouveau&quot;, ajouter les conditions d&#39;amplification suivantes: 3 min 95 ° C, (10 sec 95 ° C, 30 sec 60 ° C) x 40 cycles. Régler le volume de l&#39;échantillon à 20 pi, cliquez sur &quot;OK&quot; et enregistrez le protocole. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Plate&quot;. Sous &quot;Modifier la sélection&quot; cliquez sur &quot;sélectionner fluorophore&quot;, ajouter le rapport colorant pour la sonde appropriée, par exemple, la fluorescéine. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Mettez en surbrillance les puits contenant les normes, sélectionnez &quot;standard&quot; dans le menu &quot;de type d&#39;échantillon&quot;. Cliquez sur &quot;répliquer série&quot; pour changer &quot;répliquer taille&quot; à 3, cliquez sur &quot;appliquer&quot;. Cliquez sur &quot;série de dilution&quot; pour ajouter la concentration de départ calculée pour la norme 1, indiquer le facteur de dilution (10), sélectionnez «en baisse» ou «augmenter», selon l&#39;ordre a été ajouté la courbe standardà la plaque. Cliquez sur &quot;Appliquer&quot;. </li><li> Mettez en surbrillance et positions contenant les échantillons inconnus, sélectionnez «inconnu» du «type d&#39;échantillon&quot; dans le menu déroulant. Cliquez sur &quot;répliquer série&quot; et changer &quot;répliquer taille&quot; à 3. Cliquez sur &quot;appliquer&quot;. Modifier les noms d&#39;échantillons sous &quot;nom de l&#39;échantillon&quot;. Répéter la procédure pour les contrôles sans matrice (NTC) puits. </li><li> Cliquez sur &quot;OK&quot; sur la boîte de l&#39;éditeur de plaque et enregistrer le fichier. Cliquez sur &quot;start run&quot;. </li><li> À l&#39;issue de la course, la fenêtre d&#39;analyse de données ouvrira. Cliquez sur l&#39;onglet &quot;quantification&quot; pour afficher la courbe standard, les descripteurs standards de la courbe (tableau 8) et des parcelles d&#39;amplification. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Données de quantification&quot; pour les valeurs de Cp et correspondant à partir du gène quantité (SQ) d&#39;échantillons inconnus. table Exporter vers un logiciel tableur si nécessaire. </li><li> abondances géniques Multiply à partir d&#39;échantillons inconnus par le facteur de dilution, la quantité de sédiments extraccié et les acides nucléiques volume total ont été élues pour obtenir des copies de gènes par gramme de sédiments de poids humide. Note: Éluer l&#39;ADN de 0,5 g de sédiments dans 50 ul, diluer 1/10, ajouter 1 pl comme matrice pour une réaction q-PCR; calculer copies du gène g -1 sédiments en multipliant: copies du gène pi de l&#39; ADN x dilution du volume x facteur d&#39;élution x 2. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La combinaison de l&#39;ADN d&#39;extraction / d&#39;ARN avec qPCR fournit une méthode rapide, précise, relativement rentable pour la quantification sensible du gène et de transcription abondances à partir d&#39;une gamme d&#39;échantillons environnementaux, tels que les sédiments côtiers. L&#39;extraction d&#39;acide nucléique initiale est l&#39;étape critique pour assurer une vue représentative de la communauté microbienne présente est atteint 22. Un certain nombre de limites doivent être pris en considération pour le protocole d&#39;extraction: a) la réalisation de la lyse totale des cellules, b) la co-extraction des composés inhibiteurs (par exemple, des acides humiques ou polyphénoliques), c) l&#39; ADN contaminant dans la fraction d&#39;ARN, d) dégradation rapide des acides nucléiques extraits lorsqu&#39;ils sont stockés. Des précautions doivent être prises afin de contourner ces limitations. Par exemple, un soin particulier doit être pris pour assurer que l&#39;extraction des acides nucléiques est optimisée pour le type d&#39;échantillon (par exemple, les sédiments, le sol, les eaux usées, etc.). Des améliorations significatives dans le rendement d&#39;acide nucléique et de la qualité à la fois l&#39; ADN et l&#39; ARN peuvent être obtenus en réalisant des expériences préliminaires 23. Afin de minimiser l&#39;effet des composés inhibiteurs sur les applications basées sur la PCR 24, tester une gamme de dilutions de l&#39;ADN extrait et de l&#39; ARN. Pour contourner la dégradation rapide de l&#39;ADN / ARN extrait à partir de plusieurs cycles de gel-dégel et d&#39;éviter la perte possible de l&#39;information génétique, enregistrer plusieurs petites portions de volume à -80 ° C. Lorsqu&#39;ils sont conçus avec soin, qPCR est une méthode robuste, hautement reproductible et sensible. Notamment, les méthodes d&#39;amplification et de construction de courbe standard décrites dans ce protocole peuvent être adaptés à toute cible de gène d&#39;intérêt, y compris d&#39; autres marqueurs phylogénétiques (ie, archées ARNr 16S, 18S fongiques ARNr) ou des gènes impliqués dans des fonctions importantes dans l&#39;environnement. Limitations connues dans l&#39;utilisation de qPCR sont: a) la génération de reproductibles de haute qualité scourbe de tandard pour la quantification absolue, b) le choix des amorces / sondes et l&#39;optimisation des conditions d&#39;essai q-PCR, c) l&#39;utilisation de faible qualité / acides nucléiques cisaillées, d) le choix de la dilution de travail de l&#39;ADN / ARN pour éviter l&#39;inhibition . En outre, il doit être considéré que la technique qPCR fournit abondances gène / transcription qui peut ne pas assimiler à la cellule compte: ceci est particulièrement le cas lorsque les gènes 16S et 18S sont ciblés, comme les micro-organismes ont différents nombres de copies du gène ribosomal dans leur génome 25. courbes standard de mauvaise qualité se traduira par une quantification inexacte du gène d&#39;intérêt. Il est de bonne pratique pour stocker un stock de normes de concentration élevées en petites portions à partir de laquelle les courbes standard fraîches peuvent être faites. Ne pas stocker des courbes standard, toujours faire des dilutions fraîches à partir d&#39;un stock de la plus forte concentration à chaque fois. Pour la quantification précise des échantillons environnementaux assurer la gamme de concentrations de l&#39;stancourbe de dard couvre les valeurs Cp attendues des échantillons inconnus. Pour quantifier la transcription, la construction de la courbe standard à partir d&#39;ARN pas l&#39;ADN double brin. Lorsque cela est possible, la quantification des échantillons d&#39;être directement comparés doit être achevée dans un seul essai pour éviter inter-essai variation 20. Cela peut ne pas être toujours possible. Par conséquent, pour comparer les abondances de gènes générées entre les dosages, il est conseillé d&#39;avoir un sous-ensemble aléatoire d&#39;échantillons répliqués entre les dosages. Une large sélection de amorce et de sonde ensembles sont actuellement disponibles pour qPCR ciblage taxa microbienne et des groupes fonctionnels 15. Une attention particulière est nécessaire lors de la sélection de ces pour assurer à la fois la couverture maximale et une spécificité pour le groupe cible. Si le rendement de la réaction d&#39;un qPCR est pas satisfaisante, le dépannage commence par tester différentes conditions de cyclage thermique (tel que le temps de recuit et / ou de la température) et / ou les conditions de réaction, par exemple, des concentrations variant amorce-sonde. Once du dosage et les conditions de réaction q-PCR sont optimisés, toujours effectuer un premier test d&#39;une série de dilutions d&#39;ADN / ADNc pour déterminer la concentration de modèle approprié. Sélectionnez la plage de dilution résultant du nombre de copies plus élevé que la dilution du modèle optimal pour d&#39;autres essais. Actuellement, les technologies de séquençage de prochaine génération mettent efficacement la lumière sur la structure et les fonctions de la communauté microbienne dans une multitude d&#39;environnements 26,27,28. Cependant, ces ensembles de données sont souvent basées sur point final PCR bibliothèques amplicon et fournissent donc que des évaluations semi-quantitatives de l&#39;abondance des taxons particuliers. Par conséquent, la capacité de la technique à base de PCR en temps réel pour cibler les marqueurs taxinomiques spécifiques (de domaine supérieur jusqu&#39;au niveau de déformation) permet de valider l&#39;efficacité des résultats obtenus par séquençage de la prochaine génération. En outre, qPCR a été utilisé avec succès en combinaison avec d&#39;autres méthodes moléculaires de l&#39;écologie microbienne tels que iso stabletope sondage (SIP) ou microarrays phylogénétiques / fonctionnels. Combiné avec l&#39;ancien outil, qPCR peut être utilisée pour quantifier la communauté métaboliquement active 29,30. Lorsqu&#39;il est combiné avec l&#39; analyse des microréseaux, qPCR fournit une interprétation quantitative clé des enquêtes basées sur des marqueurs et gènes fonctionnels phylogénétiques des environnements 31,32. Par conséquent, qu&#39;il soit utilisé seul ou en combinaison avec d&#39;autres (souvent basées sur des processus) des évaluations de la fonction de l&#39;écosystème, la PCR quantitative est un outil essentiel pour les écologistes microbiens dans l&#39;exploration du lien insaisissable entre les communautés microbiennes et les fonctions des écosystèmes.

Microorganismes sont la pierre angulaire de la fonction biosphère de l&#39;écosystème de conduite. La majorité des micro - organismes restent incultes 1. Par conséquent, les approches fondées moléculaires sont fondamentales pour faire progresser notre compréhension de la diversité et de la fonction de micro-organismes dans l&#39;environnement. Au centre de ces approches est l&#39;extraction d&#39;acides nucléiques à partir d&#39;échantillons environnementaux et l&#39;amplification subséquente des gènes cibles en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR). La première étape d&#39;extraction d&#39; ADN / ARN vise à lyser les parois cellulaires de la communauté microbienne présente, éliminer les molécules indésirables non acides nucléiques (substances par exemple, organiques et inorganiques) et de conserver l&#39; ADN / ARN en solution pour une analyse ultérieure en aval. Parmi plusieurs options disponibles dans la littérature 2,3,4,5, y compris une gamme de kits d&#39;extraction commerciale, la méthode Griffiths 6 est largement utilisé 7,8,9. Il est rentable et particularly bien adapté aux sédiments car il utilise une étape de bourrelet battant pour lyser les cellules et intègre les étapes consistant à réduire au minimum la co-extraction des inhibiteurs de la PCR, tels que les acides humiques, tout en récupérant simultanément l&#39;ADN et l&#39;ARN. La seconde étape utilise la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier des gènes cibles, tels que le marqueur taxonomique ARNr 16S, à partir des acides nucléiques extraits. Cette approche a été et continue à faciliter l&#39;exploration de la non caractérisée microbienne boîte noire 10,11. Cependant, les méthodes de point final basé sur la PCR souffrent de diverses limitations qui peuvent biaiser la caractérisation des communautés microbiennes 12. Pour quantifier précisément les abondances gène / de transcription, PCR en temps réel, également connu sous le nom de PCR quantitative (qPCR) doit être utilisé. qPCR exploite des systèmes de colorants rapporteurs fluorescents qui permettent de suivre l&#39;accumulation d&#39;amplicons après chaque cycle de la PCR. Ceci est important car cela signifie que la quantification peut se produire pendant la phase exponentielle précoce, plutôtque le point final, la phase de la réaction PCR, lorsque le rendement de l&#39;amplicon est toujours directement proportionnelle à l&#39;abondance initiale du gène cible. Deux systèmes rapporteurs sont couramment utilisés: un colorant intercalant d&#39;acide nucléique 13 et de l&#39;activité 5 &#39;3&#39; exonucléase de l&#39;ADN polymerase 14. Depuis l&#39;ancien système rapporteur se lie indistinctement à tous les ADN double brin, il peut conduire à une surestimation de la séquence cible si amplicons non spécifiques indésirables ou des dimères d&#39;amorces par produits se produisent. Pour contourner cela, une vaste optimisation de l&#39;amplification peut être nécessaire. Dans ce dernier système, modèle amplification est suivie à l&#39; aide d&#39; une combinaison d&#39;une activité 5 &#39;nuclease de la Taq polymérase qui clive un fluorophore à partir d&#39; une sonde interne. Cette caractéristique accroît la spécificité de l&#39;essai en raison de l&#39;utilisation d&#39;une sonde fluorogène qui se lie uniquement à la sequenc spécifique à la cible complémentairee entre la paire d&#39;amorce. Avec les deux chimies la quantification est réalisée en déterminant le point de passage (Cp) où l&#39;accumulation d&#39;amplicons de PCR, telle que mesurée par une augmentation de la fluorescence est significativement supérieure à la fluorescence de fond. qPCR a été largement utilisé en écologie microbienne afin de déterminer les abondances de gènes dans différents environnements 15. En outre, la transcription inverse de l&#39;ARN en ADNc est combiné avec qPCR et RT-qPCR pour quantifier l&#39;expression génique. Par conséquent, la RT-PCR quantitative et qPCR représentent des procédés rapides et efficaces pour la quantification du nombre de gènes et / ou de transcription au sein des échantillons environnementaux. Microorganismes dans les sédiments côtiers conduisent divers processus écosystémiques, y compris la minéralisation de la matière organique, la dégradation des polluants et le cycle biogéochimique des macronutriments tels que 16,17,18 d&#39;azote. La compréhension exhaustive de ces transformations nécessite une accoun complètet des populations microbiennes qui contribuent, y compris des données quantitatives sur gènes et de transcription abondances. Ici, nous introduisons une série de soigneusement testés, des protocoles simplifiés et normalisés pour la quantification des gènes et de transcription abondances ARNr 16S bactérienne dans les sédiments côtiers. Le protocole décrit le prélèvement des échantillons, l&#39;ADN simultanée et l&#39;extraction de l&#39;ARN, préparation d&#39;ARN sans ADN, le contrôle de la qualité des acides nucléiques extraits, génération de ARNr 16S-ADN et les normes de -ARN et la quantification des échantillons environnementaux. Les données quantitatives tirées des méthodes décrites ici sont nécessaires pour faire la lumière sur les communautés microbiennes de conduite des écosystèmes côtiers.

<table><tbody><tr><td>Diéthylpyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Toxique, ouvert sous le capot chimique</td></tr><tr><td>bromure de cétrimonium (CTAB)</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td>Irritant, ouvert sous le capot chimique</td></tr><tr><td>phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Phénol : Chloroforme : Isoamylalcohol pH 8</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>Équilibrer à pH 8 avant utilisation</td></tr><tr><td>Chloroforme : Isoamylalcohol</td><td>Sigma</td><td>25666</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>1.06404.0500</td><td></td></tr><tr><td>polyéthylène 6000&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>528877-100</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol de qualité moléculaire</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix E tubes</td><td>MP</td><td>Biomedical 116914050&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNAse&nbsp ;</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymérase</td><td>Sigma</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de Rnase</td><td>Life Technologies</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>sans RNAse/DNAse 0,2&nbsp ; ml Tubes PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>SureCleanPlus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>pGEM Easy T Vector</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>E. coli JM109 cellules compétentes</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>59349</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Bioline</td><td>BIO-37035</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioline</td><td>BIO-37036</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>20768.235</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT DNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q-33120</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT RNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript kit</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-84002</td><td></td></tr><tr><td>machine</td><td></td><td></td><td></td> qPCR</tr></tbody></table>

arn-adn extraction simultanée de sédiments côtiers et quantification de 16s arnr et transcriptions par pcr en temps réel

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Temps réel Réaction de polymérisation en chaîne aussi connu comme la PCR quantitative (q-PCR) est un outil largement utilisé dans l&#39;écologie microbienne pour quantifier les abondances de gènes des groupes taxonomiques et fonctionnels dans les échantillons environnementaux. Utilisé en combinaison avec une réaction de transcriptase inverse (RT-PCR quantitative), elle peut également être utilisée pour quantifier la transcription de gènes. q-PCR utilise des chimies de détection par fluorescence très sensibles qui permettent la quantification des amplicons PCR pendant la phase exponentielle de la réaction. Par conséquent, les préjugés associés à &#39;point final&#39; PCR détectés dans la phase de plateau de la réaction PCR sont évités. Un protocole pour quantifier les gènes bactériens ARNr 16S et transcriptions de sédiments côtiers par PCR en temps réel est fourni. Tout d&#39;abord, un procédé de co-extraction de l&#39;ADN et de l&#39;ARN à partir des sédiments côtiers, comprenant les étapes supplémentaires nécessaires à la préparation de l&#39;ARN exempt d&#39;ADN, est décrit. Deuxièmement, un guide étape par étape pour la quantification des gènes ARNr 16S et transcripts à partir des acides nucléiques extraits par Q-PCR et RT-PCR quantitative est décrite. Cela comprend les détails de la construction des courbes d&#39;ADN standard et de l&#39;ARN. Considérations clés pour l&#39;utilisation de tests RT-q-PCR en écologie microbienne sont inclus.

L&#39;extraction des ADN de bonne qualité et de l&#39;ARN à partir des sédiments est la première étape dans la quantification de gènes et de transcription abondances. Un succès des rendements d&#39;extraction des bandes d&#39;ADN et d&#39; ARN claires comme indiqué sur la Figure 1 pour l&#39; échantillon AC, où des bandes 23S et 16S ARNr vives sont visibles en plus de la masse moléculaire génomique bande haute de l&#39; ADN. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" width="400" /> Figure 1. ADN / extraction de l&#39; ARN. Les résultats typiques de l&#39; extraction d&#39; ADN / ARN de triplicate (ABC) 0,5 g de sédiments côtiers. 5 pi d&#39;ADN / ARN a été exécuté sur un agarose de 1,4% à 85 V pendant 40 min. Un marqueur moléculaire dans l&#39;intervalle 10,037-200 pb a été utilisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within page = &quot;1&quot;&gt; Pour préparer l&#39;ARN, une digestion de l&#39;ADN co-extraite est obligatoire. Ceci doit être suivi d&#39;ARNr 16S point final par PCR de l&#39;ARN pour s&#39;assurer que l&#39;ADN a été supprimé avec succès. Si l&#39;ADN a été complètement retirée seulement une bande dans le contrôle positif est observé. Il est important d&#39;utiliser à la fois pur et une dilution 1:10 de l&#39;ARN pour assurer les inhibiteurs ne sont pas empêcher la formation d&#39;un produit de PCR. L&#39;ARN peut maintenant subir la réaction de la transcriptase inverse pour la convertir en ADNc. Ceci peut être réalisé soit avec des amorces spécifiques d&#39;un gène ou d&#39;hexamères aléatoires. Typiquement, la réaction est effectuée dans une machine de PCR, afin d&#39;assurer un profil de température optimal. Cet ADNc est utilisé comme matrice dans la réaction subséquente qPCR. ADN et l&#39;ARN est quantifié pour déterminer la concentration de matrice utilisée dans chaque réaction. Un protocole de réaction qPCR est décrit cible ARNr 16S ADN. Pour 16S ARNr transcriptions remplacent la norme curve et la matrice avec de l&#39;ADNc. Que des échantillons inconnus sont quantifiés sur la courbe d&#39; étalonnage, il est impératif de veiller à ce que la courbe d&#39; étalonnage est de bonne qualité. La figure 2 montre la préparation de (A), des courbes d&#39; étalonnage et les dilutions d&#39;ADN de l&#39; environnement, (B), l&#39; amplification de la courbe standard et des échantillons environnementaux (C) la conversion de la courbe standard à une régression linéaire et le calcul du nombre de copies du gène. Quand une gamme de dilution de 10 fois est correctement préparé et amplifié une différence de 3,3 entre chaque cycle de dilution standard est vu (il faut 3,3 cycles pour une augmentation de dix fois dans le modèle à 100% d&#39; efficacité d&#39;amplification) (Figure 2Bi). Courbes standard descripteurs, y compris les valeurs de R 2 de 0,99 et une efficacité de PCR dans l&#39;intervalle de 90 à 110% (figure 2C) sont souhaitées. Il est important de signaler les valeurs de Cp du pas de contrôle de gabarit (NTC) si elle est présente. Si cela se produit une coupure de Cp des normes et des échantillons inconnus 3.3 cycles (&lt;em&gt; ie, un pli du journal) supérieure à la valeur de Cp du CNT est imposée 20 (Figure 2Cii). Modèle inconnu à partir d&#39; ADN extrait a été quantifié à partir de sédiments propres, 10 -1, 10 -2 et 10 -3 dilutions (B). L&#39;échantillon pur n&#39;a pas amplifier, les valeurs de Cp de 10 -1 à 10 -3 dilutions étaient 24.12, 26.02 et 28.40 respectivement. Le CNT Cp était de 30,5, une coupure NCT de 27,2 a été imposée. Convertir les abondances de gène à g -1 sédiment de poids humide a donné lieu à 2,5 x 10 7 et 7,1 x 10 7 à 10 -1 et 10 -2 respectivement pour la gamme de dilution. 10 -3 dilution Cp était inférieur au seuil de NTC, et n&#39;a donc pas utilisé. Dans ce cas , le 10 -2 a été choisi comme matrice dilution optimale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2. gène ARNr 16S qPCR amplification des normes et de l&#39; ADN extrait de l&#39; environnement de sédiments côtiers. Préparation de (A) i) courbe standard de l&#39; ADN et ii) des dilutions d&#39;ADN pour l&#39; environnement qPCR amplification, (B) qPCR amplification de i) la courbe standard de l&#39; ADN et ii) des échantillons environnementaux, Cp pour chaque échantillon sont présentés. (C) i) de régression linéaire de la courbe standard avec des descripteurs de courbe standards; ii) le calcul des abondances de gènes à partir d&#39; échantillons environnementaux. NTC:. Template Control Négatif <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> CTAB </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 X3H 2 O </td><td> 2,58 g </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2,05 g </td></tr><tr><td> dH2Û </td><td> à 100 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Préparation de tampon CTAB-phosphate. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> PEG 6000 </td><td> 30 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 9,35 g </td></tr><tr><td> dH2Û </td><td> à 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Note: ajouter PEG 6000 lentement sous chauffage et l&#39; agitation de 50 ml de dH 2 O. modérée </td></tr></tbody></table>Tableau 2. Préparation de la solution de précipitation PEG-NaCl. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> ARN non dilué / 01h10 ARN dilué </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> Tampon PCR 10x </td><td> 5,0 ul </td></tr><tr><td> dNTP 10 mM </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> 63F amorce sens </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC </td><td></td></tr><tr><td> 518R amorce inverse </td><td> 1,0 ul </td></tr><tr><td> ATT ACC GCG GCT GCT GG </td><td></td></tr><tr><td> la polymérase Taq </td><td> 0,4 pi </td></tr><tr><td> DH 2 O libre RNAse </td><td> 40,6 pi </td></tr></tbody></table>Tableau 3. qualité de l&#39; ARN maître contrôle de PCR mélange sans ADN. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> ARN </td><td> 0,5-5 pg </td></tr><tr><td> dNTP 10 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Amorce antisens 10 uM / Aléatoire hexamères 50 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC-H 2 O </td><td> Jusqu&#39;à 13 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 4. ADNc réaction de synthèse mélange A. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Buffer 5x </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 1 ul </td><html></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> transcriptase inverse </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 5. ADNc de la réaction de synthèse de mélange B. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Cible </td><td> nom Primer </td><td> Séquence </td><td> Recuit T (° C) </td><td> Référence </td></tr><tr><td rowspan="3"> bactéries ARNr 16S </td><td> Bact1369F </td><td> CGG TGA ATA CGT TCY CGG </td><td rowspan="3"> 56 </td><td rowspan="3"> Suzuki et al. , 2000 19 </td></tr><tr><td> Prok1492R </td><td> GGW TAC CTT GTT ACG ACT T </td></tr><tr><td> TM1389F (sonde) </td><td> CTT GTA CAC ACC GCC CGT C </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Tableau 6. Primer et sondes pour l&#39; analyse de l&#39; ARNr 16S q-PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> 2x Master Mix </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> amorce Forward (10 uM) </td><td> 0,8 pi </td></tr><tr><td> Amorce antisens (10 uM) </td><td> 0,8 pi </td></tr><tr><td> Sonde (10 pM) </td><td> 0,4 pi </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 7,0 pi </td></tr><tr><td> Le volume final </td><td> 19 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 7. Temps réel réaction PCR mélange. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Descriptor </td><td> Importance </td></tr><tr><td> Le coefficient de corrélation (R 2) </td><td> Une mesure de la linéarité de la courbe standard. Idéalement , il devrait être R 2 = 1. Valeur de R 2 = 0,98-0,99 sont acceptables. </td></tr><tr><td> Slope (α) </td><td> Une mesure de l&#39;efficacité de la réaction. Idéalement, il devrait être équivalent à -3,32. Valeur dans la plage comprise entre -3,58 et -3,1. </td></tr><tr><td> Efficacité (= 10 (-1 / pente -1)) </td><td> Si elle est de 100%, les modèles double après chaque cycle thermique pendant l&#39;amplification exponentielle. Une bonne gamme d&#39;efficacité se situe entre 90 et 110%. </td></tr><tr><td> Y Intercept (β) </td><td> La limite théorique de la détection de la réaction. Bien que non utilisé pour quantifier la sensibilité de la réaction, il est important lorsque l&#39;on compare les différentes courbes d&#39;étalonnage de la même cible. </td></tr></tbody></table> Tableau 8. qPCR descripteurs de réaction.

Un protocole permettant de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARNr bactérien 16S des sédiments côtiers par PCR en temps réel est fourni. La méthodologie comprend la co-extraction de l’ADN et de l’ARN ; préparation d’ARN libre d’ADN ; et la quantification du gène et du transcrit de l’ARNr 16S par RT-q-PCR, y compris la construction de la courbe standard.

ARN-ADN Extraction simultanée de sédiments côtiers et Quantification de 16S ARNr et Transcriptions par PCR en temps réel

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

L’objectif global de cette procédure est d’extraire de l’ADN et de l’ARN de haute qualité et à haut rendement des sédiments marins côtiers, puis de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARN ribosomique 16S. Cette méthode décrivant l’extraction d’ADN et d’ARN à partir de sédiments marins, suivie d’une PCR quantitative, est une étape clé dans l’analyse moléculaire de l’abondance et de la diversité microbiennes dans l’environnement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour coextraire l’ADN et l’ARN d’un même échantillon, qui peut ensuite être utilisé pour une analyse en aval, comme la PCR quantitative.La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Enrico Tatti de NUI Galway et Duncan Sweeney, doctorant à l’Université d’Essex. Pour coextraire l’ADN et l’ARN des sédiments côtiers après avoir préparé des matériaux exempts d’ARN et collecté des échantillons de sédiments côtiers conformément au protocole textuel, transférez 0,5 gramme de sédiment dans un tube de lyse de billes de deux millilitres. Ajoutez 500 microlitres de tampon phosphate CTAB et 500 microlitres d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique dans le tube et retournez cinq à 10 fois pour homogénéiser l’échantillon.Vortex à pleine vitesse pendant 2,5 minutes avant de tourner à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, dans une hotte, extrayez la couche aqueuse supérieure et transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, placez les échantillons sur de la glace et ajoutez 500 microlitres de chloroforme :alcool isoamylique glacé.Ensuite, retournez le tube plusieurs fois jusqu’à ce qu’une émulsion soit visible et centrifugez comme précédemment. Dans une hotte, extrayez la couche aqueuse supérieure et placez-la dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, pour précipiter les acides nucléiques, ajoutez deux volumes de solution de chlorure de sodium à 30 % PEG et mélangez bien.Incuber sur de la glace pendant deux heures ou laisser les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, centrifugez les échantillons à 16 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. À l’aide d’une micropipette, retirez délicatement le surnageant en veillant à ne pas déranger la pastille.Laissez environ 10 microlitres de solution PEG dans le tube et ajoutez un millilitre d’éthanol glacé à 70 %. Après avoir fait tourner l’échantillon, utilisez une micropipette pour retirer lentement l’éthanol, en prenant soin de ne pas toucher la pastille. Ensuite, centrifugez pendant cinq secondes et retirez l’éthanol résiduel.Laissez le granulé sécher à l’air libre pendant cinq minutes avant d’utiliser 50 microlitres d’eau traitée au DEPC pour le remettre en suspension. Aliquote un échantillon de 15 microlitres pour l’ADN et de 30 microlitres pour l’ARN. L’étape la plus critique consiste à s’assurer que la pastille d’ADN/ARN n’est pas délogée lors de l’élimination du surnageant et qu’il ne reste pas d’éthanol résiduel avant de remettre la pastille en suspension dans l’eau, car elle inhibe la réaction moléculaire en aval.Pour digérer l’ADN dans l’échantillon d’ARN, ajoutez trois microlitres de tampon DNase I et 1,5 microlitre de DNase I à l’aliquote d’acide nucléique de 30 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Mélangez le réactif d’inactivation de la DNase en tourbillonnant pendant 30 secondes.Ajoutez ensuite 4,8 microlitres de la solution à l’échantillon et incubez à température ambiante pendant cinq minutes, en tapotant de temps en temps le fond des tubes pour mélanger la solution. Après avoir fait tourner l’échantillon, transférez le surnageant contenant l’ARN dans un nouveau tube, en prenant soin de ne pas transférer le précipitant. Pour vérifier la qualité de l’ARN, diluez deux microlitres d’ARN, un sur 10, en ajoutant 18 microlitres d’eau déminéralisée stérile sans RNase.Dans les réactions PCR séparées, ajoutez un microlitre d’ARN pur ou une dilution sur 10 dans un tube PCR stérile de 0,5 millilitre. En suivant le tableau dans le protocole de texte, ajoutez les composants de la réaction PCR pour amplifier le gène de l’ARN ribosomique 16S. Inclure un contrôle positif, un contrôle inhibiteur de PCR et un contrôle négatif.Exécutez ensuite les réactions PCR à l’aide des paramètres d’amplification suivants. Pour générer l’ADNc du premier brin à partir de l’ARN, ajoutez les réactifs de réaction dans un tube PCR de 0,2 millilitre conformément au protocole texte. Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.Placez ensuite les échantillons sur de la glace pendant au moins une minute avant de les incuber à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajoutez les réactifs dans le tableau indiqué ici à partir du protocole textuel et incubez à 55 degrés Celsius pendant 50 minutes. Ensuite, inactivez la réaction à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après avoir généré des étalons d’ADN et d’ARN pour la qPCR selon le protocole de texte, décongelez les échantillons d’ADN environnemental et d’ADNc, les étalons et les réactifs de qPCR sur de la glace. Diluez les étalons d’acide nucléique et préparez une dilution sur 10 de l’ADN environnemental et de l’ADNc, de l’état pur à 10 à moins trois. Faites un master mix pour le nombre total de réactions plus 10 % et mélangez bien.Ajoutez 19 microlitres de mélange principal et un microlitre de matrice en trois exemplaires à chaque puits dans une plaque qPCR optique de 96 puits. Utilisez un couvercle optique qPCR pour couvrir la plaque. Ensuite, centrifugez brièvement la plaque et chargez-la dans le bloc chauffant de la machine qPCR.Ensuite, ouvrez le logiciel de gestion qPCR, puis cliquez sur l’onglet Protocole, cliquez sur Créer et ajoutez les conditions d’amplification suivantes. Réglez le volume d’échantillon sur 20 microlitres, cliquez sur OK et enregistrez le protocole. Choisissez maintenant l’onglet Plaque.Ensuite, sous Modifier la sélection, cliquez sur Sélectionner un fluorophore. Ajoutez le colorant rapporteur pour la sonde appropriée et cliquez sur OK. Mettez en surbrillance les puits contenant les normes, puis dans le menu Type d’échantillon, sélectionnez Standard. Choisissez Répliquer la série pour définir la taille de la réplication sur trois, puis cliquez sur Appliquer.Choisissez Série de dilution pour ajouter la concentration de départ calculée pour la concentration standard. Indiquez le facteur de dilution de 10, sélectionnez Décroissant ou Croissant selon l’ordre dans lequel la courbe standard a été ajoutée à la plaque, puis cliquez sur Appliquer. Mettez en surbrillance les positions de puits contenant les échantillons inconnus et sélectionnez Inconnu dans le menu déroulant Type d’échantillon.Choisissez Répliquer la série et définissez Taille de réplication sur trois, puis cliquez sur Appliquer. Sous Nom de l’échantillon, modifiez les noms des échantillons et répétez la procédure pour les puits sans gabarit. Ensuite, dans la boîte de l’éditeur de plaques, cliquez sur OK et enregistrez le fichier.Cliquez ensuite sur Démarrer l’exécution. Une fois l’exécution terminée, choisissez l’onglet Quantification pour afficher la courbe standard, les descripteurs de courbe standard et les graphiques d’amplification. Enfin, choisissez l’onglet Données de quantification pour les valeurs Cp et la quantité de départ correspondante pour les gènes d’échantillons inconnus.Déterminer le nombre de copies de gènes par gramme de sédiment de poids humide selon le protocole de texte. Comme le montre cette image en gel, une extraction réussie d’acide nucléique produit des bandes d’ADN et d’ARN claires où des bandes d’ARN ribosomique 23S et 16S sont visibles en plus de la présence d’une bande d’ADN génomique de haut poids moléculaire. Cette figure montre que lorsqu’une plage de dilution décuplée est correctement préparée et amplifiée pour générer une courbe standard à utiliser pour la réaction qPCR, une différence de cycle de 3,3 entre chaque dilution standard est observée.Il est important de signaler le point de croisement, ou les valeurs Cp, à partir du contrôle no template, ou NTC, le cas échéant. Si cela se produit, un seuil de Cp pour les échantillons standard et inconnus de 3,3 cycles ou un pli logarithmique supérieur à la valeur Cp du NTC est imposé comme décrit précédemment. Ici, une amplification de l’échantillon environnemental de 10 à moins un, de 10 à moins deux et de 10 à moins trois dilutions a été effectuée.L’échantillon pur n’a pas amplifié et les valeurs de Cp de 10 puissance moins un à 10 puissance moins trois dilutions étaient respectivement de 24,12, 26,02 et 28,40. Comme le montre ce graphique, des descripteurs de courbe standard, y compris les valeurs R carré de 0,99 et les efficacités de la PCR dans la plage de 90 à 110 %, sont souhaités. Dans cette expérience, le Cp NTC était de 30,5 et un seuil de Cp négatif de 27,2 a été imposé.La conversion de l’abondance des gènes en pourcentage par gramme de sédiment de poids humide a donné des dilutions de 2,5 fois 10 puissance septième et de 7,1 fois 10 puissance sept pour les dilutions de 10 puissance moins un et de 10 puissance moins deux, respectivement. La dilution de 10 à moins trois Cp était supérieure au seuil NTC. Dans ce cas, le 10 puissance moins deux a été sélectionné comme dilution optimale de la matrice.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ARN peut être rapidement dégradé, il est donc important de conserver l’échantillon sur de la glace et d’utiliser des gants pour éviter la contamination par la RNase tout le temps. N’oubliez pas que nous travaillons avec du phénol : chloroforme et de l’alcool isamylique, ce qui peut être extrêmement dangereux. Et des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire, de gants et de lunettes de protection et le travail sous une cagoule chimique doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire l’ADN et l’ARN et de quantifier l’abondance des gènes et des transcrits dans les sédiments côtiers marins. N’oubliez pas que cette procédure peut être facilement utilisée pour extraire de l’ADN et de l’ARN et pour quantifier une gamme de cibles génétiques à partir de la plupart des échantillons environnementaux, y compris le sol.

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