Numérisation rapide résonance paramagnétique électronique ouvre de nouvelles voies pour l'imagerie physiologiquement Paramètres importants In Vivo

L’objectif général de l’imagerie paramagnétique électronique à balayage rapide, ou RSEPRI, est de fournir des informations quantitatives sur la concentration d’oxygène, le pH, l’état redox et la concentration des molécules de signalisation qui sont utiles pour la recherche biomédicale. L’EPRI est un outil qui peut être utilisé pour répondre à des questions clés dans la recherche sur le cancer concernant l’environnement tumoral. Le principal avantage de l’imagerie EPR à balayage rapide est que vous pouvez acquérir plus d’informations dans un temps beaucoup plus rapide, avec une plus grande variété de molécules de sonde par rapport à l’imagerie EPR à ondes continues ou CW

Les molécules sensibles à l’état redox ou au pH sont un bon exemple de l’endroit où l’EPRI à balayage rapide brille vraiment. Commencer cette procédure par le calcul des conditions expérimentales à balayage rapide telles que déterminées dans le protocole texte. Un élément important du balayage rapide consiste à comprendre la dépendance du signal à l’égard de la largeur de bande du résonateur et des conditions expérimentales telles que la largeur de balayage de la fréquence de balayage.

Pour vraiment optimiser l’expérience, vous devez comprendre les trois. Le pilote de bobine à balayage rapide dispose de deux amplificateurs. Lors de la sélection d’un condensateur, le boîtier du condensateur doit être équilibré avec une capacité égale de chaque côté du boîtier.

Les deux faces sont en série. Dévissez le capot supérieur du boîtier du condensateur et insérez des condensateurs des deux côtés qui sont égaux à la valeur déterminée. Replacez le haut du boîtier du condensateur et vissez-le pour vous assurer qu’il reste en place.

À l’aide du panneau avant du haut-parleur à bobine résonnante, ajustez la fréquence de sortie jusqu’à ce que la forme d’onde sinusoïdale ait l’amplitude maximale. Pour préparer les radicaux, sortez le N-15 PDT du congélateur et laissez le récipient revenir à température ambiante. Pesez 1,4 milligramme de N-15 PDT à l’aide d’une balance analytique.

Ajoutez 1,4 milligramme de N-15 PDT à 15 millilitres d’eau déminéralisée pour une concentration finale de 0,5 millimolaire. Ensuite, combinez 50 milligrammes de BMPO avec cinq millilitres d’eau dans un tube d’irradiation à quartz de 16 millimètres. Ajouter 100 microlitres de peroxyde d’hydrogène de 300 millimolaires.

Irradiez le mélange dans le tube d’irradiation en quartz de 16 millimètres avec une lampe ultraviolette à pression moyenne de 450 watts pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette de transfert en verre, transférez deux virgule cinq millilitres de la solution irradiée de BMPO-OH hors du tube d’irradiation au quartz et sur un côté d’un tube d’échantillon en quartz de 16 millimètres avec un séparateur de trois millimètres. Transférez les deux virgule cinq millilitres restants de BMPO-OH irradié de l’autre côté du tube d’échantillon en quartz avec le diviseur.

Une deuxième étape critique consiste à comprendre la courbe de saturation de puissance. À mesure que la vitesse de balayage augmente, vous accédez à des puissances plus élevées et à des amplitudes de signal plus importantes avant que votre signal ne sature. Des amplitudes de signal plus importantes sont un autre moyen de réduire votre temps d’acquisition.

Tout d’abord, réglez le résonateur avec un échantillon aqueux du radical nitroxide en insérant l’échantillon de 15 millilitres de N-15 PDT de 0,5 millimolaire dans de l’eau dans un tube à résonance paramagnétique d’électrons de quartz de 16 millimètres. Insérez le tube de quartz dans le côté détection du résonateur à résonance paramagnétique électronique à balayage rapide à boucle croisée ou RSEPR. Modifiez la fréquence de la source de l’instrument jusqu’à ce qu’elle corresponde à la fréquence du côté de détection qui contient l’échantillon.

Maintenant, modifiez la fréquence du côté excitation pour qu’elle corresponde aux fréquences de la source de l’expérience et du côté détection du résonateur. Modifiez la fréquence du côté excitation en tournant un condensateur variable dans la cavité du résonateur. Pour configurer la console de l’instrument et l’aimant principal, allumez le spectromètre et choisissez une expérience qui enregistre les données transitoires avec le temps sur l’abscisse.

Effectuez une courbe de saturation de puissance sur un échantillon standard de radicaux nitroxyde dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui seront utilisées pour examiner les radicaux sensibles au pH ou à l’état redox. Une fois le système mis en place, les gradients sont appliqués manuellement ou par le biais d’un programme informatique pour l’expérience d’imagerie. L’intensité du signal EPR est directement proportionnelle au champ micro-ondes dans le résonateur qui fait passer le spin d’un niveau d’énergie à l’autre.

Ce champ de micro-ondes est nommé B1. B1 est proportionnel à la racine carrée de la puissance des micro-ondes. Lorsque la puissance des micro-ondes est quadruplée, B1 est doublée. Dans ce chiffre, la puissance est quadruplée, passant de huit à 32 milliwatts, et B1 est doublée, passant de 18 à 36 milliGauss.

Une courbe de saturation de puissance peut être construite en traçant l’amplitude relative en fonction de la racine carrée de la puissance des micro-ondes, ou si l’efficacité du résonateur est connue, B1. La région de cette courbe qui est linéaire montre la région de puissance où le signal EPR n’est pas saturé ou déformé. L’un des avantages d’une expérience à balayage rapide est que la plage de puissance linéaire est étendue, représentée par les points colorés, par rapport à l’expérience CW normale représentée par les points noirs. Voici une image spatiale spectrale bidimensionnelle de fantômes constituée d’un adduit BMPO-OH séparé de trois millimètres à une concentration de cinq micromolaires.

Une coupe de l’image montre la forme spectrale à 250 mégahertz. Cette image montre le radical nitranyle N-14 qui peut être utilisé pour piéger l’oxyde nitrique in vivo dans un fantôme, où une paroi d’un point cinq millimètres d’épaisseur sépare deux chambres d’échantillon. La forme spectrale à 250 mégahertz est illustrée ici.

L’image bidimensionnelle des radicaux triarylméthyles sensibles au pH reflète la différence des caractéristiques spectrales lorsque le pH du tampon phosphate est égal à sept virgule zéro, ou que le pH est égal à sept virgule quatre. Cette image montre du dinitroxide N-15 dans un fantôme à deux compartiments avec une entretoise de 10 millimètres. Initialement, les deux compartiments contiennent une sonde de 0,5 millimolaire.

L’ajout de glutathion au dinitroxide brise la région de liaison réduite et produit deux mononitroxides, un changement qui se reflète dans l’image bidimensionnelle. Le développement de l’EPR à balayage rapide est un changement de paradigme total dans notre capacité à étudier des molécules avec des électrons non appariés. Vous avez vu aujourd’hui son application à la REP in vivo, mais elle offre également de merveilleuses possibilités pour l’étude à basse température de composés contenant des métaux, et de nombreux autres types de systèmes.

Pour tous les échantillons que nous avons étudiés jusqu’à présent, nous avons obtenu des améliorations du rapport signal/bruit d’au moins un ordre de grandeur et parfois même plus.