Numérisation rapide résonance paramagnétique électronique ouvre de nouvelles voies pour l'imagerie physiologiquement Paramètres importants

L'objectif général de l'imagerie paramagnétique électronique à balayage rapide, ou RSEPRI, est de fournir des informations quantitatives sur la concentration en oxygène, le pH, l'état redox et la concentration des molécules de signalisation utiles à la recherche biomédicale. L'IRPE est un outil qui peut être utilisé pour répondre à des questions clés en recherche sur le cancer concernant l'environnement tumoral. Le principal avantage de l'imagerie RPE à balayage rapide est que l'on peut obtenir davantage d'informations en un temps beaucoup plus court, avec une plus grande variété de molécules indicatrices, par comparaison avec l'imagerie RPE en onde continue ou RPE-OC.

Les molécules sensibles au statut redox ou au pH constituent un excellent exemple illustrant tout l'intérêt de la REPI à balayage rapide. Commencez cette procédure par le calcul des conditions expérimentales de balayage rapide, telles que précisées dans le protocole écrit. Un point essentiel du balayage rapide consiste à comprendre la dépendance du signal à la bande passante du résonateur et aux conditions expérimentales, telles que l'amplitude du balayage en fréquence.

Pour optimiser réellement l'expérience, vous devez comprendre ces trois éléments. Le pilote de bobine à balayage rapide comporte deux amplificateurs. Lors du choix d'un condensateur, la boîte de condensateurs doit être équilibrée avec une capacitance identique de chaque côté de la boîte.

Les deux côtés sont en série. Dévissez le couvercle supérieur de la boîte à condensateurs et insérez des condensateurs des deux côtés, égaux à la valeur déterminée. Remettez le couvercle de la boîte à condensateurs en place et revissez-le pour vous assurer qu'il reste fixé.

À l’aide du panneau avant du pilote de la bobine résonante, ajustez la fréquence de sortie jusqu’à ce que l’onde sinusoïdale atteigne l’amplitude maximale. Pour préparer les radicaux, retirez le PDT marqué à l’azote-15 du congélateur et laissez le récipient atteindre la température ambiante. Pesez 1,4 milligramme de PDT marqué à l’azote-15 à l’aide d’une balance analytique.

Ajouter 1,4 milligramme de PDT N-15 à 15 millilitres d'eau déionisée pour obtenir une concentration finale de 0,5 millimolaire. Ensuite, mélanger 50 milligrammes de BMPO avec cinq millilitres d'eau dans un tube d'irradiation en quartz de 16 millimètres. Ajouter 100 microlitres de peroxyde d'hydrogène à 300 millimolaire.

Irradiez le mélange dans le tube d'irradiation en quartz de 16 millimètres à l'aide d'une lampe ultraviolette de 450 watts à pression moyenne pendant cinq minutes. À l'aide d'une pipette Pasteur en verre, transférez 2,5 millilitres de la solution BMPO-OH irradiée du tube d'irradiation en quartz vers un côté d'un tube d'échantillonnage en quartz de 16 millimètres comportant un diviseur de 3 millimètres. Transférez les 2,5 millilitres restants de la solution BMPO-OH irradiée dans l'autre côté du tube d'échantillonnage en quartz avec le diviseur.

Une deuxième étape cruciale consiste à comprendre la courbe de saturation de puissance. Lorsque la vitesse de balayage augmente, vous accédez à des puissances plus élevées et à des amplitudes de signal plus importantes avant que votre signal ne sature. Des amplitudes de signal plus importantes constituent un autre moyen de réduire votre temps d'acquisition.

Tout d'abord, régler le résonateur à l’aide d’un échantillon aqueux du radical nitroxyle en insérant l’échantillon de 15 millilitres à 0,5 millimolaire de PDT N-15 dans l’eau dans un tube en quartz de 16 millimètres destiné à la résonance paramagnétique électronique. Insérer le tube en quartz dans le côté détection du résonateur à balayage rapide en croix, ou RPEBR. Modifier la fréquence de la source de l’appareil jusqu’à ce qu’elle corresponde à celle du côté détection contenant l’échantillon.

Maintenant, modifiez la fréquence du côté d'excitation afin de l'ajuster aux fréquences de la source expérimentale et du côté de détection du résonateur. Changez la fréquence du côté d'excitation en tournant un condensateur variable situé à l'intérieur de la cavité du résonateur. Pour configurer la console de l'instrument et l'aimant principal, allumez le spectromètre et sélectionnez une expérience qui enregistre des données transitoires avec le temps en abscisse.

Réalisez une courbe de saturation de puissance sur un échantillon standard de radical nitroxyde dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui seront utilisées pour étudier les radicaux sensibles au pH ou à l'état redox. Une fois le système configuré, les gradients sont appliqués manuellement ou à l’aide d’un programme informatique pour l’expérience d’imagerie. L’intensité du signal de RPE est directement proportionnelle au champ micro-onde dans le résonateur, qui provoque le passage du spin d’un niveau d’énergie à l’autre.

On appelle champ micro-ondes B1 ce champ. Le champ B1 est proportionnel à la racine carrée de la puissance micro-ondes. Lorsque la puissance micro-ondes est multipliée par quatre, B1 est doublé. Sur ce graphique, la puissance est multipliée par quatre, passant de huit à 32 milliwatts, et B1 est doublé, passant de 18 à 36 milligauss.

On peut construire une courbe de saturation en puissance en traçant l'amplitude relative en fonction de la racine carrée de la puissance micro-onde, ou, si l'efficacité du résonateur est connue, en fonction de B1. La région linéaire de cette courbe indique la plage de puissance dans laquelle le signal de RPE n'est ni saturé ni déformé. L'un des avantages d'une expérience de balayage rapide est que la plage de puissance linéaire est étendue, comme le montrent les points colorés, par rapport à l'expérience CW classique représentée par les points noirs. On voit ici une image spectrale spatiale bidimensionnelle de fantômes composés d'un adduit BMPO-OH séparés par trois millimètres à une concentration de cinq micromolaires.

Une coupe de l'image montre la forme spectrale à 250 mégahertz. Cette image montre le radical nitranyl N-14 qui peut être utilisé pour piéger l'oxyde nitrique in vivo dans un fantôme, où une paroi d'un millimètre et demi sépare deux chambres d'échantillons. La forme spectrale à 250 mégahertz est présentée ici.

L'image bidimensionnelle des radicaux triarylméthyles sensibles au pH reflète la différence dans les caractéristiques spectrales lorsque le tampon phosphate a un pH de sept virgule zéro, ou lorsque le pH est égal à sept virgule quatre. Cette image montre une dinitroxyde N-15 dans un fantôme à deux compartiments avec un entretoise de 10 millimètres. Initialement, les deux compartiments contiennent une sonde à 0,5 millimolaire.

L'ajout de glutathion au dinitroxyde rompt la région du linker réduite et produit deux mononitroxides, un changement qui se reflète dans l'image bidimensionnelle. Le développement de la RPE à balayage rapide constitue un changement de paradigme total dans notre capacité à étudier des molécules possédant des électrons non appariés. Vous avez vu aujourd'hui son application à la RPE in vivo, mais elle offre également d'excellentes possibilités pour l'étude à basse température de composés contenant des métaux, ainsi que pour de nombreux autres types de systèmes.

Pour tous les échantillons que nous avons étudiés jusqu'à présent, nous avons obtenu des améliorations du rapport signal sur bruit d'au moins un ordre de grandeur, et parfois même plus.