Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

L’objectif global de cette procédure est de présenter une technologie pour surveiller le processus d’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la visualisation du comportement et de la fonction d’amorçage des neutrophiles dans des modèles animaux de maladies et de troubles les plus rares. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine trois méthodologies établies, notamment les rapporteurs fluorescents dans le marquage viral et l’imagerie intravitale.

Élevez des souris hétérozygotes pIL1-DsRed avec des souris C57Black de type sauvage. À trois ou quatre semaines, phénotypez leurs petits. Pour chaque chiot, préparez un tube de 1,5 millilitre avec 20 microlitres d’héparine.

Pour recueillir du sang, tenez un chiot par la peau de son cou et percez la veine sous-mandibulaire de la poche de la joue à l’aide d’une lancette de 5 millimètres. Seule une petite ponction est nécessaire. Prélevez trois à cinq gouttes de sang par tube.

Après avoir effectué la collecte, assurez-vous d’arrêter l’hémorragie et d’observer les animaux pendant 30 minutes avant de les ramener à l’animalerie. Dans chaque tube d’échantillon, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse des globules rouges. Ensuite, faites tourbillonner les tubes et incubez-les pendant cinq à 10 minutes sur de la glace.

Après l’incubation, ajoutez lentement 400 à 500 microlitres de sérum fœtal bovin sous les suspensions cellulaires de chaque tube. Une interface claire doit se former entre les couches. Ensuite, centrifugez les échantillons à 1 500 G pendant cinq minutes pour recueillir les pastilles de cellules.

Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de milieu RPMI-1640 complet. Ensuite, transférez chaque suspension dans un tube de cytométrie en flux et ajoutez 20 microlitres de solution de travail LPS fraîchement préparée dans chaque tube. Incuber les échantillons pendant quatre heures avant d’effectuer la cytométrie en flux.

Pour commencer, anesthésie la souris avec une injection intrapartonéale d’un cocktail anesthésique et confirmez la sédation adéquate avec un test de pincement des orteils. Ensuite, appliquez de la crème dépilatoire sur la surface dorsale des deux oreilles, essuyez-la dans la minute qui suit et lavez la peau à l’eau. Mesurez l’épaisseur de l’oreille où les applications ont été faites à l’aide d’un micromètre.

Plus tard, remettez la souris dans sa propre cage une fois qu’elle s’est remise de l’anesthésie et laissez-la se reposer pendant au moins trois jours avant de procéder à d’autres tests. Après trois jours, réanesthésez la souris et mesurez à nouveau l’épaisseur de l’oreille pour vous assurer qu’elle n’est pas irritée. Ensuite, appliquez 12,5 microlitres d’oxazolone à 1,25 % de chaque côté de l’oreille droite et appliquez 12,5 microlitres de la solution d’huile d’olive acétone de chaque côté de l’oreille gauche.

Comme toujours, observez la souris se remettre de l’anesthésie. 24 heures plus tard, mesurez à nouveau l’épaisseur de l’oreille sous anesthésie pour vous assurer que l’inflammation cutanée induite par l’oxazolone s’est produite. Pour commencer, transférez 100 microlitres d’anticorps monocolonal anti-lyse XG dans une seringue à insuline U100 avec une aiguille de calibre 28.

Ensuite, anesthésie une souris traitée comme décrit précédemment. Avec l’abdomen de la souris vers le bas, appliquez une légère pression vers le bas sur la peau dorsale et ventrale d’un œil pour faire saillir partiellement le globe oculaire. Ensuite, placez soigneusement l’aiguille, biseautez vers le bas, à environ 30 degrés par rapport au canthus médial et insérez soigneusement l’aiguille dans le sinus rétro-orbitaire.

La pression de pénétration sera soulagée lorsque l’aiguille pénètre dans le sinus. Ensuite, éjectez le contenu et retirez l’aiguille rapidement. Une petite quantité de saignement suggère que l’injection a réussi.

Maintenant, appliquez immédiatement 1,25 % d’oxazolone et la solution de véhicule sur les oreilles droite et gauche de la souris comme précédemment. Huit heures plus tard, administrez une deuxième dose du même anticorps à chaque souris. De plus, pour visualiser les vaisseaux sanguins, administrez rétro-orbitalement 100 microlitres de fitc dextran.

Pour cette procédure, anesthésie d’abord la souris comme précédemment. Ensuite, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’imagerie. Ensuite, placez une lamelle en verre au centre d’une platine d’imagerie et fixez les bords de la lamelle avec du ruban adhésif.

Ajoutez également une goutte de PVS à la lamelle. Maintenant, placez l’oreille de la souris sur la lamelle, côté dorsal vers le bas. Ensuite, humidifiez la surface ventrale de l’oreille de la souris avec une goutte de PVS.

Ensuite, montez le bout de l’oreille avec une lame en verre sur le dessus et fixez la lame avec du ruban adhésif. Maintenant, allumez un microscope confocal à fluorescence multi-laser et l’équipement associé. Éteignez les lumières de la pièce pour minimiser l’exposition à la lumière ambiante.

Ensuite, enregistrez des images tridimensionnelles à l’aide du microscope confocal. Pour les expériences d’imagerie en accéléré, enregistrez des images tridimensionnelles toutes les deux à quatre minutes pendant un maximum de huit heures. Pendant ce temps, surveillez les moustaches qui se contractent, ce qui indique que la souris commence à se remettre de l’anesthésie.

Dans de telles situations, administrez cinq à 10 microlitres d’une demi-dose de cocktail anesthésique à l’aide d’une aiguille papillon. Les souris pIL-1-DsRed ont été dépistées pour la fluorescence phénotypique DsRed produite dans les leucocytes du sang périphérique par cytométrie en flux. Les cellules myéloïdes circulantes de souris de type sauvage expriment de manière minimale DsRed, tandis que les mêmes cellules de souris pIL1-DsRed expriment des signaux DsRed distincts.

L’activation du promoteur bêta de l’IL-1 est un marqueur de l’amorçage des neutrophiles et peut être mieux visualisée chez les souris vivantes pIL-1DsRed. Ensuite, un sensibilisant cutané, l’oxazolone, a été appliqué localement sur l’oreille droite. Plus tard, les neutrophiles ont été marqués avant et après une deuxième application du sensibilisant oxazolone par injection rétro-orbitaire.

De même, le fitc dextran a été injecté pour localiser les vaisseaux sanguins. De nombreuses cellules à double marquage ont été trouvées dans l’espace extravasculaire, qui représentent des neutrophiles amorcés. Un petit nombre de cellules n’ont été marquées que par l’anticorps lyse XG, qui étaient probablement des neutrophiles au repos.

De plus, une petite population de cellules DsRed positives a été observée, qui peut comprendre des monocytes inflammatoires et des macrophages activés. Les voies migratoires cellulaires ont été suivies pour comparer les deux populations de neutrophiles. Les deux populations de neutrophiles ont montré une migration aléatoire une fois que l’espace extracellulaire a été pénétré.

Il est intéressant de noter que les neutrophiles supposément amorcés présentaient une vitesse significativement plus élevée que leurs homologues présumés au repos. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie. Deux explorent le comportement et la fonction de nombreuses cellules immunitaires dans divers états inflammatoires impliquant différents lymphocytes T.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller le processus dynamique de l’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants.