Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

L’objectif global de cette expérience est de générer des cellules souches pluripotentes induites, ou IPC, à partir de synoviocytes de type fibroblaste isolés du tissu synovial d’une articulation enflammée par la polyarthrite rhumatoïde. Actuellement, les iPSC peuvent être générées à partir de diverses cellules primaires humaines. Nous avons réussi à générer des iPSC à partir de synoviocytes de type fibroblaste humain, qui sont les cellules pathologiques clés des articulations rhumatoïdes.

Cela peut aider à étudier la pathologie de la polyarthrite rhumatoïde. Ce périodique peut aider à répondre à des questions clés sur la dégénérescence des IPSC, à l’aide des RA-FLS. Commencez par placer le tissu synovial dans un plat de 100 millimètres et lavez le tissu avec 5 millilitres de PBS complété par des antibiotiques.

Retirez le tissu adipeux jaunâtre et les résidus osseux. Transférez ensuite le tissu coupé dans un puits d’une plaque à six puits contenant 5 millilitres de DMEM complété par du FBS et utilisez des ciseaux pour hacher le tissu jusqu’à ce que les morceaux soient assez petits pour pénétrer une pointe de pipette jetable. Transférez le milieu dans un tube conique de 50 millilitres, puis ajoutez 5 millilitres de DMEM frais plus FBS dans le puits pour recueillir tout tissu restant et transférer tout le contenu du puits dans le tube.

Ensuite, ajoutez de la collagénase décongelée à une concentration finale de 0,01 % dans le tube et scellez le tube avec du parafilm pour l’incubation dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en agitant. Après quatre heures, remplissez le tube avec du DMEM frais plus FBS jusqu’à un volume final de 50 millilitres et collectez les fragments de tissu par centrifugation. Retirez le surnageant sans déranger la pastille puis remettez les cellules en suspension dans 40 millilitres de milieu frais pour une autre centrifugation.

Remettez en suspension la deuxième pastille dans 25 millilitres de DMEM frais plus FBS et laissez les gros amas de tissu se déposer. Transférez ensuite le surnageant dans une nouvelle boîte de 100 millimètres et incubez les synoviocytes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 14 jours. Pour élargir la culture de synoviocytes, jetez le milieu utilisé et lavez les cellules dans 5 millilitres de PBS.

Retirez le PBS et dissociez les cellules avec 1 millilitre d’EDTA dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 2 minutes. À la fin de l’incubation, tapotez doucement la parabole pour détacher les cellules adhérentes restantes et transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Remettez le granulé en suspension dans 30 millilitres de DMEM et de FBS et divisez les cellules en 3 nouvelles boîtes de 100 millimètres.

Nourrissez les synoviocytes avec un milieu frais tous les 3 jours, en divisant les cellules en 3 nouvelles cultures à 80 % de confluence comme cela vient d’être démontré. Le jour zéro de la transduction, voir 3 x 10 puissance 4 FLS par puits sur une plaque de 6 puits dans un milieu de croissance frais pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2. Le lendemain, décongeler 1 fiole de Lenti-virus contenant 4 facteurs Yamanaka à 4 degrés Celsius et remplacer le milieu de culture FLS par un milieu de culture FLS complété par du bromure d’hexadiméthrine et de l’acide ascorbique.

Lorsque le contenu du flacon a décongelé, ajoutez 30 microlitres de lenti-virus aux cellules et mélangez doucement pour répartir uniformément le virus. Pour améliorer l’infection, centrifugez la plaque et retournez les cellules dans l’incubateur en remplaçant le milieu chaque jour par un milieu de croissance FLS frais contenant du butyrate de sodium et de l’acide ascorbique pendant 3 jours. Le 4ème jour, remplacez le milieu par un mélange de milieu de croissance FLS et de milieu iPSC contenant du butyrate de sodium et de l’acide ascorbique.

Le jour 5, ajoutez 60 microlitres de vitronectine à 6 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium et enduisez 3 puits d’une plaque à 6 puits avec 2 millilitres de solution chacun pendant au moins une heure à température ambiante. Pendant que la vitronectine durcit, lavez les cellules transduites avec du PBS et détachez-les avec de l’EDTA comme démontré. Après avoir recueilli les cellules dissociées par centrifuation, remettre la pastille en suspension dans 900 microlitres de milieu frais.

Retirez l’excès de vitronectine des puits et ajoutez 300, 150 et 100 microlitres de cellules dans des puits individuels. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur, en remplaçant le milieu quotidiennement par un milieu iPSC frais jusqu’à l’apparition de colonies. Pour cueillir les colonies, ajoutez d’abord 500 microlitres de milieu iPCS, complété par un inhibiteur de ROCK à chaque puits d’une plaque à 48 puits recouverte de vitronectine.

Ensuite, placez les cultures FLS sous un microscope de dissection sur un banc propre et utilisez une pointe de pipette de 10 microlitres pour couper autour d’une colonie d’intérêt. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, transférez la colonie cueillie dans 1 puits de la plaque de 48 puits. Lorsque toutes les colonies ont été cueillies, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les colonies soient assez grandes pour le transfert.

Diviser les cellules lorsque les colonies sont hors du champ visible du microscope, vu à un grossissement de 100X. Sur cette image, on peut observer la morphologie du FLS isolé après une culture initiale de 14 jours. Les cellules présentent les caractéristiques des fibroblastes en général avec une expression similaire des marqueurs fibrotiques vimentine et fibronectine ainsi qu’une faible expression du marqueur synoviocytaire de type macrophage CD-68.8 à 11 jours après la transduction lenti-virale du facteur Yamanaka, de petites colonies commencent à apparaître qui peuvent être cueillies et amplifiées pour 5 à 10 passages.

Ces iPSC de polyarthrite rhumatoïde expriment la phosphatase alcaline, indiquant qu’elles restent indifférenciées. Les cellules expriment également des marqueurs pluripotents confirmés par RT-PCR et analyse d’immunofluorescence. Les iPCS de la polyarthrite rhumatoïde présentent un schéma chromosomique normal de 44+XY, déterminé par caryotype.

De plus, 12 semaines après leur injection chez des souris SCID, les iPSC de polyarthrite rhumatoïde ont formé des tératomes, qui présentent divers phénotypes tissulaires. La différenciation de leur couche germinale est confirmée par coloration immunofluorescente. Une fois maîtrisés, les iPSC peuvent être générés à partir de FLS avec du synovium.

Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon d’isoler du tissu synovial et comment induire une reprogrammation à leur utilisation. Ces iPSC dérivées de RAF-FLS peuvent être utiles pour étudier la régénération ou le dépistage de médicaments en rhumatologie. Une fois que ces iPSC sont établies, divers types de cellules ou d’organes cibles peuvent être générés.

Ce qui peut être utile pour l’étude de la maladie ou d’autres applications futures, telles que l’édition de gènes, etc.