Name: Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes synovioïdes de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Cette méthode utilise un système lentiviral sans cellules nourricières pour étudier la pathologie de la maladie.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche financé par les Centres coréens de contrôle et de prévention des maladies (HI13D2188).

Déclaration éthique: Ce protocole d&#39;étude a été approuvé par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université catholique de Corée (KC12TISI0861). 1. synoviocytes Isolement et expansion <ol><li> synoviocytes Isolation <ol><li> Stériliser deux paires de ciseaux chirurgicaux et une paire de pinces. </li><li> Transférer le tissu synovial à 100 mm plat et on lave avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Coupez les résidus jaunâtres de tissu adipeux et des os. Transférer le tissu coupé à un puits d&#39;une plaque à 6 puits et on ajoute 5 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS). </li><li> Hacher les tissus avec des ciseaux jusqu&#39;à ce que les pièces sont suffisamment petites pour pénétrer dans une pipette jetable. </li><li> Transférer le support du tissu contenant un tube conique de 50 ml. Récolter la matière restante en ajoutant 5 ml de DMEM avec 20% de FBS à la plaque de 6 puits, puis les transférer dans le tube. &lt;/ Li&gt; <li> collagénase Thaw sur la glace. Ajouter la collagénase à une concentration finale de 0,01% et sceller le tube avec du parafilm. Incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C sous agitation pendant 4 heures. </li><li> Après incubation, remplir le tube avec du DMEM avec 20% de FBS jusqu&#39;à ce que le volume total soit de 50 ml et centrifuger à 300 x g, RT pendant 10 min. </li><li> Retirer le surnageant sans perturber le culot et ajouter 40 ml de médias pour remettre le culot. </li><li> Répétez les étapes 1.1.10-1.1.11. </li><li> Reprendre le culot dans 25 ml de DMEM avec 20% de FBS et d&#39;attendre les grosses touffes de tissu à couler au fond. </li><li> Transférer le surnageant dans une boîte de 100 mm et incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 14 jours. </li></ol></li><li> Synoviocytes Maintenance et extension <ol><li> Jeter les médias utilisés à partir de la plaque et laver les cellules avec 5 ml de PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS / EDTA 1 mM et on incube à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 2 min. </li><li> Appuyez sur le plat en douceur et transfer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 x g, température ambiante pendant 2 min. </li><li> Retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 30 ml de DMEM avec 20% de FBS. </li><li> Transférer les cellules à 3 x 100 mm plats, sans laisser de matériau restant visible. </li><li> Remplacez le support avec un milieu frais tous les 3 d. Fractionner les cellules à 80% de confluence en utilisant 1 ml de PBS / EDTA 1 mM. Maintenir jusqu&#39;au passage 3 avant utilisation. Divisez chaque plat de cellules en 3 plats dans chaque division. NOTE: Après avoir atteint le passage 3, les cellules qui ne vont pas être utilisés immédiatement peuvent être congelés. </li></ol></li></ol> 2. Reprogrammation FLSS Utilisation de lentivirus codant pour les facteurs Yamanaka <ol><li> Transduction (D0) <ol><li> Graines 3 × 10 4 cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits dans un milieu de croissance (500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine). Incuber les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO2. </li><li> Le lendemain, retirer un flacon de lentivirus contenant 4 Yamanaka facteurs: Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc du congélateur et décongeler à 4 ° C. Note: lentivirus a été produit par la procédure décrite dans notre précédente étude 11. </li><li> Bien que la décongélation du virus, changer les médias aux médias de croissance FLS (20% de FBS, plus des antibiotiques dans DMEM) contenant 10 pg / ml de bromure de hexadimethrine et 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique. </li><li> Après avoir changé les médias, ajouter 30 pl de lentivirus aux cellules et mélanger doucement. Pour améliorer l&#39;infection, centrifuger la plaque à 680 xg, 35 ° C pendant 30 min. </li><li> Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2. </li></ol></li><li> Maintenance Jusqu&#39;à Reprogrammation est visible <ol><li> Pour le jour 3, remplacer les médias quotidiens avec les médias de croissance FLS contenant 0,1 mM de butyrate de sodium et 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique. </li><li> Le lendemain, remplacer les médias avec un mélange de milieux de croissance et FLSCOPSi support (1: 1 rapport) contenant 0,1 mM de butyrate de sodium et 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique. Remarque: Les composants des médias iPSC est donnée dans la liste des matériaux / équipement. </li></ol></li><li> Cellules Fractionnement pour la Formation Colony <ol><li> Préparer une plaque à 6 puits vitronectine revêtu. <ol><li> Ajouter 60 ul de vitronectine à 6 ml de PBS sans Ca 2+ et Mg 2+. Mettez 2 ml de mélange dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Remarque: La concentration de travail de la vitronectine est de 5 ug / ml. </li></ol></li><li> Le D5, laver les cellules avec du PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS / 1 mM d&#39; EDTA pour détacher les cellules et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 min. </li><li> Récolter les cellules et centrifuger à 250 x g, température ambiante pendant 2 min. </li><li> Fractionner les cellules à 3 rapports différents (1: 3, 1: 6 et 1: 9) pour obtenir différents confluencies. Ajouter 900 ul de milieu pour le culot cellulaire et remettre en suspension. Ajouter 300, 150, et 100 pl du mélange de cellules par puits d&#39;une 6-Plaque puits pour parvenir à un rapport de 1: 3, 1: 6 et 1: 9, respectivement. </li><li> Remplacer les médias tous les jours avec les médias iPSC jusqu&#39;à ce que les colonies apparaissent. Colonies apparaîtront après environ D18. Remarque: A ce stade, les colonies iPSC coexistent avec le SSLF non reprogrammée. </li></ol></li><li> Colony picking <ol><li> Préparer une plaque de vitronectine revêtue de 48 puits par addition de 500 ul de la vitronectine aux puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. </li><li> Placez le microscope sur un banc propre, et retirer la plaque de 6 puits de l&#39;incubateur. </li><li> Retirer la solution de vitronectine de la plaque de 48 puits et ajouter 500 médias iPSC ul supplémenté avec 10 mM Rho-associé, superhélice contenant de la protéine kinase (ROCK) inhibiteur. </li><li> En utilisant une pointe de pipette 10p, couper autour de la colonie. Transférez la colonie choisi pour un puits de la plaque de 48 puits. </li><li> Après la cueillette de plusieurs colonies, incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Maintenir les cellules jusqu&#39;à ce que les colonies sont grandes enough pour le transfert. Note: Nous avons l&#39;habitude déversé les cellules lorsque la colonie sort du champ visible du microscope, lorsqu&#39;on regarde au grossissement 100X. </li></ol></li></ol> 3. immunofluorescence <ol><li> Préparation cellulaire <ol><li> Placez un 18 mm couvercle en verre stérile dans une plaque de 12 puits. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS pour refroidir et rincer le verre de protection. </li><li> Remplacer par 1 ml d&#39;une / ml de vitronectine solution à 10 pg. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h. </li><li> Jeter la solution de vitronectine et CSPi de plaque dans la plaque de 12 puits vitronectine enduit et de la culture pendant 7 jours à 37 ° C, 5% de CO 2, en changeant les médias tous les jours. </li></ol></li><li> cellule coloration <ol><li> Jeter les milieux de culture et laver les cellules avec du PBS une fois. </li><li> Fixer les cellules dans 0,4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirez le perméabilisationla solution et le bloc avec du PBS contenant 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Diluer les anticorps dans du PBS contenant du BSA à 2% selon le Tableau 1. Incuber les cellules avec les anticorps primaires pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps secondaire (dilution 1: 200) et on incube les cellules pendant 1 heure à température ambiante, en évitant la lumière. </li><li> Traiter les cellules avec 1 pl / ml de DAPI pendant 10 min. </li><li> Placer le couvercle en verre sur le dessus de la lame de verre avec antifade réactif et incuber à température ambiante pendant 24 heures, en évitant la lumière. </li><li> Vérifier l&#39;expression d&#39;un microscope à fluorescence. </li></ol></li></ol> 4. temps réel Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) <ol><li> Extraire l&#39; ARNm à partir du culot cellulaire en utilisant le thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme , la méthode d&#39;extraction 11. </li><li> Amplifier ADNc à partir de 2 pg d&#39;ARNm totaux en utilisant la transcription inverse 11. </li><li> Mélanger les composants nécessaires pour la PCR en utilisant 2 pi d&#39;ADNc de systèmeplaque 11. </li><li> Effectuer RT-PCR et de vérifier les résultats par électrophorèse sur gel 11. </li></ol> 5. phosphatase alcaline (AP) Coloration <ol><li> IPSCs de culture pendant 5-7 jours à 37 ° C, 5% de CO 2 avant la coloration. </li><li> Aspirer les médias et fixer les cellules avec 4% de PFA pendant 1 min. </li><li> Jeter le fixateur et rincer les cellules avec le tampon de rinçage 1X. </li><li> Préparer les réactifs pour AP coloration. Mélanger les réactifs dans le rapport suivant: Fast Red Violet: solution de phosphate de naphtol AS-BI: eau = 2: 1: 1. </li><li> Incuber les cellules avec la solution de coloration à la température ambiante pendant 15 minutes, en évitant la lumière. </li><li> Jeter la solution de coloration et de rinçage des cellules avec un tampon de rinçage. </li><li> Couvrir les cellules avec du PBS pour éviter le dessèchement et vérifier l&#39;expression en utilisant un microscope à champ clair. </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Avant la découverte de CSPi, les scientifiques ont utilisé principalement les CES pour étudier la biologie des cellules souches et d&#39;autres lignées cellulaires grâce à la différenciation. Cependant, les CES proviennent de la masse interne d&#39;un blastocyste, qui est un embryon à un stade précoce. Pour isoler les CES, la destruction du blastocyste est inévitable, ce qui soulève des questions éthiques qui sont impossibles à surmonter. En outre, bien que les CES ont des caractéristiques stemness et pluripotence, ils ...

Les cellules souches pluripotentes sont la plate-forme de nouvelle génération dans divers domaines cliniques et biologiques. Ils sont un outil prometteur qui peut être utilisé dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et le traitement médical régénérateur. Humaines cellules souches embryonnaires (CSEh) ont été principalement utilisés pour étudier et comprendre les cellules pluripotentes. Cependant, isolé par la destruction du blastocyste humain, CSEh sont associés à plusieurs préoccupations éthiques. En 2007, le Dr Shinya Yamanaka et son équipe inversé le processus de programmation de la cellule et développé des cellules souches à partir de cellules somatiques adultes humaines 1,2. Par conséquent, contrairement à CSEh, induits-cellules souches pluripotentes (CISP) peuvent être générées à partir de cellules somatiques matures, en évitant les obstacles éthiques. En règle générale, iPSCs sont générés par la fourniture de quatre gènes exogènes: Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc. Ces facteurs sont à l&#39;origine Yamanaka livrés en utilisant des systèmes lentiviraux et rétroviraux. Les premiers CSPi ont été dérivées de la souris somatique caunes 3. Par la suite, la technique a été appliquée sur des fibroblastes dermiques humains 1,2. Des études ultérieures ont généré avec succès iPSCs provenant de diverses sources, telles que l&#39; urine 4, le sang 5,6 kératinocytes 7 et plusieurs autres types de cellules. Cependant, il y a des cellules somatiques qui ne sont pas utilisés dans la reprogrammation et le dépistage des capacités de reprogrammation de différents types de tissus spécifiques dans l&#39;état de la maladie de cellules, est encore nécessaire. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie qui peut frapper toutes les articulations et entraîner des maladies auto-immunes dans d&#39;autres organes. La polyarthrite rhumatoïde touche environ 1% des adultes dans le monde développé. Il est une maladie assez courante et son incidence augmente chaque année 8. Cependant, RA est difficile d&#39;identifier dans les premiers stades et oncebone destruction se produit il n&#39;y a pas de traitement qui peut récupérer les dommages. De plus, l&#39;efficacité du médicament diffère d&#39;un patient à, et il est difficile de prédire le médecinine qui est nécessaire. Par conséquent, la mise au point d&#39;une méthode de dépistage de drogue est nécessaire, et un matériau cellulaire qui peut refléter les conditions de la polyarthrite rhumatoïde est nécessaire. Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont un participant cellulaire actif dans la pathogenèse de la PR 9,10. FLSS existent dans la paroi de l&#39;intima synoviale entre la capsule et la cavité articulaire, qui est également désigné sous le nom synoviale. En soutenant la structure commune et fournissant des éléments nutritifs au cartilage environnant, FLSS jouent généralement un rôle crucial dans la fonction articulaire et la maintenance. Cependant, FLSS dans la PR ont un phénotype invasif. RA FLSS ont un phénotype de cancer comme, éventuellement détruire l&#39;os environnant par une prolifération infinie 10. Grâce à cette caractéristique unique FLSS peut être utilisé en tant que matériau prometteur qui peut refléter la pathobiologie de la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, ces cellules sont rarement réalisées, ainsi que les phénotypes cellulaires modifient que les cellules passent par plusieurs passages in vitro </em&gt; conditions. Par conséquent, il peut être compliqué à utiliser RA FLSS comme un outil qui peut représenter l&#39;état du patient. Théoriquement, RA CSPi patient dérivé (RA-CSPi) peuvent devenir un outil idéal pour le dépistage de drogues et d&#39;autres recherches. CSPi générées ont l&#39; auto-renouvellement et la capacité peuvent être maintenues et développées in vitro. Avec pluripotence, ces cellules peuvent être différenciées en chondrocytes et ostéocytes lignées matures, qui peuvent contribuer matériel cellulaire pour la recherche spécifique dans la polyarthrite rhumatoïde et d&#39; autres maladies liées à l&#39; os 11. Dans cette étude, nous montrons comment isoler et développer FLSS d&#39;un synoviale enlevé chirurgicalement, et comment générer RA-CSPi de FLSS utilisant des lentivirus contenant des facteurs Yamanaka.

<table><tbody><tr><td>Plat de 100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube cornical</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mlL Tube cornical</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipette jetable 10 ml Falcon</td><td></td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette jetable</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 12 puits</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS Matériaux d’isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicaux</tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicale</tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>iPSC Generation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>Ingrédient du milieu iPSC (500 ml)</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>Ingrédient du milieu iPSC (Conc. : 543 &mu ; g/ml)</td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>Ingrédient du milieu iPSC&nbsp ; (Conc. : 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Ingrédient du milieu humain Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC (Conc. : 10.7 &mu ; g/ml)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC media ingredient&nbsp ; (Conc. : 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Ingrédient du milieu iPSC (Conc. : 20 &mu ; g/ml)</td></tr><tr><td>TGF humain & bêta ; 1</td> Ingrédient du milieu <td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC (Conc. : 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Ingrédient du milieu iPSC&nbsp ; (Conc. : 64 &mu ; g/ml)</td></tr><tr><td>Polybrène</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Butyrate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur</td><td>de ROCK Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><<td></td></tr><tr><td>strong>Guality Control Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Verre de couverture Superior</td><td></td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldyhyde (PFA)</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H+L) Anticorps</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonde moléculaire</td> <td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration Prolong gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Verre lame, revêtu</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand kit de synthèse d’ADNc</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>loading star</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) Marqueur d’échelle d’ADN</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cellules souches induites pluripotentes utilisation synoviocytes fibroblaste isolé joints de la polyarthrite rhumatoïde les patients

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

cellules somatiques matures peuvent être inversées dans un état de cellules souches pluripotentes comme l&#39;aide d&#39;un ensemble défini de facteurs de reprogrammation. De nombreuses études ont généré induites-cellules souches pluripotentes (CISP) à partir de différents types de cellules somatiques par transduction quatre Yamanaka facteurs de transcription: Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc. L&#39;étude des CSPi demeure à la fine pointe de la recherche biologique et clinique. En particulier, CSPi spécifiques au patient peuvent être utilisés comme un outil d&#39;avant-garde pour l&#39;étude de pathobiologie de la maladie, puisque CSPi peuvent être induites à partir du tissu de tout individu. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, classé par la destruction du cartilage et la structure de l&#39;os dans l&#39;articulation. hyperplasie synoviale est une des raisons majeures ou des symptômes qui conduisent à ces résultats dans la polyarthrite rhumatoïde. Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont les principales cellules du composant dans la synoviale hyperplasique. FLSS dans l&#39;articulation prolifèrent indéfiniment, finalement envahir le cartil adjacentl&#39;âge et de l&#39;os. À l&#39;heure actuelle, la synoviale hyperplasique peut être enlevé que par une intervention chirurgicale. La membrane synoviale enlevée est utilisée pour la recherche RA comme un matériau qui reflète l&#39;état inflammatoire de l&#39;articulation. En tant qu&#39;acteur majeur dans la pathogenèse de la PR, FLSS peut être utilisé comme un matériau pour générer et étudier les CSPi de patients atteints de PR. Dans cette étude, nous avons utilisé le FLSS d&#39;un patient atteint de PR pour générer CSPi. En utilisant un système lentiviral, nous avons découvert que FLSS peut générer RA spécifique au patient iPSC. Les CSPi générées par FLSS peuvent encore être utilisés comme un outil pour étudier la physiopathologie de la PR dans le futur.

Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour générer CSPi de FLSS en utilisant un système lentiviral. La figure 1A montre un schéma simple du protocole d&#39;isolement FLS. À la suite de l&#39;ablation chirurgicale de la synovie, le tissu a été haché en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux. Collagénase a été ajouté à isoler les cellules à partir des amas de tissu. Les cellules ont été mises en incubation pendant 14 jours avant le traitement ultérieur. La <...

Nous décrivons ici un protocole destiné à générer des cellules souches pluripotentes humaines induites par les synoviocytes de type fibroblaste provenant de patients, en utilisant un système lentiviral sans cellules nourricières.

Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

L'objectif général de cette expérience est de générer des cellules souches pluripotentes induites, ou CPI, à partir de synoviocytes de type fibroblaste isolés du tissu synovial d'une articulation enflammée atteinte de polyarthrite rhumatoïde. Actuellement, les CPI peuvent être obtenues à partir de diverses cellules primaires humaines. Nous avons réussi à générer des CPI à partir de synoviocytes humains de type fibroblaste, qui sont les cellules pathologiques clés des articulations rhumatoïdes.Cela peut aider à étudier la pathologie de l'arthrite rhumatoïde. Cette méthode périodique peut aider à répondre à des questions clés concernant la dégénérescence des iPSC, en utilisant des RA-FLS. Commencez par placer le tissu synovial dans une boîte de 100 millimètres et lavez le tissu avec 5 millilitres de PBS supplémenté en antibiotiques.Retirez le tissu adipeux jaunâtre et les résidus osseux. Transférez ensuite le tissu découpé dans un puits d'une plaque de six puits contenant 5 millilitres de DMEM enrichi avec du FBS, et utilisez des ciseaux pour hacher finement le tissu jusqu'à ce que les morceaux soient suffisamment petits pour passer à travers l'extrémité d'une pipette jetable. Transférez le milieu dans un tube conique de 50 millilitres, puis ajoutez 5 millilitres de DMEM frais plus du FBS dans le puits afin de récupérer tout tissu restant, et transférez l'intégralité du contenu du puits dans le tube.Ensuite, ajoutez du collagénase décongelé sur de la glace à une concentration finale de 0,01 % dans le tube et scellez le tube avec du parafilm pour une incubation dans un bain-marie à 37 degrés Celsius sous agitation. Après quatre heures, remplissez le tube avec du DMEM frais supplémenté de FBS jusqu'à un volume final de 50 millilitres et récupérez les fragments de tissu par centrifugation. Éliminez le surnageant sans perturber le culot, puis resuspendez les cellules dans 40 millilitres de milieu frais pour une nouvelle centrifugation.Resuspendre le second culot dans 25 millilitres de DMEM frais supplémenté en FBS et laisser les gros agrégats de tissu se déposer. Ensuite, transférer le surnageant dans une nouvelle boîte de 100 millimètres et incuber les synoviocytes à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 14 jours. Pour étendre la culture de synoviocytes, éliminer le milieu utilisé et laver les cellules avec 5 millilitres de PBS.Retirer le PBS et dissocier les cellules avec 1 millilitre d'EDTA dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 2 minutes. À la fin de l'incubation, tapoter doucement la boîte pour détacher les cellules adhérentes restantes et transférer la suspension cellulaire obtenue dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Remettre en suspension le culot dans 30 millilitres de DMEM et de SFB, puis répartir les cellules dans 3 nouvelles boîtes de 100 millimètres.Alimentez les synoviocytes avec du milieu frais tous les 3 jours, en divisant les cellules en 3 nouvelles cultures à une confluence de 80 %, comme vient d'être démontré. Au jour zéro de la transduction, semez 3 x 10⁴ FLS par puits dans une plaque de 6 puits contenant du milieu de croissance frais, pour une incubation nocturne à 37 °C sous 5 % de CO₂. Le jour suivant, décongelez un flacon de lentivirus contenant les 4 facteurs de Yamanaka à 4 °C et remplacez le milieu de culture des FLS par du milieu de croissance des FLS supplémenté en bromure d'hexadiméthrine et en acide ascorbique.Une fois que le contenu du flacon a dégelé, ajouter 30 microlitres de lentivirus aux cellules et mélanger délicatement pour répartir uniformément le virus. Pour améliorer l'infection, centrifuger la plaque puis replacer les cellules dans l'incubateur, en renouvelant le milieu chaque jour par un milieu de croissance FLS frais contenant du butyrate de sodium et de l'acide ascorbique pendant 3 jours. Au 4e jour, remplacer le milieu par un mélange de milieu de croissance FLS et de milieu iPSC contenant du butyrate de sodium et de l'acide ascorbique.Au jour 5, ajouter 60 microlitres de vitronectine à 6 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium, puis recouvrir 3 puits d'une plaque de 6 puits avec 2 millilitres de cette solution chacun, pendant au moins une heure à température ambiante. Pendant que la vitronectine s'immobilise, laver les cellules transduites avec du PBS et les détacher à l'aide d'EDTA comme indiqué. Après avoir récupéré les cellules dissociées par centrifugation, re-suspendre le culot dans 900 microlitres de milieu frais.Retirer l'excès de vitronectine des puits et ajouter 300, 150 et 100 microlitres de cellules dans des puits individuels. Remettre ensuite les cellules dans l'incubateur et remplacer le milieu quotidiennement par du milieu iPSC frais jusqu'à l'apparition de colonies. Pour sélectionner les colonies, ajouter d'abord 500 microlitres de milieu iPSC, complété par un inhibiteur ROCK, dans chaque puits d'une plaque de 48 puits revêtue de vitronectine.Ensuite, placer les cultures de FLS sous un microscope stéréo sur un banc propre et utiliser une pipette de 10 microlitres pour découper autour d'une colonie d'intérêt. À l'aide d'une pipette de 200 microlitres, transférer la colonie sélectionnée dans un puits de la plaque 48 puits. Une fois toutes les colonies prélevées, placer la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire jusqu'à ce que les colonies soient suffisamment grandes pour être transférées.Scinder les cellules lorsque les colonies sortent du champ visible du microscope, observé à un grossissement de 100X. Sur cette image, on peut observer la morphologie des LSF isolées après une culture initiale de 14 jours. Les cellules présentent les caractéristiques générales des fibroblastes, avec une expression similaire des marqueurs fibrotiques vimentine et fibronectine, ainsi qu'une faible expression du marqueur des synoviocytes de type macrophage CD-68. Entre 8 et 11 jours après la transduction lentivirale des facteurs de Yamanaka, de petites colonies commencent à apparaître ; celles-ci peuvent être sélectionnées et amplifiées sur 5 à 10 passages.Ces iPSC de la polyarthrite rhumatoïde expriment la phosphatase alcaline, indiquant qu'elles demeurent indifférenciées. Les cellules expriment également des marqueurs de pluripotence, comme confirmé par analyse RT-PCR et par immunofluorescence. Les iPSC de la polyarthrite rhumatoïde présentent un caryotype chromosomique normal de 44+XY, tel que déterminé par caryotypage.En outre, 12 semaines après leur injection dans des souris SCID, les iPSC de l’arthrite rhumatoïde ont formé des tératomes présentant des phénotypes tissulaires variés. La différenciation en couches germinales a été confirmée par coloration immunofluorescente. Une fois maîtrisée, la technique permet de générer des iPSC à partir de cellules synoviales (FLS) du tissu synovial.Après avoir visionné la vidéo, vous devriez mieux comprendre comment isoler à partir de tissu synovial et comment induire un reprogrammation en utilisant ces cellules. Ces iPSC dérivées de RAF-FLS peuvent être utiles pour l'étude de la régénération ou du criblage pharmacologique en rhumatologie. Une fois ces iPSC établies, divers types de cellules cibles ou d'organes peuvent être générés.ce qui peut être utile pour l'étude de la maladie ou d'autres applications futures, telles que l'édition génique, entre autres.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

Nous présentons un protocole de reprogrammation efficace des cellules somatiques humaines dans l'homme cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux codant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) et l'identification des hiPSC correctement reprogrammé par coloration en direct avec des Tra 1-81 anticorps.

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Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients (Vidéo) | JoVE Journal

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