Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

L'objectif général de cette procédure est la collecte non invasive de liquide synovial et de moelle osseuse chez des miniporcs afin d'obtenir des cellules souches mésenchymateuses destinées à des études de régénération et d'immunomodulation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie par cellules souches mésenchymateuses en otologie, telles que la mise en place de la culture de cellules souches mésenchymateuses à partir du liquide synovial, et leur caractérisation comparée aux cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse. Le principal avantage de cette technique réside dans l'établissement efficace des propriétés fondamentales des cellules souches mésenchymateuses dérivées du liquide synovial et de la moelle osseuse chez les miniporcs, ce qui s'avérera utile pour des applications cliniques chez les patients.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie de diverses maladies articulaires, car la population de cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées du liquide synovial dans la cavité synoviale est significativement augmentée chez les patients sportifs. Bien que cette méthode puisse apporter des connaissances dans le domaine de la médecine régénérative, elle peut également être appliquée à d'autres études, telles que la recherche sur les maladies auto-immunes. Étant donné que les CSM du miniporc sont autologues, la suppression immunitaire pourrait présenter un intérêt pour l'humain.

En plus des autres scientifiques, la procédure sera démontrée par Hyeon-Jeong Lee et Won-Jae Lee de mon niveau trois. Pour commencer, positionnez un miniporc sous anesthésie afin d'accéder à la crête iliaque. Ensuite, rasez une région de 15 centimètres carrés sur la crête iliaque à l'aide d'un rasoir ou d'un tondeur.

Ensuite, frictionner alternativement la peau exposée trois fois avec de la povidone-iodée et de l'éthanol à 70 %. Une fois complètement séché, appliquer des champs stériles. Pré-enduire maintenant une seringue de dix millilitres d'héparine, en utilisant un rinçage de trois à quatre millilitres.

Cela empêchera la moelle osseuse de coaguler pendant son prélèvement. Ensuite, fixez fermement un extracteur de moelle osseuse à une seringue préalablement enduite d'héparine, exactement au niveau de la crête iliaque, et prélèvez au moins cinq millilitres de moelle osseuse. Pour isoler les cellules de la moelle osseuse prélevée, diluez-la d'abord avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 millilitres, à température ambiante.

Ensuite, introduisez trois millilitres de milieu de centrifugation par gradient de densité dans un deuxième tube conique de 15 millilitres. Puis, transférez soigneusement quatre millilitres de moelle osseuse diluée sur le milieu de centrifugation par gradient de densité afin de former deux couches de solutions. Centrifugez maintenant le tube à 400 G pendant 40 minutes à température ambiante.

Les MNC souhaitées sont recueillies dans la couche blanche centrale. Aspirez uniquement cette couche. Éjectez la couche de MNC dans un tube conique de 15 millilitres et diluez-la avec sept à huit millilitres de DPBS.

Ensuite, centrifuger les cellules à 500 G pendant dix minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant et laver les cellules en pellet deux fois avec dix millilitres de DPBS, en répétant le cycle de centrifugation précédent. Après les deux lavages, nous suspendons les MNC dans deux millilitres de ADMEM.

Ensuite, déposez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres et incubez-les à 38,5 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Après 48 heures, aspirez le milieu ainsi que les MNC non attachées. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu ADMEM frais et poursuivez l'incubation en changeant le milieu tous les trois jours.

Lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %, lavez la culture avec du DPBS frais. Ensuite, dissociez les cellules en utilisant un millilitre de trypsine-EDTA 0,25 % pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Récupérez les cellules dans dix millilitres de ADMEM, puis transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, centrifuger les cellules à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Maintenant, resuspendre les MNC récoltés dans un millilitre de milieu ADMEM frais et mesurer leur densité. Terminer par la mise en culture de 0,5 à 0,75 million de cellules dans des flacons T25 contenant quatre millilitres de milieu ADMEM.

Incuber les flacons comme les plaques, et changer le milieu tous les trois jours. Préparer une section de peau de 15 x 10 centimètres au-dessus de l'articulation fémorale, comme cela a été fait lors de la préparation pour les prélèvements de moelle osseuse. Puis, palper sous la peau la rotule et les crêtes tibiales afin d'identifier l'articulation synoviale, et insérer une seringue de trois millilitres équipée d'une aiguille de calibre 23 directement dans l'articulation.

À l’aide d’une aspiration douce, extraire entre 0,5 et un millilitre de liquide, puis retirer immédiatement l’aiguille. Si le volume de liquide synovial est trop faible, rincer la cavité avec du DPBS afin de recueillir le liquide synovial mélangé au DPBS. Le volume de DPBS à utiliser varie en fonction de la taille de la cavité synoviale.

Le volume optimal de liquide synovial est limité dans l'articulation saine. Ce volume varie selon la taille et l'état pathologique de l'articulation concernée. Pour isoler les cellules du liquide synovial, diluez le liquide avec un volume équivalent de DPBS dans un tube conique de 15 millilitres à température ambiante.

Ensuite, nous éliminons les débris en filtrant la dilution à travers un tamis cellulaire en nylon de 40 microns. Puis, ajoutez encore dix millilitres de DPBS, et centrifugez la suspension à 400 G pendant dix minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant, et lavez les cellules deux fois en utilisant du DPBS.

Nous suspendons le culot cellulaire lavé dans deux millilitres de ADMEM. Ensuite, poursuivons la culture des cellules comme cela a été démontré avec les CSM. Les CSM ont été isolées avec succès à partir de la moelle osseuse et des articulations synoviales des miniporcs et amplifiées in vitro.

La morphologie des MSCs provenant du liquide synovial est similaire à celle des MSCs provenant de la moelle osseuse : les deux présentent une forme fusiforme fibroblastique et sont homogènement adhérents. Les MSCs ont montré une expression positive au marquage de la phosphatase alcaline après la troisième sous-culture. Ensuite, les marqueurs de surface ont été analysés dans les deux cultures.

Comme prévu, les deux types de MSC exprimaient de manière significative CD29, CD44 et la vimentine. En revanche, l'expression de CD34 et de CD45 était négative ou faible. Ces résultats étaient identiques à ceux obtenus avec des MSC distinctifs, y compris les cellules isolées du liquide synovial.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment prélever de manière non invasive le liquide synovial et la moelle osseuse afin d'isoler leurs cellules souches mésenchymateuses (CSM) chez les miniporcs, ainsi que comment effectuer la comparaison et le phénotypage de ces CSM. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de localiser avec précision le point cible sur la crête iliaque et au niveau de l'articulation synoviale, déterminé par une palpation attentive. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des modèles d'arthrose ou d'arthrite rhumatoïde, peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires, comme de savoir si non seulement les CSM de la moelle osseuse, mais aussi celles du liquide synovial, possèdent une capacité similaire à initier la formation du cartilage ou de l'os, ainsi qu'à exercer des effets immunosuppresseurs.

Après son développement, cette technique a fait progresser la thérapie autologue des maladies articulaires en aidant à caractériser les cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées des articulations atteintes ou enflammées chez les patients arthritiques.