Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

L’objectif global de cette procédure est le prélèvement non invasif de liquide synovial et de moelle osseuse de miniporcs afin de collecter des cellules souches mésenchymateuses qui seront utilisées dans des études de régénération et d’immunomodulation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie des CSM otologistiques, telles que la façon d’établir le liquide synovial dans les CSM et comment les caractériser par rapport aux CSM de moelle osseuse. Le principal avantage de cette technique est d’établir efficacement les propriétés clés du liquide synovial et des CSM dérivées de la moelle osseuse à partir de miniporcs, ce qui sera utile pour une application chez les patients.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de diverses maladies articulaires, car la population de CSM dérivée du liquide synovial dans la cavité synoviale est considérablement augmentée chez les patients sportifs. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la médecine régénérative, elle peut également être appliquée à d’autres études telles que la recherche sur les maladies auto-immunes. Parce que les CSM miniporc sont autologues, l’immunosuppression pourrait intéresser les humains.

En plus des autres scientifiques, Hyeon-Jeong Lee et Won-Jae Lee de mon niveau trois feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, orientez un miniporc anesthésié pour accéder à la crête iliaque. Ensuite, épilez une région de 15 centimètres carrés sur la crête iliaque, à l’aide d’un rasoir ou d’une tondeuse.

Ensuite, frottez alternativement la peau exposée trois fois avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %. Une fois complètement sec, appliquez des champs stériles. Maintenant, pré-enduisez une seringue de dix millilitres d’héparine, en utilisant un rinçage de trois à quatre millilitres.

Cela empêchera la moelle osseuse de coaguler pendant son extraction. Ensuite, précisément au niveau de la crête osseuse iliaque, fixez fermement un extracteur de moelle osseuse à la seringue enrobée d’héparine et extrayez au moins cinq millilitres de moelle osseuse. Pour isoler les cellules de la moelle osseuse extraite, diluez-la d’abord avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 millilitres à température ambiante.

Ensuite, chargez trois millilitres de média de centrifugation de densité dans un deuxième tube conique de 15 millilitres. Ensuite, transférez soigneusement quatre millilitres de moelle osseuse diluée sur le milieu de centrifugation à densité pour créer deux couches de solution. Maintenant, centrifugez le tube à 400 G pendant 40 minutes à température ambiante.

Les multinationales souhaitées sont collectées dans la couche blanche centrale. Aspirez uniquement cette couche. Éjectez la couche MNC dans un tube conique de 15 millilitres et diluez-la avec sept à huit millilitres de DPBS.

Ensuite, centrifugez les cellules à 500 Gs pendant dix minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et lavez deux fois les cellules palettisées avec dix millilitres de DPBS, en répétant le cycle de centrifugation précédent. Après les deux lavages, nous suspendons les multinationales dans deux millilitres d’ADMEM.

Ensuite, chargez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres et incubez-les à 38,5 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Après 48 heures, aspirez le support avec les multinationales non attachées. Ensuite, rajoutez deux millilitres d’ADMEM frais, et continuez l’incubation en changeant de milieu tous les trois jours.

Lorsque les cellules atteignent 70 à 80 % de confluence, laver la culture avec du DPBS frais. Ensuite, dissociez les cellules à l’aide d’un millilitre de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Collectez les cellules dans dix millilitres d’ADMEM et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, faites tourner les cellules à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante et jetez le surnageant. Maintenant, suspendez les MNC récoltées dans un millilitre d’ADMEM frais et mesurez leur densité. Terminer par un placage entre 1/2 et trois quarts de million de cellules dans des flacons T25 avec quatre millilitres d’ADMEM.

Incuber les flacons comme les assiettes et changer de milieu tous les trois jours. Préparez une section de peau de 15 x 10 centimètres sur l’articulation fémorale, comme cela a été fait lors de la préparation des prélèvements de moelle osseuse. Ensuite, palpez les crêtes de la rotule et du tibia sous la peau pour identifier l’articulation synoviale, et insérez une seringue de trois millilitres avec une aiguille de calibre 23, précisément dans l’articulation.

À l’aide d’une aspiration douce, extrayez entre 1/2 et un millilitre de liquide et retirez immédiatement l’aiguille. Si le volume de liquide synovial est trop petit, rincez la cavité avec du DPBS pour recueillir le liquide synovial avec DPBS. Le volume de DPBS à utiliser varie en fonction de la taille de la cavité synoviale.

Le volume optimal de liquide synovial est limité dans les articulations saines. Le volume varie en fonction de la taille et de l’état pathologique de son articulation. Pour isoler les cellules du liquide synovial, diluez le liquide avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 millilitres à température ambiante.

Ensuite, nous déplaçons les débris en filtrant la dilution à travers une crépine en nylon de 40 microns. Ensuite, ajoutez dix millilitres supplémentaires de DPBS et centrifugez la suspension à 400 G pendant dix minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant et lavez les cellules deux fois, à l’aide de DPBS.

Nous suspendons la palette cellulaire lavée dans deux millilitres d’ADMEM. Ensuite, on procède à la culture des cellules, comme cela a été démontré avec les CSM. Les CSM ont été isolées avec succès de la moelle osseuse et des articulations synoviales articulaires des miniporcs et développées in vitro.

La morphologie des CSM dérivées du liquide synovial est similaire à celle des CSM dérivées de la moelle osseuse : les deux ont une forme de fuseau fibroblastique et sont adhérentes de manière homogène. Les CSM ont montré une expression positive pour la coloration à la phosphatase alcaline après la fin de la troisième sous-culture. Ensuite, des marqueurs de surface ont été analysés dans les deux cultures.

Comme prévu, les deux types de CSM expriment significativement CD29, CD44 et Vimentin. En revanche, l’expression de CD34 et CD45 était négative et faible. Ces résultats étaient identiques à ceux obtenus par des CSM distinctes, y compris des cellules isolées du liquide synovial.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’aspirer de manière non invasive le liquide synovial et la moelle osseuse afin d’isoler leur CSM des miniporcs et comment effectuer la comparaison et le phénotypage de cette CSM. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de localiser le point objectif sur la crête iliaque et la synoviale, déterminé par une palpation soigneuse. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme dans des modèles d’arthrose ou de polyarthrite rhumatoïde peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si non seulement des CSM de moelle osseuse, mais aussi du liquide synovial les CSM ont une capacité similaire pour l’initiation du cartilage ou de l’os et les immunosuppressions.

Après son développement, cette technique a fait progresser la thérapie autologue des maladies articulaires en aidant à caractériser les CSM dérivées d’une articulation attaquée ou enflammée chez les patients atteints d’arthrite.