Name: Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 학습하세요 미니피그의 활액과 골수에서 중간 엽 줄기 세포를 비침습적으로 분리하고 배양하는 방법을. 유세포 분석을 통한 세포 표현형 분석으로 재생의학 및 면역조절 연구에 활용할 수 있습니다.

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차세대 BioGreen 21 프로그램(No. PJ007969), 농촌개발청(Rural Development Administration) 및 국립연구재단(National Research Foundation, 보조금 번호. NRF-2015R1D1A1A01056639)에 의해 채택되었습니다.

동물 실험은 경상 대학교에서 생물 의학 실험을위한 동물 센터에 의해 승인되었다. 동물 절차 1. 준비 <ol><li> 골수 및 활액에서 중간 엽 줄기 세포의 비 침습적 수집 성인에게 여성 minipigs를 준비합니다. 마취 및 샘플 컬렉션에 일일 전에 minipigs의 임상 검사를 수행합니다. <ol><li> 완전한 혈액 카운트 테스트를 사용하여 체온, 호흡 및 심장 박동, 그리고 돼지의 행동 및 혈액 학적 상태의 관찰을 포함 신체 검사, 임상 적 정상적인 동물을 제공합니다. 참고 : 임상 적으로 건강한 minipigs에 대한 매개 변수 간격은 11입니다 - 호흡 속도 29 / 분, 68 - 심박수 98 / 분, 37 - 체온 38 ° C. </li></ol></li><li> 12 시간 프리 오 - (6)의 수술 전 금식 기간 동안 케이지에서 모든 식용 침구를 제거젊은 성인 minipigs을위한 마취 관리에 r은 금식의 3 시간은 신생아 관찰해야한다. 마취 시간까지 식수 제공합니다. </li></ol> 마취에 대한 동물의 2. 준비 <ol><li> 아세 프로 마진 (0.1 ㎎ / ㎏), 메데 토미 (0.03 ㎎ / ㎏) 및 아트로핀 (0.04 ㎎ / ㎏)으로 마취의 투여 전에 minipigs을 의료를 베풀다. <ol><li> 성인 minipigs 적어도 30mm 길이의 21 G 바늘을 사용하는 약물의 모든 근육 내 (IM)를 주입한다. 측면 자궁 근육이나 허벅지 근육에 IM 주입을 귀 뒤에 1-3cm를 수행합니다. 참고 : 동물의 두려움이나 스트레스를 유도하거나 안전하게 전 처치를 주입 거친 취급을 필요로하지 않고 모든 절차를 수행합니다. </li></ol></li><li> 지느러미 - 누운 위치에 minipigs를 놓습니다. </li><li> 다섯 분 전 처치의 투여 후, 1.5 % 이소 플루 란 관리자를 사용하여 마취를 시작흡입을 통해 istered. <ol><li> 산소를 캐리어 가스로 2.5 %의 농도가 증가 하였다 기관 내 튜브를 통해 이소 플루 란 (1.5 %)의 흡입, (1.5 L / 분)을 계속한다. </li></ol></li><li> 계속 마취 동안 minipigs의 심박수, 체온, 경피 혈중 산소 포화도 (SPO 2)를 모니터링한다. 체온을 유지하기 위해 39 °의 C - (38)의 온도에서 순환 블랭킷을 사용한다. 마취 동안 건조로부터 눈을 보호하기 위해 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 마취 (13)의 깊이를 평가하는 Guedel의 분류를 따르십시오. </li></ol> 세포 분리 및 배양 3. 준비 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 고급 둘 베코 변성 이글 배지 (ADMEM), 1 % 루타 500 ㎖, 염기성 섬유 아세포 성장 사실상에게 10ng의 / ㎖을 제조 골수 및 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포를 배양하는 방법R (bFGF를), 1.0 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (각각 10,000 IU 10,000 μg의의 / ㎖, 펜 연쇄상 구균). <ol><li> 공동 인큐베이터 내에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 3,850 ℃에서 ADMEM 부화. </li></ol></li><li> 세포의 분리 및 세척은 제조업체의 지시에 따라 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 500ml의 준비. </li></ol> 4. Minipigs에서 골수를 수집 <ol><li> 지역 장골의 문장 (그림 1)의 크기는 약 15 X 15cm를 선택하고 살균 면도기 나 전기 면도기를 사용하여이 영역에서 머리를 제거합니다. 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올 다음 미니 피그가 위치되면, 교대 순서 사이트를 다음 멸균 제 3 회 문질러. 영역이 완전히 건조 후, 멸균 커튼을 적용합니다. </li><li> 프리 코트 (3)으로 세정하여 헤파린 100 U / ㎖로 10 ML의 주사기 - ejec 전에 헤파린의 4 ml의팅 항 응집제. 참고 : 골수 흡인 동안 주사기에 응고를 방지하기 위해이 단계를 수행합니다. </li><li> 단단히 헤파린 미리 코팅 된 10 ML의 주사기에 부착 된 골수 추출기 (3.0 × 100mm)를 사용하여, 마취에서 미니 피그의 장골 뼈에서 골수 5 ㎖의 최소한의 압축을 풉니 다. </li></ol> 뼈 골수로부터 체외 배양에서 추출 된 세포의 5. 분리 <ol><li> 추출 된 골수로부터 세포를 분리. <ol><li> 실온에서 15ml의 원뿔형 튜브 DPBS 같은 부피로 추출한 골수 희석. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브 밀도 원심 분리 미디어 (피콜 - 페이크)의 3 ML을 추가합니다. </li><li> 실온에서 40 분 동안 400 × g에서 4 mL를 혼합하지 않고 밀도 원심 매체에 배치 DPBS 함께 골수의 층, 및 원심 분리기를 희석. </li><li> 단핵 세포 층 수확플라즈마 (상층)과 밀도 원심 분리 매체 (바닥 층)을 포함하는 두 층 사이에 버피 코트로부터 (다국적)과, 15ml의 원뿔형 튜브에 다국적 옮긴다. </li><li> 7 전사 다국적 희석 - DPBS 8 ml를 실온에서 10 분 동안 500 × g에서 원심 분리하여 그들을. 뜨는을 취소하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> ADMEM 2 ㎖의 세포 펠렛을 일시 중단하고, 35mm 조직 배양 접시에 옮긴다. 5 % CO 2의 가습 분위기에서 38.5 ° C에서 배양 접시를 품어. </li></ol></li><li> 골수에서 분리 한 세포의 체외 배양합니다. <ol><li> 48 시간 후, 접시에 부착되지 않은 세포와 배지를 흡인하고 ADMEM 2 ㎖를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C로하여 배양한다. 세 번째마다 일 매체를 변경합니다. </li><li> 70 - 80 % 컨 플루 0.25 % 1 ㎖ 그들을 해리, DPBS로 세포를 씻어세포가 분리 될 때까지 5 분 - 트립신 / EDTA, 그리고 (3) 37 ℃에서이를 부화. </li><li> ADMEM 10 ㎖를 사용하여 세포를 수확 15 ml의 원추형 튜브로 전송하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 그들을. 상층 액을 버린다. </li><li> 신선한 ADMEM 1 ㎖에 수확 된 세포를 일시 중단하고 혈구를 사용하여 계산합니다. </li><li> 5의 셀 배치 - ADMEM 4 mL를 함유 7.5 × 105 / 25T 플라스크 및 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C에서 그들을 부화. 세 번째마다 일 매체를 변경합니다. </li></ol></li></ol> Minipigs에서 유체 활액의 6. 컬렉션 <ol><li> 골수 흡인하는 절차와 유사하게, 대퇴 관절을 통해 약 15 X 10cm (길이 / 폭)의 적절한 영역을 선택하고 살균 면도기 나 전기 면도기를 사용하여 머리를 제거, 살균 절차 (단계 4.1)에 의해 수행합니다. </li><li> 23 G와 3 ML의 주사기를 삽입촉진 랜드 마크 (슬개골 및 경골 크레스트) 후 관절에 바늘. <ol><li> 관절의 활액의 흡입 용 주사기에 부드러운 흡입을 적용합니다. 1 ㎖, 그러나 이것은 미니 피그 또는 관절의 크기에 따라 변화 - 관절 활액에서 수집의 대략 부피는 0.5이다. 활액의 회수 용적이 너무 작 으면 활막 캐비티 DPBS 통해 세척. </li><li> 즉시 혈액 오염을 방지하기 위해 주사기를 철회. </li></ol></li></ol> 수집 된 활액에서와 체외 재배 7. 세포 분리 <ol><li> 흡입 된 활액에서 세포를 분리. <ol><li> 실온에서 15ml의 원뿔형 튜브 DPBS 같은 부피로 흡입 활액 희석. </li><li> 파편을 제거하기 위해, 40 ㎛의 나일론 세포 여과기를 사용하여 희석 활액 필터. </li><li> 필터링 된 활액을 포함하는 튜브에 DPBS 10 mL를 추가액을 실온에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리하여. 뜨는을 취소하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 2의 셀을 배치 ADMEM 2 ㎖의 세포 펠렛을 일시 - ADMEM 2 ㎖로 3 × 105 세포 / 35mm 조직 배양 접시에, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C에서 그들을 부화 . </li></ol></li><li> 격리 된 활액 - 유래 중간 엽 줄기 세포의 체외 배양 단계를 반복 5.2. </li></ol> Minipigs 8. 이후 절차 케어 <ol><li> 필요한 경우, 골수 컬렉션 후, 피부 스테이플러를 사용하여 하나의 봉합사와 골수 추출기 주사 부위 피부를 닫는다. </li><li> 절차가 완료된 후 3 일 동안 하루에 한번 minipigs enrofloxacin (5 ㎎ / ㎏) 및 멜 록시 캄 (0.2 밀리그램 / kg)을 근육 주사를 투여. </li><li> 절차가 완료된 후, 골수 및 활액 수집 사이트 소독0.1 % 포비돈 요오드 번 3 일간 하루에. 조심스럽게 합병증의 징후 (예를 들어, 부종, 고름, 또는 적색)를 모니터링 매일 관찰한다. </li></ol> 유동 세포 계측법을 사용하여 9 셀 표현형 <ol><li> 유로 (3) 80 % 합류 - - 5, DPBS로 세포를 씻어 0.25 % (v / v)의 트립신 / EDTA 1 ml의 그들을 대하는 중간 엽 줄기 세포는 70 때. 세포가 분리 될 때까지 5 분 - 그럼, 3, 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> DPBS 10 ㎖를 사용하여 세포를 수확 15 ml의 원추형 튜브로 전송하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 그들을. 상등액을 버리고. </li><li> 세포를 해결하려면, 3.7 %의 포름 알데히드 용액 10 ㎖의 세포 펠렛을 중단하고 분석하기 전에 하루 동안 4 ° C에서 보관하십시오. <ol><li> 어느 날 고정 후, DPBS 두 번 5 분마다 300 × g에서 원심 분리를 이용하여 세포를 씻는다. 상등액을 버리고. </li><li> 4 ㎖ 중의 세포 펠렛을 정지1 % 소 혈청 알부민 (/ V w) (BSA)을 첨가하고, 비특이적 된 Fc 매개의 상호 작용을 차단하는 4 ° C에서 1 시간 동안 펠렛을 부화되어 DPBS의. </li><li> 1.5 ml의 튜브에 세포 현탁액 500 ㎕를 분취를 배포합니다. </li><li> 비공 항체 (CD29 및 멘틴)의 경우, 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 세포를 세척 하였다. 상등액을 버리고. </li><li> 1의 500 μL의 세포 펠렛 일시 : 차 항체의 100 희석 4 ° C에서 1 시간 동안 그것을 품어. </li><li> 각 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 1 % 소 혈청 알부민 회 세포를 세척 하였다. 상등액을 버리고. </li><li> 차 항체를 π 공역 계 플루 오레 신 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 희석 4 ° C에서 어둠 속에서 1 시간을 품어 : 1의 500 μL의 세포 펠렛을 일시 중단합니다. </li></ol></li><li> FITC - 복합 항체 (이소, CD34, CD44 및 CD45)의 경우, centrifu로 세포를 씻어3 분 동안 300 × g에서 gation. 상등액을 버리고. <ol><li> 1 500 μL의 세포 펠렛을 일시 중단 : 100 FITC - 복합 항체를 4 ℃에서 어둠 속에서 1 시간을 품어. </li><li> 모두 염색 조건 5 분마다 300 × g에서 원심 분리에 의해 DPBS 두 번 세포를 씻어. 상등액을 버리고. </li><li> , DPBS 500 μL의 세포를 일시에 5 mL의 둥근 바닥 튜브로 전송하고, 8 플로우 사이토 미터를 사용하여 결과를 분석한다. </li></ol></li></ol>

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Minipigs 골수 및 활액에서 중간 엽 줄기 세포의 분리를 확립하는데 사용 하였다. 연령, 성별, 질환 등 다양한 생리 학적 조건을 제거하기 위해, 동종 배경 기증자 minipigs 정확하게 셀 소스 의존 특성을 평가하기 위해 선택되었다. 피그 것으로 알려진 해부학 적, 생리 학적 및 유전자 인간과 유사한 것으로, 특히 크기가 일치 장기를 생산할 수 minipigs; 따라서 이들은 이종 14,15 대용 도너 종으로서 사용할 수있다. 돼지와 사람에서 중간 엽 줄기 세포는 동일한 IDO이 있지만 MSC들, indoleamine 2,3- 디옥 시게나 제 (IDO) 및 산화 질소 합성 효소 (NOS)의 최근 제안 면역 속성에 관해서는, 종 - 특이 면역 억제를 중재하는 중간 엽 줄기 세포로 사용했다 (9) . 따라서, 중간 엽 줄기 세포 기증자로 돼지 모델은 인간의 치료를위한 중간 엽 줄기 세포의 면역 반응의 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 돼지 줄기 연구세포는 시험관 ...

다분화능 중간엽 줄기세포(MSC)는 중간엽 세포 계통으로 분류할 수 있으며, MSC는 골수, 탯줄, 태반, 지방 조직, 피부 피부, 골격근, 모낭, 활액막 및 치아1-5와 같은 다양한 조직 공급원에서 확립 및 분리되었습니다. 현재 활막 유래 MSC는 뼈 분획, 골관절염 및 류마티스 관절염(RA)과 같은 관절 질환 치료에 도움이 될 수 있으며, 손상된 연골이나 뼈에서 MSC의 재생 잠재력으로 인해 면역 조절 또는 자가면역 질환 치료에도 도움이 될 수 있기 때문에 현재 활막 유래 MSC에 주목하고 있습니다6-8. 활액 공급원에서 유래한 MSC에 대한 대부분의 연구는 활액이 아닌 활액막에서 MSC를 사용했습니다2,9; 따라서 활액 유래 MSC에 대한 생물학적 이해는 제한적입니다.
활액은 쉽게 접근할 수 있는 MSC 공급원으로, 환자의 진단 또는 치료 중에, 그리고 골관절염이나 RA와 같은 침습적 시술이 필요하지 않은 다양한 관절염 상태의 진단 확인 중에 흡인할 수 있습니다. 활액강에서 활액 유래 MSC의 개체군은 관절염 환자가 없는 환자에 비해 관절염 환자에서 유의하게 증가한다10-12. 따라서 활액은 MSC에 대한 훌륭한 공급원 후보이며, 특히 관절에 염증이 있거나 손상된 환자의 자가 줄기 세포 치료에 적합합니다. 또한 활액 유래 MSC는 연골형성 능력, 면역조절 능력 및 높은 증식 속도를 가지고 있습니다. 이 연구는 비침습적 방법을 사용하여 미니돼지에서 골수 추출 및 활액 흡인과 분리된 세포의 체외 확장 및 세포 표현형 분석을 위한 프로토콜을 수립했습니다.

<table><tbody><tr><td>고급 Dulbecco' s 변형된 독수리 배지 (ADMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-023</td><td>MSC 배양 배지</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>세포 세척 배지, Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td> 없음<td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>MSC 배지</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>MSC 배지</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td> 구성 요소 <td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>MSC 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)</td><td>Simga</td><td>F0291</td><td>MSCs 중간</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td>의 구성 <td>요소Sigma</td><td>A6003</td><td>MSCs 중간 구성</td></tr><tr><td>요소 Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>세포 해리 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>MSC의 구성 요소</td></tr><tr><td>매체 이소타입 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 550616</td><td>Isotype Control</td></tr><tr><td>CD29 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD</td><td>552369 Integrin beta-1 MSC 마커</td></tr><tr><td>CD44 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 553133</td><td>세포 표면 당단백질 MSC 마커</td></tr><tr><td>CD45 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 340664</td><td>조혈 줄기 세포 마커</td></tr><tr><td>CD34 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555821</td><td>조혈 줄기 세포 마커</td></tr><tr><td>CD90 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555595</td><td>Thy-1 막 당 단백질 MSC 마커</td></tr><tr><td>MHC 클래스 II 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32247</td><td>항원 제시 세포 마커</td></tr><tr><td>Vimentin 항체</td><td></td><td>Sigma Sigma-S6389</td><td>유형 III 중간 필라멘트 MSC 마커</td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td>5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)</td></tr><tr><td>의 혼합물Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>밀도 구배 원심분리</td></tr><tr><td>세포 여과</td>기 <td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro; m 나일론 세포 여과기</td></tr><tr><td>15ml 폴리스티렌 원추형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>351095</td><td>샘플 수집 및 세포 분리</td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>세포 배양 접시</td></tr><tr><td>골수 추출기</td><td>GmbH Medizintechnologie, Germany</td><td>1145-1W010</td><td>TrokaBone, 3.0 x 100 mm</td></tr><tr><td>Hematocritchamber</td><td>Marinfeld</td><td>640130</td><td>세포 계수 챔버</td></tr><tr><td>아트로핀</td><td>제일제약, 한국</td><td></td>, <td>아트로핀, 황산염, 하이드레이트</td></tr><tr><td>, 아세프로마진,</td><td>사무, 메디안, 한국</td><td></td>, 마취제, 진정<td>제 및 항구토</td></tr>제, <tr><td>메데토미딘</td>, <td>화이자</td><td></td>, <td>마취제 및 진</td></tr>통제, <tr><td>엔로플록사신</td>, <td>바이엘 헬스케어, 독일</td><td></td>, <td>항생제,</td></tr><tr><td>멜록시캠</td>, <td>수의학, </td><td></td> 아르헨티나 <td>항염증 및 진</td></tr>통제 <tr><td>Isoflurane</td><td>Hana pharm, 한국</td><td></td><td>흡입 마취제</td></tr><tr><td>포비돈 요오드&nbsp;</td><td>한국 제약, 한국</td><td></td><td>살균제</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마</td><td>E7023</td><td>살균제</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마</td><td>H3393</td><td>항응고제</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마</td><td>F8775</td><td>세포 고정제</td></tr><tr><td>안과 연고&nbsp;</td><td>화이자</td><td></td><td>옥시테트라사이클린 HCl과 폴리믹신 B 황산염</td></tr><tr><td>순환수 담요</td><td>Gaymar 산업</td><td></td><td>마취 중 및 마취 후 온난화 시스템</td></tr><tr><td>피부 스테이플러</td><td>Covidien, 미국</td><td></td><td>봉합사 피부 폐쇄</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Forma</td><td>3111</td><td>세포 배양 장비</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>세포 분석기</td></tr><tr><td>Minipig</td><td>PWG Genetics Korea, Ltd.</td><td>T형</td><td>미니어처 돼지</td></tr></tbody></table>

minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

중간엽 줄기세포(MSC)는 골수 및 활액을 포함한 다양한 조직 공급원에서 분리한 후 확립되었습니다. 최근에는 활액 유래 MSC가 다중 계통 분화 가능성과 면역 조절 기능을 가지고 있는 것으로 보고되었으며, 이는 이러한 세포가 조직 공학 및 전신 치료에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 연구는 세포 표현형 분석 및 체외 배양을 위한 세포 표면 마커를 분석하기 위해 미니돼지의 골수 및 활액에서 유래한 MSC의 간단하고 비침습적인 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 성적으로 성숙한 6개월 된 미니피그를 사용하여 골수 추출기를 사용하여 장골능 뼈에서 골수를 추출하고 대퇴골 관절에서 활액을 흡인했습니다. 두 출처에서 샘플을 수집하는 절차는 비침습적이었습니다. 수확된 세포 공급원에서 MSC를 효과적으로 분리하고 미니피그에서 안정적인 MSC를 확장하기 위한 체외 배양 조건을 만들고 전신 자가 처리법을 적용하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 세포 표현형 분석을 위해 두 세포의 세포 표면 마커를 유세포 분석을 사용하여 분석했습니다. 그 결과, MSC는 미니돼지의 활액에서 분리되었으며 활액 유래 MSC가 골수 유래 MSC와 유사한 형태 및 세포 표현형을 가지고 있음을 보여주었습니다. 따라서 비침습적으로 얻은 활액은 MSC의 귀중한 공급원입니다.

뼈 골수 및 Minipigs의 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포의 수립 중간 엽 줄기 세포가 성공적으로 (도 2) 골수 및 minipigs의 관절 활액 관절로부터 단리 및 시험 관내에서 확장시켰다. 활액 주사기 흡입은 ​​간단하고, 일차 세포의 체외 배양시에 충분한 부착 성 세포를 얻을 수있다. 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 형태는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 - 유사하고, 모두 중간 엽 줄기 세포가 섬유 아세포 스핀들 형상을 균일하게 부착된다. 세번째 계대 배양 종료 후 그들은, 알칼리 포스파타제 (AP) 염색 양성 발현이 관찰되었다. <strong...

미니피그의 활액과 골수에서 분리하고 주사기 흡인을 사용하여 비침습적으로 채취한 중간엽 줄기세포(MSC)를 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 세포 표현형분석은 세포 분리 후 유세포 분석을 사용하여 수행되었으며 MSC에서 유래한 골수 및 활액의 체외 배양을 수행했습니다.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

본 절차의 전반적인 목표는 재생 및 면역 조절 연구에 사용할 중간엽 줄기세포를 수집하기 위해 미니피그로부터 활막액과 골수를 비침습적으로 채취하는 것입니다. 이 방법은 활막액 내 MSC를 어떻게 확립하는지, 그리고 골수 MSC와 비교하여 이들의 특성을 어떻게 규명하는지와 같이 이비인후과 MSC 치료 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미니피그 유래 활막액 및 골수 유래 MSC의 핵심 특성을 효과적으로 확립하여 환자 적용에 유용하게 활용할 수 있다는 점입니다.운동선수 환자의 관절강 내 활막액 유래 MSC 집단이 유의미하게 증가한다는 점에서, 이 기술의 시사점은 다양한 관절 질환의 치료로 확대됩니다. 이 방법은 재생 의학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 자가면역 질환 연구와 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 미니돼지 MSC는 자가 이식성이므로, 인간의 면역 억제 연구에도 유용할 수 있습니다.다른 연구원들과 더불어, 제 3학년인 이현정과 이원재가 절차를 시연할 예정입니다. 우선, 장골능에 접근할 수 있도록 마취된 미니돼지의 자세를 잡습니다. 다음으로, 면도기나 클리퍼를 사용하여 장골능의 15-square-centimeter 영역을 제모합니다.그 다음, 노출된 피부를 포비돈-요오드와 70% ethanol로 번갈아 가며 3회 세척합니다. 완전히 건조되면 멸균 드레이프를 덮습니다. 이제 3~4 mL로 헹궈내어 10 mL 주사기를 헤파린으로 사전 코팅합니다.이렇게 하면 골수를 추출하는 동안 응고되는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음, 장골능(iliac bone crest)의 정확한 위치에 헤파린 처리된 주사기와 골수 추출기를 단단히 부착하고, 최소 5 mL의 골수를 추출합니다. 추출된 골수에서 세포를 분리하려면, 먼저 실온에서 15 mL 원심관(conical tube)에 동일한 부피의 DPBS를 넣어 희석합니다.그다음, 두 번째 15-milliliter 원뿔형 튜브에 밀도 원심분리 배지 3 milliliters를 넣습니다. 이어서, 희석된 골수를 밀도 원심분리 배지 위에 4 milliliters 조심스럽게 옮겨 두 개의 용액 층을 만듭니다. 이제 튜브를 실온에서 400 Gs로 40분 동안 원심분리합니다.원하는 단핵구(MNCs)는 중앙의 흰색 층에 수집됩니다. 이 층만 흡입하십시오. MNC 층을 15-milliliter 원추형 튜브에 옮기고, 7~8 milliliters의 DPBS로 희석하십시오.그런 다음, 상온에서 500 Gs로 10분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 버리고, 10 mL의 DPBS로 펠렛팅된 세포를 두 번 세척하며 이전의 원심 분리 과정을 반복합니다. 두 번의 세척 후, MNC를 2 mL의 ADMEM에 부유시킵니다.그 다음, 세포를 35mm 조직 배양 접시에 분주하고, 5% 이산화탄소가 공급되는 습윤 배양기에서 38.5°C로 배양합니다. 48시간 후, 부착되지 않은 MNC와 함께 배지를 흡입하여 제거합니다. 이어서 2mL의 신선한 ADMEM을 다시 첨가하고, 3일마다 배지를 교체하며 배양을 계속합니다.세포의 합쳐짐 정도(confluency)가 70에서 80%에 도달하면, 신선한 DPBS로 배양물을 세척합니다. 그 후, 37°C에서 0.25% Trypsin-EDTA 1 mL를 사용하여 3~5분 동안 세포를 해리시킵니다. 세포를 10 mL의 ADMEM에 수집하여 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.그 후, 실온에서 300 Gs로 5분 동안 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 이제 회수된 MNCs를 1 mL의 신선한 ADMEM에 현탁하고 세포 밀도를 측정합니다. 마지막으로, 4 mL의 ADMEM이 담긴 T25 플라스크에 50만에서 75만 개의 세포를 분주하여 마무리합니다.플라스크를 플레이트와 동일하게 배양하고, 3일마다 배지를 교체합니다. 골수 채취 준비 시와 마찬가지로 대퇴 관절 부위에 15x10 cm 크기의 피부 절개를 준비합니다. 그런 다음, 피부 아래에서 슬개골과 경골 능선을 촉진하여 활막 관절을 확인하고, 23-gauge 바늘이 장착된 3 mL 주사기를 관절 내로 정확하게 삽입합니다.부드럽게 흡입하여 1/2에서 1 mL 사이의 액체를 추출하고, 즉시 바늘을 뺍니다. 활액의 부피가 너무 적은 경우, DPBS로 공동을 세척하여 DPBS와 함께 활액을 수집합니다. 사용하는 DPBS의 부피는 활액 공동의 크기에 따라 다릅니다.건강한 관절에서 활액의 최적 부피는 제한적입니다. 부피는 관절의 크기와 병리학적 상태에 따라 달라집니다. 활액에서 세포를 분리하려면, 실온에서 15-milliliter 원추형 튜브에 활액과 동일한 부피의 DPBS를 넣어 희석하십시오.다음으로, 희석액을 40-micron 나일론 세포 스트레이너(cell strainer)로 여과하여 부스러기를 제거합니다. 그 다음, DPBS 10 mL를 추가로 넣고, 상온에서 400 Gs로 10분 동안 현탁액을 원심분리합니다. 이어서 상층액을 버리고, DPBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다.세척된 세포 펠릿을 2 mL의 ADMEM에 현탁합니다. 그 후, MSC에서 시연된 것과 같이 세포 배양을 진행합니다. 미니돼지의 골수와 관절 활막 관절에서 MSC를 성공적으로 분리하여 체외에서 증식시켰습니다.활액 유래 MSC의 형태는 골수 유래 MSC와 유사하며, 둘 다 섬유아세포와 같은 방추형 모양을 띠고 균질하게 부착됩니다. MSC는 3차 계대 배양이 완료된 후 알칼리성 인산분해효소 염색에서 양성 발현을 나타냈습니다. 다음으로, 두 배양액 모두에서 표면 마커를 분석하였습니다.예상한 대로, 두 종류의 MSC 모두 CD29, CD44 및 Vimentin을 유의미하게 발현하였습니다. 반면, CD34와 CD45의 발현은 음성이거나 낮았습니다. 이러한 결과는 활액에서 분리한 세포를 포함하여 서로 다른 MSC를 통해 얻은 결과와 동일했습니다.이 영상을 시청한 후, 미니돼지에서 MSC를 분리하기 위해 활액과 골수를 비침습적으로 흡인하는 방법과 이 MSC의 비교 및 표현형 분석을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때는 세심한 촉진을 통해 장골능과 관절낭의 목표 지점을 찾는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 골수 유래 MSC뿐만 아니라 활액 유래 MSC 또한 연골 또는 골 형성 및 면역 억제 능력을 동일하게 갖추고 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 골관절염 또는 류마티스 관절염 모델과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 개발 이후 관절염 환자의 손상되거나 염증이 있는 관절에서 유래한 MSC의 특성을 규명함으로써 관절 질환의 자가 치료를 발전시켰습니다.

isolation-cellular-phenotyping-mesenchymal-stem-cells-derived-from

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

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마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

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학습하세요 미니피그의 활액과 골수에서 중간 엽 줄기 세포를 비침습적으로 분리하고 배양하는 방법을. 유세포 분석을 통한 세포 표현형 분석으로 재생의학 및 면역조절 연구에 활용할 수 있습니다.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

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