Name: Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez la modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes par transfection et transduction. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes pathologiques musculaires.

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Nous remercions les Drs Tom Cooper du Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan de l’Université du Wisconsin-Madison et Didier Trono de l’Université de Genève pour les réactifs. Ce travail est soutenu par un fonds de démarrage de l’Université de Houston (YL), une subvention de l’American Heart Association (YL, 11SDG5260033) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (XP, 81460047).

1. C2C12 Culture cellulaire <ol><li> Maintenir les myoblastes de souris C2C12 dans une plaque de 100 mm dans du milieu de croissance (milieu d&#39;Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)) supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 20%, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Laisser les cellules C2C12 à des passages à devenir environ 50 - 60% de confluence. </li><li> Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec une solution saline 3 ml température ambiante tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et on ajoute 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA pour détacher les cellules. Placer la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 3 - 5 min. </li><li> Neutraliser la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de croissance. Pipeter 6 - 8 fois de suspendre les cellules. Ajouter 1 ml de cellules en suspension dans une nouvelle plaque de 100 mm et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. C2C12 cellulaire Transfection / transduction et sélection <ol><li> C2C12 transfection plasmidique <ol><li> 24 h avant la transfection, pfin 7,0 x 10 5 cellules C2C12 dans un puits d&#39;une plaque à six puits pour chaque transfection. Note: Ceci conduit à 50 - 60% de confluence au moment de la transfection. </li><li> Laisser le réactif de transfection à venir à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Ajouter 2 pg d&#39;ADN plasmidique (GFP-CUG5 ou GFP-CUG200) dans 200 ul préchauffé milieu sans sérum et vortex brièvement. Ajouter 6 ul réactif de transfection au milieu et mélanger immédiatement pendant 30 secondes en utilisant un vortex. Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Changer les médias de cellules C2C12 à 2,5 ml de milieu de croissance sans sérum. Ajouter le mélange de transfection aux cellules après incubation. Retourner les plaques à 5% de CO2, 37 ° C incubateur. </li><li> Maintenir les cellules dans le mélange de transfection / milieu de croissance exempt de sérum pendant 4 heures ou jusqu&#39;à la nuit. Changer les médias vers les médias de croissance le lendemain ou lorsque cytotoxicité est apparente. Remarque: La cytotoxicité est évaluée par inspection microscopique de la CElls. Observer les modifications de la morphologie cellulaire et le détachement des cellules. Tant qu&#39;il n&#39;y a pas de cytotoxicité manifeste, une nuit d&#39;incubation dans un milieu de croissance sans sérum améliore la transfection. </li><li> Sélectionner les cellules 48 h après la transfection par l&#39;addition de 1,2 à 1,6 mg / ml de G418 pendant environ 10 jours jusqu&#39;à ce que la culture témoin (sans transfecté les plasmides) n&#39;a pas de cellules vivantes. Changer les médias tous les deux jours avec un milieu de croissance supplémenté en G418. </li><li> Maintenir les cellules résistantes au G418 dans un milieu de croissance et de 5% de CO2 à 37 ° C pour les expériences ultérieures. </li></ol></li><li> Préparation de retrovirus et la transduction rétrovirale C2C12 <ol><li> Préparer HEK 293 du milieu de culture en la complétant DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. <ol><li> Environ 24 heures avant la transfection, la plaque 4,0 x 10 cellules d&#39;emballage à base de 293 HEK 6 écotropes dans une plaque de 100 mm (80% de confluence à la transfection) contenant milieu de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Laisser le réactif de transfection à venir à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Mélanger 15 pg d&#39;ADN de plasmide (ou pMSCV-Puro-pMSCV Celf1Flag-Puro) dans 1 ml de milieu de croissance sans sérum. brièvement Vortex. Ajouter 30 ul de réactif de transfection de l&#39;étape 2.2.2 dans le / milieu de croissance tubes sans sérum d&#39;ADN, et bien mélanger à l&#39;aide vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter goutte à goutte le mélange de transfection aux cellules d&#39;emballage à base de écotrope 293 HEK. Agiter doucement les plaques et les retourner à la 5% de CO 2, 37 ° C incubateur. Après 24 heures, changer les médias à moyen 10 ml préchauffée croissance frais. </li><li> Récolter le surnageant (contenant les retrovirus) 48 heures après transfection en utilisant une pipette et transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Ajouter 10 ml de nouveaux médias chauds à la plaque et le retourner à l&#39;incubateur. Gardez le surnageant à 4 ° C. Note: Le support est ajouté doucement à til côté du puits de manière à ne pas perturber la monocouche cellulaire. </li><li> Récolter le deuxième lot de surnageant 60 h après la transfection et la piscine avec le surnageant de 2.2.5. Centrifuger à 500 x g, 4 ° C pendant 7 min pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse. Utilisez retrovirus pour transduire des cellules C2C12 à ce point en procédant à l&#39;étape 2.2.9 ou aliquote et stocker le surnageant à -20 ° C pour une utilisation future. </li><li> Décongeler le retrovirus de 2.2.7 à la température ambiante, si un stock congelé est utilisé ici. Remarque: évitez de multiples cycles de gel-dégel. </li><li> Plaquer les cellules C2C12 le même jour de la transduction visant à 30-40% de confluence. <ol><li> Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec 3 ml température ambiante PBS. Retirez le PBS, ajouter 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA, et incuber la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 3 - 5 min. </li><li> Neutraliser la trypsine en ajoutant 3 ml med de croissanceium. Pipeter 6 - 8 fois de suspendre les cellules. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et ajoutez 8,0 x 10 5 C2C12 cellules à une plaque de 60 mm. </li></ol></li><li> Ajouter 0,5 ml retrovirus pour infecter une plaque de 60 mm de cellules dans 3 ml de milieu de croissance. Remettre la plaque dans l&#39;incubateur. </li><li> Remplacez-le par 3 ml de milieu frais additionné de sélection antibiotique (puromycine 1-3 pg / ml) 48 heures après l&#39;infection. Remplacer 3 ml de milieu avec des antibiotiques tous les jours pour ~ 5 jours jusqu&#39;à ce que la culture de contrôle de C2C12 non transduites meurt. </li></ol></li><li> préparation lentivirus et C2C12 lentiviral transduction Remarque: Effectuez toutes les procédures liées à lentivirus en niveau de biosécurité 2 cabinet et suivre les directives de sécurité biologique. Les déchets liquides contenant le virus doit être désinfecté avant leur élimination. <ol><li> Plaque 4,0 x 10 6 cellules 293T dans une plaque de 100 mm (~ 80% de confluence au jour de la transfection) avec HEK 293 du milieu de culture cellulaire (DMEM riche en glucose, supplémenté avec 10% du foetussérum bovin, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine) 24 h avant la transfection. </li><li> Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante. Mélanger les vecteurs d&#39;emballage lentiviral (4 pg pMD2.G et 6 pg psPAX2) avec vecteur de transfert lentiviral 8 pg (Celf1 shRNA ou brouillés contrôle shRNA) dans 1 ml de sérum milieu de culture cellulaire libre. brièvement Vortex. </li><li> Ajouter 36 ul préchauffée réactif de transfection à l&#39;ADN / tube de DMEM et bien mélanger par vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Éliminer les cellules 293T de l&#39;incubateur et ajouter le mélange de transfection à la plaque. Agiter doucement la plaque et le retourner à 5% de CO 2, 37 ° C incubateur. Après 24 heures, remplacer le mélange de transfection avec 10 ml de milieu de culture frais. </li><li> Recueillir le surnageant contenant lentivirus 48 h après la transfection et le transférer dans un tube de 50 ml de centrifugeuse. Ajouter 10 ml nouveaux médias chauds à la plaque et le retournerdans l&#39;incubateur. Stocker le surnageant à 4 ° C. </li><li> Recueillir le deuxième lot de surnageant 60 h après la transfection et les combiner avec le surnageant de 2.3.5. brièvement Centrifuger à 500 xg, 4 ° C pendant 7 min. </li><li> Transférer le surnageant dans un 50 ml tube frais de centrifugeuse. Si vous utilisez le virus frais, passez à l&#39;étape 2.3.9. Pour une utilisation ultérieure, magasin contenant le virus surnageant à -20 ° C en aliquotes de 10 ml. </li><li> Décongeler le virus de 2.3.7 à la température ambiante avant de l&#39;utiliser, si un stock congelé est utilisé. Remarque: évitez de multiples cycles de gel-dégel. </li><li> cellules C2C12 Plate-CUG200 (obtenus dans la section 2.1), comme décrit dans 2.2.9 le jour même de la transduction. Note: But pour 30 - 40% de confluence. </li><li> Ajouter 0,5 ml virus pour infecter une plaque de 60 mm de C2C12-CUG200 et retourner la plaque dans l&#39;incubateur. </li><li> Remplacer le milieu de culture avec du milieu frais supplémenté avec l&#39;antibiotique de sélection (puromycine: 1 - 3 pg / ml) 72 h après transduction.Actualiser les milieux de culture tous les jours avec l&#39;antibiotique de sélection pour ~ 5 jours jusqu&#39;à ce que toute la culture de contrôle C2C12-CUG200 non transduites meurt. </li><li> Utilisez Western blot pour vérifier knockdown Celf1 dans les cellules transfectées GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 Différenciation Cellulaire <ol><li> Plate 2 x 10 6 cellules dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits dans 2,5 ml de milieu de croissance 24 heures avant l&#39; initiation de la différenciation. Note: La densité de placage peut être ajustée de telle sorte que toute la confluence est atteinte en 24 h. <ol><li> Rincer les cellules confluentes avec du PBS et on ajoute 2,5 ml de milieu de différenciation à faible sérum (milieu modifié d&#39;Eagle supplémenté avec 2% de sérum équin, 100 U / ml de pénicilline de Dulbecco, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1 pM d&#39;insuline) . Remplacer le milieu tous les deux jours. Remarque: Conservez l&#39;insuline stocks congelés et l&#39;ajouter aux médias à chaque changement de milieu. </li></ol></li><li> Au cours de la différenciation C2C12, prélever des échantillons pour quantitatif RT-PCR (voir la section 4) aux points de temps suivants: Day0, 1, 2, 4 et 6. Procédé pour la culture immunocoloration au jour 6 - 8 (voir la section 5). </li></ol> 4. Isolement de l&#39;ARN et RT-PCR quantitative <ol><li> Utiliser le protocole du fabricant pour isoler l&#39;ARN. Après isolement, resuspendre le culot d&#39;ARN dans 30 l&#39;eau libre de RNase-ul et pipeter monter et descendre plusieurs fois. Note: Les échantillons peuvent procéder à RT-PCR quantitative ou peuvent être conservés à -80 ° C. </li><li> Utilisez un kit RT qPCR pour RT-PCR quantitative 10 et suivre les instructions du fabricant. Préparer le mélange réactionnel selon le Tableau 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume (ul) </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> 2 x tampon de réaction </td><td> dix </td><td> 1 fois </td&gt; </tr><tr><td> amorce sens </td><td> 0,5 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> amorce antisens </td><td> 0,5 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> 0,5 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Transcriptase inverse et RNase Inhibitor </td><td> 0,1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Modèle </td><td> 1 </td><td> 100 ng d&#39;ARN total </td></tr><tr><td> RNase eau libre </td><td> 7.4 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Mix total </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. RT-PCR quantitative Master Mix Préparation <ol start="3"><li> Exécuter un 20 pi réaction de RT-qPCR utilisant le profil thermique Tableau 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> étape de transcription inverse </td><td> 30 mn, 48 ° C </td></tr><tr><td> polymère d&#39;ADNactivation ase / transcriptase inverse inactivation </td><td> 10 mn, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 cycles </td><td> 15 s, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C, </td></tr></tbody></table> Tableau 2. RT-PCR quantitative profil thermique 5. immunocoloration <ol><li> Fixer la culture monocouche dans 2,5 ml fraîchement préparé paraformaldehyde à 4% / PBS à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Perméabiliser les échantillons dans 2,5 ml de 0,1% de Triton X-100 / PBS pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Transférer les échantillons à une chambre humidifiée. Bloquer les échantillons dans 2,5 ml de tampon de blocage (tensioactif non ionique 0,1% / PBS, 10% de sérum de chèvre normal) pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Jeter un tampon de blocage et d&#39;appliquer 800 anticorps primaire ul contre Chain myosine lourd dilué dans un tampon de blocage (1: 100). Incuber pendant une nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante. </li><li> Laver la plaque 3 times (10 min chacun) avec 2,5 ml de tampon de lavage (0,1% de polysorbate 20 / PBS) le jour 2. </li><li> Retirer le tampon de lavage et appliquer 800 pi d&#39;anticorps secondaire (chèvre anti-IgG de souris, 1: 500 dilué dans du PBS). Incuber dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Laver deux fois (10 min chacun) avec un tampon de 2,5 ml de lavage. </li><li> Laisser incuber avec 800 ul de DAPI (1 pg / ml, diluée dans distillée H 2 O déminéralisée) pendant 5 min. </li><li> Laver avec 2,5 ml de tampon de lavage à nouveau pendant 10 minutes. </li><li> Changer le tampon de lavage dans 2,5 ml de PBS et en utilisant un microscope à fluorescence pour capturer des images. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Lignée cellulaire C2C12 a été utilisé comme modèle pour étudier la myogenèse 11-14. Ces cellules conservent un aspect fibroblaste, prolifèrent rapidement dans les milieux contenant 20% de sérum fœtal bovin et facilement différencier dans un milieu contenant 2% de sérum équin 15. La croissance rapide et la différenciation sont des caractéristiques avantageuses dans un modèle cellulaire de la myogenèse. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation du plasmide, rétroviral et vecteurs lentiviraux pour introd...

La dystrophie myotonique (DM) est une maladie autosomique dominante qui affecte plusieurs systèmes, plus particulièrement les muscles cardiaques et squelettiques 1. Il existe deux sous-types de cette maladie, DM1 et DM2. DM1 est plus fréquente et a une manifestation plus sévère que DM2 2. La mutation génétique sous - jacente DM1 est une expansion de répétitions de triplets CUG situées dans la région 3 &#39;non traduite (UTR) du gène de la protéine kinase de DM (DMPK) 3. Le nombre de répétitions CUG dans les individus non affectés varie de 5 à 37. En revanche, elle augmente à plus de 50, et parfois jusqu&#39;à des milliers de patients DM1 4. En conséquence, les protéines liant l&#39;ARN, tels que muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP et Elav comme la famille 1 (Celf1), sont misregulated. En raison de la séquestration des répétitions CUG expansées, MBNL1 perd sa capacité à réguler 5 l&#39; épissage alternatif. Celf1, d&#39;autre part, est régulée à la hausse de 6,7. La surexpression de Celf1 est associée à la perte de muscleet la faiblesse, qui ne sont pas attribués à la perte de la fonction MBNL1. Les modèles animaux simulant des altérations DM1-connexes, y compris DMPK 3&#39;-UTR extension CUG, la perte de MBNL1, et la surexpression de Celf1, ont été établis. Cependant, la modélisation DM1 dans les myoblastes offre une alternative efficace, en particulier pour disséquer les événements cellulaires et moléculaires DM1 liées. C2C12 lignée cellulaire de myoblastes a été isolé à partir du muscle de souris C3H blessés et largement utilisé pour étudier la différenciation myogénique 8,9. les cellules C2C12 prolifèrent rapidement dans le sérum de fœtus bovin (FBS) contenant des médias et facilement subissent une différenciation lorsque FBS est épuisée. Pourtant, l&#39;utilisation de ce modèle de différenciation des myoblastes présente deux difficultés: Des cellules C2C12 sont souvent résistantes aux gènes de transfection / transduction virale; et de légères variations dans la manipulation des cellules et de la procédure de différenciation peut conduire à des changements marqués dans la formation de myotubes. Notre laboratoire utilise régulièrement myoblastes C2C12 comme acmodèle et ell a développé des protocoles qui fournissent efficacement des gènes par transfection plasmidique, la transduction rétrovirale et lentiviral transduction en C2C12 lignée cellulaire 10. Dans la vidéo, nous démontrons les procédures optimisées pour la transfection / transduction C2C12 cellules et le maintien de la cohérence de la différenciation dans l&#39;établissement de modèles de myoblastes DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, hyperglucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>pour milieu de culture</td></tr><tr><td>Insuline du pancréas bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>pour milieu de différenciation</td></tr><tr><td>sérum équin</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>pour milieu de différenciation</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp ; Réactif de transfection HD</td><td>Promega</td><td>E2311²�</td><td>pour la transfection</td></tr><tr><td>Sulfate de G418</td><td>Biotechnologie de l’or&nbsp ;</td><td>G-418-10</td><td>pour la sélection de la résistance aux médicaments</td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>pour la sélection de la résistance aux médicaments</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12 % Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 puits</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>pour western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Tampon de transfert (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>pour western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>pour western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Pris en charge 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td> GE <td>healthcare life science</td><td>10600015</td><td>pour western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>Anticorps primaire pour immunomarquage</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) de chèvre, Texas Red-X conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>Anticorps secondaires immunocoloration</td></tr><tr><td>Une étape qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>pour qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Réactif d’isolement</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>pour l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Anticorps (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primaire Ab western</td></tr><tr><td>blot Actine Anticorps</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>chèvre polyclonale IgG pour le contrôle de chargement</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Cellules 631507 Clontech</td><td></td><td>pour la préparation des rétrovirus</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Vecteur rétroviral vide</td><td>Clontech</td><td>634401</td> pour la préparation des rétrovirus</tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>house-built</td><td>non disponible</td><td>vecteur rétroviral codant pour Celf1Flag, utilisé dans la préparation des rétrovirus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>cadeau de Didier Trono</td><td>non disponible</td><td>pour la préparation des lentivirus</td></tr><tr><td>Le cadeau pMD2.G</td><td>de Didier Trono</td><td>n’est pas disponible</td><td>pour la préparation du lentivirus</td></tr><tr><td>Le cadeau GFP-CUG5</td><td>de M.S. Mahadevan n’est</td><td>pas disponible</td><td>détails dans la référence 10&nbsp ;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>cadeau de M.S. Mahadevan</td><td>non disponible</td><td>détails dans la référence 10&nbsp ;</td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>pour l’immunomarquage du</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>pour l’immunomarquage</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp ; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>pour l’immunomarquage</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>pour l’immunomarquage</td></tr></tbody></table>

modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules c2c12 myoblastes

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

La dystrophie myotonique 1 (DM1) est une forme courante de dystrophie musculaire. Bien que plusieurs modèles animaux ont été établis pour DM1, les modèles de cellules myoblastes sont encore importants, car ils offrent une alternative cellulaire efficace pour étudier les événements cellulaires et moléculaires. Bien que les cellules de myoblastes C2C12 ont été largement utilisés pour étudier la myogenèse, la résistance à la transfection de gènes, ou une transduction virale, empêche la recherche dans des cellules C2C12. Ici, nous décrivons un protocole optimisé comprenant des procédures d&#39;entretien quotidien, la transfection et de transduction pour introduire des gènes dans des myoblastes C2C12 et l&#39;induction de la différenciation des myocytes. Collectivement, ces procédés permettent de meilleurs rendements de transfection / transduction, ainsi que des résultats de la différenciation cohérente. Le protocole décrit dans l&#39;établissement de modèles de cellules myoblastes DM1 bénéficierait l&#39;étude de la dystrophie myotonique, ainsi que d&#39;autres maladies musculaires.

les cellules C2C12 ont été transfectées avec GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Après la sélection de résistance aux médicaments, les pools stables ont été établies, qui peut être visualisée par l&#39; expression de GFP (figure 1A). La formation de myotubes dans les myoblastes différenciés a été détectée par la myosine chaîne lourde immunocoloration 10 (figure 1B). La quantification de la formation de myotubes ont démontré que les indices de fusion ont é...

Dans ce protocole, nous présentons les procédures pour établir la dystrophie 1 modèles de myoblastes myotonique, y compris la maintenance optimisée C2C12 cellulaire, la transfection de gènes / transduction, et la différenciation des myocytes.

Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

L'objectif général de ces procédures de maintien, de transfection et de transduction des myoblastes est d'établir un modèle cellulaire de dystrophie myotonique de type 1 pour l'étude de cette maladie et d'autres affections musculaires. Cette méthode peut aider à établir des modèles cellulaires de myoblastes M1 qui s'avéreront utiles pour investiguer en détail les mécanismes de la pathogenèse de la dystrophie myotonique de type 1. Cette manipulation génétique en plusieurs étapes des myoblastes C2C12 permet de modéliser des événements pathologiques génétiques et séquentiels dans la dystrophie myotonique de type 1. Vingt-quatre heures avant leur transfection, ensemencez sept fois dix puissance cinq cellules C2C12 par puits dans une plaque de six puits.Le lendemain, ajouter deux microgrammes d'ADN plasmidique d'intérêt dans 200 microlitres de milieu sans sérum, à température ambiante, et vortexer brièvement la solution. Ensuite, ajouter six microlitres de réactif de transfection à température ambiante au milieu, puis vortexer immédiatement la solution pendant 30 secondes. Incuber ensuite le milieu à température ambiante pendant 30 minutes.Pendant les cinq dernières minutes de l'incubation, remplacer le milieu dans chaque puits par deux virgule cinq millilitres de milieu de croissance frais sans sérum et ajouter 200 micro litres de mélange de transfection dans chaque puits. Remettre la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.Ensuite, examiner les cellules au microscope pour détecter d'éventuels changements dans leur morphologie et leur adhérence. Si une cytotoxicité est observée, remplacer le milieu sans sérum par un milieu de croissance. 48 heures après la transfection, ajouter l'antibiotique de sélection approprié dans du milieu de croissance frais tous les deux jours pendant 10 jours.Jusqu'à ce que le puits témoin transfecté sans plasmide ne contienne aucune cellule vivante. Pour préparer le rétrovirus, commencez par ensemencer quatre fois dix puissance six cellules HEK293 encapsidantes de tropisme écotrope dans une plaque de 100 millimètres contenant du milieu de culture cellulaire. Le jour suivant, mélangez 15 microgrammes d'ADN plasmidique d'intérêt dans un millilitre de milieu de croissance sans sérum, puis vortexez brièvement le tube.Ensuite, ajoutez 30 micro litres de réactif de transfection à température ambiante dans le milieu, puis vortexez immédiatement la solution pendant 30 secondes. Après 30 minutes à température ambiante, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte aux cellules écotropes, puis agitez doucement la plaque. Replacez la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures, puis remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu de croissance frais à 37 degrés Celsius le lendemain.48 heures après la transfection, utilisez une pipette pour transférer les surnageants contenant le rétrovirus dans un seul tube conique de 50 millilitres, puis stockez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite 10 millilitres de nouveau milieu chaud le long du bord de la plaque et remettez la culture dans l’incubateur. Récoltez le deuxième lot de rétrovirus 60 heures après la transfection.Combiner ce volume avec le rétrovirus recueilli à 48 heures. Centrifuger le surnageant afin d'éliminer tous les débris cellulaires, puis transférer le rétrovirus dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver maintenant chaque puits d'une culture cellulaire C2C12 avec trois millilitres de PPS à température ambiante, suivi de l'ajout de 500 microlitres de trypsine EDTA à zéro virgule vingt-cinq pour cent pendant une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius.Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la réaction dans chaque puits avec trois millilitres de milieu de croissance et triturez le milieu six à huit fois afin de dissocier les cellules en une suspension monocellulaire. Après le comptage, ajoutez huit fois 10 à la puissance cinq cellules dans une plaque de 60 millilitres, puis ajoutez trois millilitres de milieu de croissance. Ensuite, infectez les cellules avec zéro virgule cinq millilitre de rétrovirus et replacez la plaque dans l’incubateur pendant 48 heures.Après deux jours, nourrissez les cellules avec trois millilitres de milieu de croissance frais, supplémenté quotidiennement avec l'antibiotique de sélection approprié pendant cinq jours, jusqu'à ce que la culture témoin C2C12 non transduite ne contienne plus aucune cellule vivante. Pour la transduction lentivirale des cellules C2C12, dans une cabine de sécurité biologique de niveau deux, mettez en culture quatre fois 10 à la puissance six cellules 293T dans une plaque de 100 millimètres avec du milieu de culture pour cellules HEK293.Le lendemain, mélanger les vecteurs d’emballage lentiviraux avec huit microgrammes du vecteur de transfert lentiviral approprié, dans un millilitre de milieu de culture cellulaire sans sérum. Vortexer brièvement le mélange et ajouter 36 microlitres de réactif de transfection préalablement réchauffé. Puis vortexer le milieu pendant encore 30 secondes, et incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes.À la fin de l'incubation, ajouter une quantité égale du mélange de transfection aux cellules 293T, agiter doucement la plaque et replacer les cellules dans l'incubateur. Après 24 heures, remplacer le mélange de transfection par 10 millilitres de milieu de culture frais. Après 48 heures, transférer le surnageant contenant le lentivirus dans un tube conique de 50 millilitres pour le stocker à quatre degrés Celsius, puis ajouter 10 millilitres de milieu frais et chaud à la plaque.Après 60 heures, rassemblez le deuxième lot de surnageant avec le lentivirus collecté à 48 heures, puis centrifugez le virus afin d'éliminer tous les débris cellulaires. Ajoutez ensuite 0,5 mL de lentivirus à une culture de cellules C2C12 CUG200 en confluence de 30 à 40 %, placées dans une plaque de 60 mm, comme vient d'être démontré. Soixante-douze heures après la transfection, remplacez le surnageant de lentivirus par du milieu frais supplémenté avec l'antibiotique de sélection approprié.Renouveler le milieu de culture chaque jour pendant cinq jours avec un milieu frais supplémenté en antibiotique de sélection, jusqu'à ce que toutes les cellules contrôles C2C12 CUG200 non transduites soient mortes. Après la sélection par résistance au médicament, l'expression de la GFP et la formation des myotubes par les myoblastes différenciés peuvent être évaluées par une analyse de fluorescence. La quantification de la formation des myotubes dans cette expérience représentative démontre que les indices de fusion et les surfaces des myotubes sont significativement réduits par l'expansion anormale des CUG et dans les cellules transfectées avec GFP CUG 200.La surexpression de Celf1 est également associée à l'expansion des répétitions CUG dans la dystrophie myotonique de type un. De plus, le transfert de type western montre systématiquement une élévation des niveaux protéiques de Celf1 accompagnée d'une inhibition de l'expression de MyoD, MyoG et Mef2C au cours de la différenciation. Ces résultats suggèrent que l'expansion CUG induit des anomalies des myotubes et une altération de la différenciation des myoblastes.L'analyse par immunoblotting révèle également que la protéine Celf1 marquée par la balise FLAG est présente uniquement dans les cultures transduites par le vecteur rétroviral, et que son expression est augmentée dans ces cultures. En effet, la formation de myotubes est rare dans les cellules surexprimant Celf1 par rapport aux cultures témoins, ce qui suggère que la surexpression de Celf1 altère gravement la différenciation des myoblastes.Par ailleurs, le niveau de la protéine Celf1 endogène et des cellules GFP CUG 200 transduites par un vecteur lentiviral sélectionné par double antibiotique est nettement réduit en présence d'un ARN court cheveu ciblant Celf1. Une récupération de la formation des myotubes, des indices de fusion des myotubes et des surfaces des myotubes est observée dans ces cultures. Parallèlement, les résultats de RT-PCR en temps réel indiquent que l'expression de MyoD, MyoG et Mef2C est significativement augmentée dans les cellules exprimant l'ARN court cheveu ciblant Celf1, ce qui soutient l'hypothèse d'une correction du déficit de différenciation des myocytes suite à l'extinction partielle de Celf1 dans ces cultures.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller la densité des cellules C2C12 afin qu'elle reste inférieure à 70 pour cent de confluence. Après la transfection des cellules, traitez-les avec un milieu sans sérum pendant au moins quatre heures, mais pas plus de 12 heures. Pendant la surveillance de la cytotoxicité cellulaire.Grâce à l'utilisation de la transfection par plasmide, de la transduction rétrovirale et lentivirale, nous avons établi avec succès un modèle cellulaire de dystrophie myotonique qui bénéficiera à la recherche sur cette maladie et d'autres affections musculaires.

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